一種化學(xué)降解法獲得及檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化學(xué)降解法獲得及檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法包括如下步驟：(1)將生物來源糖胺聚糖脫乙?；?，得脫乙酰糖胺聚糖；(2)將脫乙酰糖胺聚糖用亞硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；(3)將糖胺聚糖二糖用衍生試劑衍生；(4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生后的二糖。本發(fā)明化學(xué)降解法可將生物來源糖胺聚糖完全降解為二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能夠準(zhǔn)確并且完全地得到二糖的結(jié)構(gòu)信息；降解條件溫和，成本低，操作簡單，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求低，適用范圍廣，檢測耗時(shí)短，樣品消耗量小，靈敏度高，分析結(jié)果重復(fù)性好。
【專利說明】一種化學(xué)降解法獲得及檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化學(xué)降解法獲得及檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖胺聚糖是一類由含氨基己糖重復(fù)二糖單元(氨基己糖和己糖糖醛組成的線性高分子多糖。其中透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素的重復(fù)二糖單元為氨基己糖和糖醛酸。硫酸角質(zhì)素較為特殊，其重復(fù)二糖單元為氨基葡萄糖和半乳糖。糖胺聚糖以蛋白聚糖的形式存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)，并亦是所有細(xì)胞的胞外基質(zhì)的主要組成成分。糖胺聚糖在胞外形成了細(xì)胞外的親水環(huán)境，在細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)的糖胺聚糖是許多細(xì)胞生長因子及細(xì)胞與病毒的受體，它介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的動(dòng)物細(xì)胞都合成糖胺聚糖。細(xì)胞是生命的基本單元，細(xì)胞中合成與降解糖胺聚糖很容易受到環(huán)境影響，于是檢測細(xì)胞中糖胺聚糖在生物環(huán)境變化下的改變就變得尤為重要。如腫瘤組織和正常組織的硫酸乙酰肝素的組成及含量不同。在藥物對(duì)細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)中，常常會(huì)發(fā)現(xiàn)加藥組細(xì)胞中的硫酸乙酰肝素結(jié)構(gòu)及含量與正常細(xì)胞中的硫酸乙酰肝素不同。常用的分析糖胺聚糖二糖組成的方法為酶解二糖分析法，既將糖胺聚糖用肝素酶1、肝素酶I1、肝素酶II1、硫酸軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、硫酸角質(zhì)素酶等逐一降解，得到二糖，再用離子交換柱分離并比對(duì)二糖標(biāo)準(zhǔn)品，從而確定二糖組成及含量。但是傳統(tǒng)方法中所用到的每種酶所需要的降解條件不同，酶、二糖標(biāo)準(zhǔn)品、離子交換柱等價(jià)格昂貴、酶的活性容易受到樣品中的雜質(zhì)抑制，使得方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性不高，操作步驟復(fù)雜，因此至今還沒有用酶進(jìn)行糖胺聚糖混合物二糖組成與結(jié)構(gòu)鑒定的分析報(bào)道。除此之外，由于糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)類似性，將每一種糖胺聚糖，如來源于豬、羊、牛、鼠、斑馬魚等的組織(心、肝、脾、肺、腎、骨骼等)及細(xì)胞中的糖胺聚糖的提取純化相當(dāng)困難，并且有一些生物，如于小鼠、斑馬魚等細(xì)胞中的糖胺聚糖含量非常少，這使將每一種糖胺聚糖提取純化并進(jìn)行二糖組成分析幾乎成為不可能因此，新的糖胺聚糖二糖組成測定方法對(duì)推進(jìn)其研究、開發(fā)與應(yīng)用至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)以上存在的不足，本發(fā)明提供一種全面、高效、簡單、穩(wěn)定且成本低的同時(shí)化學(xué)降解生物來源的全部糖胺聚糖的方法，本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測所有降解所得糖胺聚糖二糖的方法。
[0005]實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，包括如下步驟:
[0007](I)將生物來源糖胺聚糖脫乙?；?，得脫乙酰糖胺聚糖；
[0008](2)將脫乙酰糖胺聚糖用亞硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；
[0009](3)將糖胺聚糖二糖用衍生試劑衍生[0010]取步驟(2)所得糖胺聚糖二糖濃縮至干并完全溶解于水，然后調(diào)節(jié)pH值至堿性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應(yīng)完成后用氯仿萃取三次去除未反應(yīng)的衍生試劑；
[0011](4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生后
的二糖。
[0012]2.一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，步驟(1)所述的脫乙?；磻?yīng)步驟包括:
[0013]將生物來源糖胺聚糖溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到91-114?，反應(yīng)4-20h，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰糖胺聚糖。
[0014]3.一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟包括:
[0015]將脫乙酰糖胺聚糖濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0_5°C條件下反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0_5°C條件下反應(yīng)，加入氨水終止反應(yīng)，得糖胺聚糖二糖。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0017](I)本發(fā)明方法可將生物來源糖胺聚糖完全降解為二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能夠準(zhǔn)確并且完全地得到糖胺聚糖二糖的結(jié)構(gòu)信息。
[0018](2)化學(xué)降解條件溫和，成本低，操作簡單，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求低。
[0019](3)適用范圍廣，適合所有生`物來源的糖胺聚糖。
[0020](4)檢測耗時(shí)短，可以同時(shí)對(duì)多種樣品進(jìn)行定性定量檢測。
