一種酸性氧化鋁柱分離提純桔霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)前處理，旨在提供一種酸性氧化鋁柱分離提純桔霉素的方法。該方法包括：選用酸性氧化鋁為提純柱的柱填料，使用干法上柱；用甲醇預(yù)淋洗柱，然后上樣，樣品過柱后，先用pH2.5的60%甲醇洗脫雜質(zhì)，再用pH2.1的80%甲醇洗脫桔霉素，收集洗脫液，水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，得到提純自樣品的桔霉素。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)醬油、米醋、腐乳或大米桔霉素檢出限較粗提物的檢出限減小。該富集方法易擴(kuò)大規(guī)模，進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)，對(duì)桔霉素的檢測(cè)具有重要的實(shí)際意義。
【專利說明】一種酸性氧化鋁柱分離提純桔霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及桔霉素的分離提純，屬于食品安全檢測(cè)前處理。
【背景技術(shù)】
[0002]桔霉素(Citrinin)，主要由青霉，曲霉，紅曲霉屬真菌產(chǎn)生。食品中桔霉素的污染非常普遍的。如自然條件下容易受霉菌污染的食品原料和食品，利用霉菌作用而生產(chǎn)的食品，利用紅曲色素作為添加劑的食品等，它們都極有可能受到桔霉素的污染。學(xué)者在紅曲色素、谷物、果汁等食品中，均測(cè)出桔霉素。研究發(fā)現(xiàn)，桔霉素是一種腎毒素，具有致畸致癌性，因而被國(guó)際生命科學(xué)院自然毒素檢測(cè)委員會(huì)歐洲分會(huì)列為必須檢測(cè)的毒素之一。歐盟要求食品中桔霉素不得超過0.lmg/kg,韓國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.05mg/kg,澳大利亞、新西蘭等國(guó)家要求食品中桔霉素不能夠超過0.2mg/kg。日本規(guī)定紅曲色素中桔霉素不能超過0.2mg/kg，我國(guó)對(duì)以紅曲原料的保健食品有桔霉素限量，為0.05mg/kg，但對(duì)普通食品還沒有設(shè)定桔霉素限制標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國(guó)很多出口的食品都需要檢測(cè)桔霉素含量，它已經(jīng)成了限制我國(guó)紅曲及其制品，利用曲霉的食品出口的瓶頸問題。目前桔霉素定量最有效的方法是高效液相-熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)。我們對(duì)30類食品中的桔霉素含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分食品粗提液，可以用HPLC-FLD直接測(cè)出含量。但是醬油、腐乳等食品的桔霉素HPLC出峰處，存在干擾物質(zhì)難以完全分離問題，其測(cè)定結(jié)果偏高；而大米、米醋等食品桔霉素含量較低，HPLC直接測(cè)定也存在檢測(cè)限偏高問題。目前我國(guó)針對(duì)進(jìn)出口食品中桔霉素檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)大米中桔霉素的測(cè)定，也并非桔霉素提取后直接測(cè)定，而是要用桔霉素免疫親和柱純化后，再用HPLC-FLD，其回收率為70.25%_88.65%，精密度為3.72%_7.94%，檢測(cè)低限為30 μ g/kg。桔霉素免疫親和柱目前都是進(jìn)口的，價(jià)格非常昂貴。
[0003]本發(fā)明采用酸性氧化鋁柱純化富集桔霉素屬于開創(chuàng)性研究，用酸性氧化鋁柱對(duì)桔霉素純化富集的研究上未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種酸性氧化鋁柱分離提純桔霉素的方法。
[0005]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0006]提供一種酸性氧化鋁柱分離提純桔霉素的方法，包括以下步驟:
[0007](I)選用酸性氧化鋁為提純柱的柱填料，柱體積為3mL，裝柱量為0.5g?1.0g，使用干法上柱；
[0008](2)用IOmL甲醇預(yù)淋洗柱，然后上樣，樣品過柱后，先用20mL pH2.5的60%甲醇洗脫雜質(zhì)，再用40mL pH2.1的80%甲醇洗脫桔霉素，收集洗脫液，水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，得到提純自樣品的桔霉素；
[0009]所述不同濃度的甲醇均為甲醇與加水后總體積的百分比；上樣和洗脫時(shí)的流速均為 1mT,/mi η ；[0010]所述樣品是:醬油液體樣品的凍干粉、米醋液體樣品的凍干粉、腐乳樣品的勻漿處理物或大米樣品粉碎物。
[0011]本發(fā)明中，所述樣品的制備過程是:
[0012]AUOOmL醬油的液體樣品，在45°C ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者，
[0013]取IOOmL米醋的液體樣品，在45°C ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者，
