一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的膠體金試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體提供了一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的膠體金試紙條，所述膠體金試劑條包含：1）包被犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體和二抗IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜；2）含有膠體金標(biāo)記犬細(xì)小病毒抗原的單克隆抗體的玻璃纖維膜。本發(fā)明膠體金試紙條采用雙抗體夾心方法及免疫層析技術(shù)檢測(cè)犬細(xì)小病毒抗原，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、不需要復(fù)雜的設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足臨床檢驗(yàn)的要求。
【專利說明】一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的膠體金試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的膠體金試紙條及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膠體金免疫層析技術(shù)(GoldImmunochromatographic assay, GI CA)是一種基于抗原和抗體特異性反應(yīng)的標(biāo)記診斷技術(shù)，1971年Faulk把膠體金引入免疫化學(xué)，從而誕生了免疫膠體金技術(shù)。20世紀(jì)80年代又興起了以NC膜為固相載體的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)是在McAb、ELISA等技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速而簡(jiǎn)單的新型診斷技術(shù)。劉煜凱等1995年將免疫層析法作早孕快速診斷測(cè)定，隨后出現(xiàn)了人早孕試紙條的廣泛應(yīng)用。郝桂蘭等利用免疫膠體金試驗(yàn)，采取病死鴿棉拭子樣品30min內(nèi)即完成對(duì)一發(fā)病鴿群的快速鑒別診斷。王長(zhǎng)美等用免疫膠體金試驗(yàn)診斷出患禽I型副黏病毒病的鵝群。徐葛林等制備了適于野外對(duì)動(dòng)物腦或唾液中的狂犬病病毒抗原檢測(cè)的診斷試紙條。鄭鳴等運(yùn)用雙抗原夾心法于國(guó)內(nèi)首先建立了豬瘟病毒抗體檢測(cè)免疫層析試紙條。劉春龍等建立了檢測(cè)牛初乳中免疫球蛋白(IgG)含量的免疫膠體金法。李恪梅等用布魯菌純蛋白衍化物作為該檢測(cè)板的包被抗原，建立了用間接法檢測(cè)人和不同動(dòng)物血液樣品中的抗布魯菌抗體的新方法。
[0003]膠體金(Colloidal gold)是氯金酸(HAuC14)的水溶膠,氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在堿性條件下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)借靜電吸引而形成牢固結(jié)合。
[0004]GICA的原理是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，以微孔膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測(cè)樣后，經(jīng)微孔膜的滲濾作用或毛細(xì)管虹吸作用使樣本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記物與之反應(yīng)形成紅色的可見結(jié)果。最常用的是雙抗夾心法檢測(cè)抗原。
[0005]測(cè)定時(shí)將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動(dòng)，流經(jīng)C處時(shí)使干片上的膠體金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動(dòng)其向膜條滲移。標(biāo)本中待測(cè)特異抗原，可與膠體金復(fù)合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測(cè)試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條(T)。過剩的膠體金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合(膠體金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG)，而顯出紅色質(zhì)控線條(R)。陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條