[0021](5)樣品消耗量小，靈敏度高，分析結(jié)果重復(fù)性好，檢測限為ng級(jí)別。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1豬肺來源糖胺聚糖化學(xué)降解所得二糖D3PMP衍生LC圖譜。
[0023]圖2細(xì)胞來源糖胺聚糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生總離子流圖(A)和質(zhì)譜圖⑶。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)例I豬腸黏膜來源糖胺聚糖化學(xué)降解
[0025](I)將Img本實(shí)驗(yàn)室從豬腸黏膜中提取的糖胺聚糖溶于500uL含有10% N2H4 -H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到98°C，反應(yīng)8小時(shí)，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰糖胺聚糖；
[0026](2)將步驟(1)所得脫乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在4°C條件下反應(yīng)10min后調(diào)節(jié)pH到4.0，加入50uL pH為4.0的亞硝酸，在4°C條件下反應(yīng)10min,加入30uL氨水終止反應(yīng)。
[0027]實(shí)例2豬腸黏膜來源糖胺聚糖化學(xué)降解
[0028](I)將Img本實(shí)驗(yàn)室從豬腸黏膜中提取的糖胺聚糖溶于ImL含有10% N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到114°C，反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰糖胺聚糖；
[0029](2)將步驟(1)所得脫乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在4°C條件下反應(yīng)10min后調(diào)節(jié)pH到4.0，加入50uL pH為4.0的亞硝酸，在4°C條件下反應(yīng)10min,加入30uL氨水終止反應(yīng)。
[0030]實(shí)例3豬腸黏膜來源糖胺聚糖化學(xué)降解
[0031](I)將Img本實(shí)驗(yàn)室從豬腸黏膜中提取的糖胺聚糖溶于ImL含有10% N2H4-H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到91°C，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰糖胺聚糖；
[0032](2)將步驟(1)所得脫乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uLpH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在4°C條件下反應(yīng)10min后調(diào)節(jié)pH到4.0，加入50uL pH為4.0的亞硝酸，在4°C條件下反應(yīng)10min,加入30uL氨水終止反應(yīng)。
[0033]計(jì)算實(shí)施例1-3糖胺聚糖二糖得率，結(jié)果見表1。
[0034]表1施例1-3糖胺聚糖二糖得率
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將生物來源糖胺聚糖脫乙?；妹撘阴Ｌ前肪厶?； (2)將脫乙酰糖胺聚糖用亞硝酸降解，得糖胺聚糖二糖； (3)將糖胺聚糖二糖用衍生試劑衍生 取步驟(2)所得糖胺聚糖二糖濃縮至干并完全溶解于水，然后調(diào)節(jié)pH值至堿性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應(yīng)完成后用氯仿萃取三次去除未反應(yīng)的衍生試劑； (4)用液相色譜(LC)法或液相質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生后的二糖。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(1)所述的脫乙?；磻?yīng)步驟包括: 將生物來源糖胺聚糖溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到91-114?，反應(yīng)4-20h，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰糖胺聚糖。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(1)所述的脫乙酰化反應(yīng)步驟包括: 將生物來源糖胺聚糖溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到98°C，反應(yīng)8h，反應(yīng)完成后，凍干，除去N2H4得脫乙酰糖胺聚糖。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟包括: 將脫乙酰糖胺聚糖濃縮至干，溶于水中，加入PH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應(yīng)，調(diào)節(jié)PH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0-5°C條件下反應(yīng)，加入氨水終止反應(yīng)，得糖胺聚糖二糖。
5.如權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(1)所述的脫乙酰反應(yīng)步驟中生物來源糖胺聚糖與N2H4.H2O溶液的質(zhì)量體積比(mg / mL)為 1: 0.5-1, N2H4.H2O 溶液中含 10% N2H4.H2SO4。
6.如權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟中脫乙酰糖胺聚糖水溶液與亞硝酸鈉水溶液、亞硝酸、氨水的體積比為1:1:1: 0.6。
7.如權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(3)所述的糖胺聚糖二糖與吡唑啉酮類衍生試劑的質(zhì)量比為1: 6-60。
8.如權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(3)所述的吡唑啉酮類衍生試劑包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基_3_甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)或1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)。
9.如權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的一種檢測生物來源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步驟(3)所述的吡唑啉酮類衍生試劑包括？1^、03?1^、05?10\08?1^中的一種或任意幾種聯(lián)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103698425SQ201310695163
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】張麗娟, 韓章潤, 曾洋洋, 蘭瑩, 邱培菊 申請人:中國海洋大學(xué)