[0006]目前，最常應(yīng)用的檢測(cè)犬細(xì)小病毒(CPV)的方法是血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)及ELISA方法。其中HA試驗(yàn)最為經(jīng)濟(jì)，但是也存在缺點(diǎn)，一方面獲取造價(jià)昂貴新鮮的紅細(xì)胞比較困難，另一方面，該方法只適用于CPV感染后期樣本檢測(cè)，不適應(yīng)近年來早期、快速檢測(cè)的要求。ELISA方法則應(yīng)用較多，但操作要求較高，并且還需要酶標(biāo)儀判定結(jié)果，因此不適于基層使用。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種適用于CPV感染早期的檢測(cè)試劑條，利用該試劑條檢測(cè)犬細(xì)小病毒，方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、成本低。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的膠體金試紙條，所述膠體金試劑條包含:
[0009]I)包被犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體和二抗IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜；
[0010]2)含有膠體金標(biāo)記犬細(xì)小病毒抗原的單克隆抗體的玻璃纖維膜。
[0011]其中，所述的二抗IgG為羊抗鼠IgG抗體。
[0012]進(jìn)一步地，所述硝酸纖維膜中犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL，所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為lmg/mL。
[0013]作為優(yōu)選，所述玻璃纖維膜中膠體金標(biāo)記的犬細(xì)小病毒抗原的單克隆抗體的標(biāo)記PH值為8.5，單克隆抗體與膠體金結(jié)合濃度為40 μ g/mL。
[0014]作為優(yōu)選，所述膠體金顆粒平均直徑為25nm。
[0015]進(jìn)一步地，所述膠體金試紙條能檢出犬細(xì)小病毒最低HA效價(jià)為1:80。
[0016]前述膠體金試紙條，還包括底板、樣品墊和吸水紙，所述底板上黏貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜上方粘貼吸水紙，硝酸纖維膜下方依次相互搭接粘貼玻璃纖維膜和樣品墊。
[0017]本發(fā)明還提供了一種制備前述膠體金試紙條的方法，包括如下步驟:
[0018]I)制備犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體；
[0019]2)硝酸纖維膜的制備:將犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成lmg/mL ;將硝酸纖維膜貼于底板后，用三維劃膜儀在硝酸纖維膜上劃上上述犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體與羊抗鼠IgG抗體，分別形成檢測(cè)線和質(zhì)控線，室溫包被過夜，備用；
[0020]3)玻璃纖維膜的制備:將膠體金調(diào)整抗體pH值為8.5，單克隆抗體與膠體金結(jié)合濃度為40μ g/mL，經(jīng)穩(wěn)定劑處理后，將標(biāo)記好單抗的膠體金溶液均勻涂布到已經(jīng)處理好的玻璃纖維素膜上，冷凍干燥，備用；
[0021]4)最后在步驟2)制得的硝酸纖維膜的上方粘貼吸水紙，在硝酸纖維膜的下方依次相互搭接粘貼玻璃纖維膜和樣品墊。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述膠體金試紙條在檢測(cè)犬細(xì)小病毒中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的有益效果在于:
[0024]本發(fā)明膠體金試紙條采用雙抗體夾心方法及免疫層析技術(shù)檢測(cè)犬細(xì)小病毒抗原，與其他檢測(cè)技術(shù)相比，其檢測(cè)樣品不需要特殊處理，試劑和樣本用量極小，樣本量可低至I μ L?2 μ L ;既可用于抗原檢測(cè)，也可用于抗體檢測(cè)。并且能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間，不需使用熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，就可以定性的檢測(cè)犬細(xì)小病毒抗原，檢測(cè)結(jié)果清楚易于判斷，試驗(yàn)結(jié)果可長(zhǎng)期保存。因此本發(fā)明膠體金試紙條具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、不需要復(fù)雜的設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足臨床檢驗(yàn)的要求，也非常適合野外現(xiàn)場(chǎng)、門診、家庭個(gè)人以及實(shí)驗(yàn)條件不具備的場(chǎng)所等臨床樣品檢測(cè)使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中抗CPV兔多抗純化結(jié)果；其中:1為高分子量蛋白預(yù)染Marker，2為上樣液，3為純化多抗。[0026]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中抗CPV單抗純化結(jié)果；其中:1為高分子量蛋白預(yù)染Marker, 2為上樣液,3為純化單抗。
[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例中制備的膠體金溶液。
[0028]圖4為本發(fā)明實(shí)施例中制備的膠體金溶液的酶標(biāo)儀掃描結(jié)果。
[0029]圖5為本發(fā)明實(shí)施例中單抗與膠體金在不同pH值下的結(jié)合；從左至右為別為:對(duì)照組，ρΗ7，ρΗ8，ρΗ8.5。
[0030]圖6為本發(fā)明實(shí)施例中單抗與膠體金在不同濃度下的結(jié)合。
[0031]圖7為本發(fā)明試紙條組裝模式圖；其中I為吸水紙，2為硝酸纖維素膜，3為玻璃纖維膜，4為樣品墊，5為底板。
[0032]圖8為本發(fā)明試紙條檢測(cè)結(jié)果；從左至右分別為:CPV細(xì)胞培養(yǎng)上清、DMEM、PBST?！揪唧w實(shí)施方式】
[0033]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0034]實(shí)施例
[0035]犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus, CPV)可引起犬細(xì)小病毒病，是犬的一種高度接觸性的烈性傳染病，臨床癥狀以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征，是當(dāng)前危害我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一。在犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱、犬冠狀病毒病三種犬病毒性疾病中，以犬細(xì)小病毒病最為嚴(yán)重，感染率可達(dá)到100%，死亡率達(dá)到10%?50%。CPV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，線狀負(fù)鏈單股DNA病毒，基因組長(zhǎng)5323bp。
[0036]1.多克隆抗體的制備及純化
[0037]病毒培養(yǎng):在50mL細(xì)胞瓶中培養(yǎng)F81細(xì)胞，待培養(yǎng)4?5代后，選擇生長(zhǎng)形狀良好且鋪滿瓶底80%的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)上清，加入9.5mL含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同步加入CPV500 μ L0 C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4?5d，當(dāng)細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀時(shí)，將細(xì)胞瓶置冰柜中反復(fù)凍融3次收毒，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0038]CPV病毒純化:CPV上清加入PEG20000和NaCl，然后離心留沉淀。PBS重懸后透析，用蔗糖濃縮，分裝后保存?zhèn)溆谩?br> [0039]抗體制備與純化:新西蘭大白兔按照500 μ L/只/次免疫，共免疫3次，三免后間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，測(cè)得其效價(jià)在1:20000時(shí)，兔心臟采血，離心收集上清。經(jīng)AKTApurifier層析儀純化抗體，上樣液和純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，純化
前雜蛋白較多，純化后目的蛋白純度較高，在50kDa和25kDa出現(xiàn)目的條帶。
[0040]2.CPV單抗的制備及純化
[0041]細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇細(xì)胞，放置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)傳代，倒掉培養(yǎng)上清，完全培養(yǎng)基將單抗細(xì)胞輕輕吹下，吸出一半細(xì)胞液轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞瓶中，補(bǔ)充兩瓶中培養(yǎng)基到IOmL繼續(xù)培養(yǎng)。
[0042]小鼠腹水制備:
[0043]I) Balb/c經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔注射0.5mL/只滅菌石蠟；
[0044]2)懸浮處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，1000r/min離心3min,棄上清,用不完全培
養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀；
[0045]3)取50 μ L細(xì)胞懸液，加入50 μ L0.5%臺(tái)盼蘭染液混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。[0046]4)調(diào)整細(xì)胞密度至2-3 X IO6個(gè)/mL，每只小鼠腹腔注射I X IO6個(gè)細(xì)胞；
[0047]5) 7?IOd后，小鼠腹部明顯膨大時(shí)，16號(hào)針頭刺入腹腔采集腹水；
[0048]6)將腹水2000r/min離心IOmin,收集上清,低溫保存；
[0049]7) CPVl: 320包被酶標(biāo)板，單抗從1:100開始作10倍稀釋，測(cè)定單抗腹水的效價(jià)。
[0050]抗體的純化并鑒定:經(jīng)AKTApurifier層析儀純化抗體，上樣液和純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，純化前雜蛋白較多，純化后目的蛋白純度較高，在50kDa和25kDa出現(xiàn)目的條帶。
[0051]3.制備膠體金
[0052]250mL錐形瓶中加入99mL純水和lmLl%氯金酸加熱，沸騰后快速加入1.5mLl%檸檬酸三鈉水溶液，同時(shí)不停攪拌，觀察錐形瓶中的溶液顏色變化，3min內(nèi)由淺黃色至灰色至紫黑色，最后變成紫紅色。再加熱攪拌15min，冷卻后加純水恢復(fù)至原體積，即為膠體金溶液。
[0053]還原法制備膠體金溶液，膠體金溶液呈酒紅色，色澤鮮艷、透亮，無雜質(zhì)，迎著日光可以看到光帶出現(xiàn)。取兩孔酶標(biāo)板，每孔加入膠體金200 μ L,酶標(biāo)儀400-600nm全波長(zhǎng)掃描，間隔為2nm。結(jié)果分析，制備的膠體金曲線坡度平緩，吸收峰寬度小，顆粒均勻；最大吸收峰在波長(zhǎng)522nm處，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的金納米微粒粒徑、形狀與紫外-可見吸收譜之間的關(guān)系，表明膠體金顆粒平均直徑在25nm左右。
[0054]4.單抗與膠體金結(jié)合最佳pH值確定
[0055]取3個(gè)1.5mL EP管,分別加入已制備的ImL膠體金,用0.01mol/L K2C03將膠體金的PH分別調(diào)成7、8、9。取50 μ Llmg/mL單抗IgG加入已調(diào)好pH的膠體金溶液中，震蕩20min后，室溫靜止lOmin。每管加入200 μ L10%NaCl溶液，震蕩混合IOmin后，室溫靜止30min。觀察膠體金顏色變化，膠體金保持紅色的最低pH值8.5確定為最佳值。
[0056]5.單抗與膠體金結(jié)合最佳濃度確定
[0057]取10個(gè)1.5mL離心管,分別加入ImL膠體金,0.0lM碳酸鉀350 μ L調(diào)最佳ρΗ8.5,取出調(diào)好pH值的膠體金ImL到新的1.5mL離心管中；各管依次加入lmg/mL單抗OyL,5 μ L, 10 μ L, 15 μ L, 20 μ L，25 μ L, 30 μ L，35 μ L, 40 μ L，45 μ L,使其濃度達(dá)到每毫升中含有抗體 O μ g, 5 μ g, 10 μ g, 15 μ g, 20 μ g, 25 μ g, 30 μ g, 35 μ g, 40 μ g, 45 μ g,震蕩混合 20min后室溫下放直IOmin ;然后每管加入200 u LlO % NaCl，震湯混合IOmin后室溫下放直IOmin0膠體金溶液在580nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，曲線最先與橫軸相接近的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度為35 μ g/mL,確定濃度為最小濃度的120%-130%，所以最佳為 40 μ g/mL。
[0058]6.金標(biāo)單抗的制備及純化
[0059]取膠體金ImL于1.5mL離心管中，2000r/min4°C離心20min，吸取上清，棄沉淀。用
0.0lM碳酸鉀調(diào)節(jié)最佳pH值；取ImL調(diào)好pH值的膠體金到新5mLl.5mL離心管中，緩慢加入適量lmg/mL單抗，震蕩20min，靜置IOmin ;加入穩(wěn)定劑10%BSA溶液100 μ L，使終濃度為1%，震蕩15min，靜置lOmin。采用差速離心法純化膠體金探針:將上面初步制得的膠體金探針4000r/min,離心20min,收集上清液；上清液12000r/min, 4°C離心45min,棄上清，管底為暗紅色疏松狀沉淀；將沉淀用200 μ L膠體金洗液(1%BSA, 0.02% NaN3, 2mM Tris緩沖液；pH8.2)重懸，并收集到一個(gè)離心管中，共ImL ;12000r/min，4°C離心45min，棄上清；再重復(fù)離心洗滌I次，共洗滌兩次；沉淀用600 μ L重懸緩沖液(1%BSA，1%蔗糖，0.02%NaN3,
0.3%Tween-20,20mM Tris緩沖液；pH8.2)重懸，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0060]7.試紙條的制備
[0061]將標(biāo)記好單抗的膠體金溶液均勻涂布到已經(jīng)處理好的玻璃纖維素膜上噴金；37°C過夜干燥。向三維劃膜儀的樣品池I和樣品3中分別加入lmg/mL純化的兔多抗、lmg/mL羊抗鼠IgG抗體，將NC膜貼于底板后，用三維劃膜儀在NC膜上劃?rùn)z測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)，室溫包被過夜；在底板NC膜的上方粘帖吸水紙，在NC膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，如圖所示。用斬條機(jī)將試紙板切成0.4cm寬的試紙條。
[0062]8.試紙條檢測(cè) [0063]分別吸取CPV細(xì)胞培養(yǎng)上清、DMEM、PBST各ImL加入7mL離心管中；組裝好的試紙條分別放入三個(gè)離心管中，2min后取出，放入平皿中觀察，持續(xù)20min ;質(zhì)控線不顯色，試紙條無效；質(zhì)控線紅色，檢測(cè)線不顯色為陰性，即無犬細(xì)小病毒檢出。質(zhì)控線和檢測(cè)線都呈紅色為陽(yáng)性，即有犬細(xì)小病毒檢出。
[0064]將CPV抗原倍比稀釋后檢測(cè)，確定試紙條靈敏度。試紙條檢測(cè)狂犬病毒(RV)和犬瘟熱病毒(CDV)，確定其特異性。用美國(guó)CPV抗原測(cè)定ELISA試劑盒和試紙條同時(shí)檢測(cè)80份CPV糞便樣品，計(jì)算兩者符合率,TP (true positive,真陽(yáng)性),TN (true negative,真陰性)，F(xiàn)N (false negative,假陰性),FP (false positive,假陽(yáng)性),符合率(％) = (TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)X100。
[0065]將已知犬細(xì)小病毒HA效價(jià)為1:5120的抗原倍比稀釋，用試紙條測(cè)定，結(jié)果如表I所示，能檢出CPV最低HA效價(jià)為1:80。試紙條檢測(cè)狂犬病毒(RV)和犬瘟熱病毒(⑶V)，均為陰性結(jié)果，表明試紙條特異性良好。用商品化ELISA試劑盒和試紙條同時(shí)檢測(cè)80份CPV糞便樣品，計(jì)算兩者符合率，TP (true positive,真陽(yáng)性)，TN (true negative,真陰性)，F(xiàn)N (false negative,假陰性)，F(xiàn)P (false positive,假陽(yáng)性),符合率(％) = (TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) X 100，兩者符合率92.5%,如表2所示。
[0066]表1試紙條靈敏性的測(cè)定
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒的膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金試劑條包含: 1)包被犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體和二抗IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜(2)； 2)含有膠體金標(biāo)記犬細(xì)小病毒抗原的單克隆抗體的玻璃纖維膜(3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述的二抗IgG為羊抗鼠IgG抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述硝酸纖維膜中犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL,所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為lmg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述玻璃纖維膜中膠體金標(biāo)記的犬細(xì)小病毒抗原的單克隆抗體的標(biāo)記pH值為8.5，單克隆抗體與膠體金結(jié)合濃度為40 μ g/mL0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金顆粒平均直徑為25nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金試紙條能檢出犬細(xì)小病毒最低HA效價(jià)為1:80。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的膠體金試紙條，其特征在于，還包括底板(5)、樣品墊(4)和吸水紙(1)，所述底板(5)上黏貼硝酸纖維膜(2)，硝酸纖維膜(2)上方粘貼吸水紙(I )，硝酸纖維膜(2)下方依次相互搭接粘貼玻璃纖維膜(3)和樣品墊(4)。
8.一種制備權(quán)利要求7所述膠體金試紙條的方法，包括如下步驟: 1)制備犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體； 2)硝酸纖維膜的制備:將犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成lmg/mL ;將硝酸纖維膜貼于底板后，用三維劃膜儀在硝酸纖維膜上劃上上述犬細(xì)小病毒抗原的多克隆抗體與羊抗鼠IgG抗體，分別形成檢測(cè)線和質(zhì)控線，室溫包被過夜，備用; 3)玻璃纖維膜的制備:將膠體金調(diào)整抗體PH值為8.5，單克隆抗體與膠體金結(jié)合濃度為40 μ g/mL，經(jīng)穩(wěn)定劑處理后，將標(biāo)記好單抗的膠體金溶液均勻涂布到已經(jīng)處理好的玻璃纖維素膜上，冷凍干燥，備用； 4)最后在步驟2)制得的硝酸纖維膜(2)的上方粘貼吸水紙(1)，在硝酸纖維膜(2)的下方依次相互搭接粘貼玻璃纖維膜(3)和樣品墊(4)。
9.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述膠體金試紙條在檢測(cè)犬細(xì)小病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103743901SQ201310705249
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】王凈, 史利軍, 李剛, 王鵬 申請(qǐng)人:河北北方學(xué)院