[0014]取10.0g腐乳樣品，加入20mL60%乙醇溶液，用打漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理；或者，
[0015]將大米樣品放入粉碎機(jī)中粉碎成粉末，稱取20.0g ；
[0016]B、向前一步驟所得樣品中加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液；合并上清液進(jìn)行減壓蒸發(fā)至無液體滴出；干燥后加入IOmL甲醇復(fù)溶，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液；離心后取出上清液減壓蒸發(fā)至無液體滴出；放至干燥狀態(tài)后，2.0mL甲醇定容，移至2mL離心管備用。
[0017]本發(fā)明中，所述60%甲醇和80%甲醇均使用磷酸調(diào)節(jié)pH值。
[0018]本發(fā)明還提供了一種用于確定所述方法中桔霉素回收率的方法，是在其樣品的制備過程中加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；其過程具體包括:
[0019]A、取三個(gè)IOOmL醬油的液體樣品，分別按9.6 μ g、12.0 μ g、14.4 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；在451: ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者，
[0020]取三個(gè)IOOmL米醋的液體樣品，分別按4.8 μ g、6.0 μ g、7.2 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；在451: ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者，
[0021]取三個(gè)10.0g腐乳樣品，加入20mL60%乙醇溶液，用打漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理后，分別按4.8 μ g、6.0 μ g、7.2 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；或者，
[0022]將大米樣品放入粉碎機(jī)中粉碎成粉末，取三份樣品，各稱取20.0g，分別按
1.0 μ g、1.2 μ g、1.5 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；
[0023]B、向前一步驟所得樣品中加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液；合并上清液進(jìn)行減壓蒸發(fā)至無液體滴出；干燥后加入IOmL甲醇復(fù)溶，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液；離心后取出上清液減壓蒸發(fā)至無液體滴出；放至干燥狀態(tài)后，2.0mL甲醇定容，移至2mL離心管備用。
[0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025]本發(fā)明開發(fā)酸性氧化鋁柱對(duì)桔霉素純化富集，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)桔霉素檢出限較粗提物的檢出限減小。醬油、米醋粗提物中桔霉素的檢出限分別為經(jīng)過經(jīng)過酸性氧化鋁柱純化富集后的8.5倍和9.5倍。大米、腐乳粗提物中桔霉素的檢出限分別為經(jīng)過經(jīng)過酸性氧化鋁柱純化富集后的8.7倍和9.0倍。
[0026]采用酸性氧化鋁柱純化桔霉素，可以實(shí)現(xiàn)檢出限較粗提物的檢出限減小。食品中粗提物中桔霉素的檢出限均為經(jīng)過酸性氧化鋁柱純化富集后的8.5-9.5倍。該富集方法易擴(kuò)大規(guī)模，進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)。
[0027]本發(fā)明對(duì)桔霉素的檢測(cè)具有重要的實(shí)際意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為酸性氧化招提純后桔霉素的高效液相色譜圖(出峰時(shí)間為6.556min)o【具體實(shí)施方式】
[0029]我們?cè)诮勖顾胤治鰷y(cè)定研究工作中，發(fā)展出酸性氧化鋁柱和洗脫體系，對(duì)食品樣品中桔霉素進(jìn)行提純，然后測(cè)定其含量，能夠用很低的成本，排除食品的桔霉素檢測(cè)中雜質(zhì)干擾問題，以及符合檢測(cè)限要求。較好地解決了食品中桔霉素含量的測(cè)定問題。
[0030]本發(fā)明的技術(shù)方案:制備酸性氧化鋁的固體分離柱，以4種食品的粗提物為原料，采用柱層析法，選取合適的柱填料和洗脫液分離純化富集桔霉素。
[0031 ] 酸性氧化鋁，干法上柱，加壓使填料壓實(shí)，上樣流速為lmL/min，樣品液通過酸性氧化鋁柱后，用甲醇以lmL/min的流速，除去雜質(zhì)，加壓使洗脫液流完，再用80%甲醇(pH2.1),以流速lmL/min進(jìn)行洗脫,流出液中桔霉素得以純化富集。
[0032]一、層析柱填料的選取
[0033]分別用等量酸性氧化鋁、中性氧化鋁、弗羅里硅土、硅藻土、硅膠、活性碳顆粒為填料裝柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。結(jié)果表明酸性氧化鋁和中性氧化鋁對(duì)桔霉素的吸附率為100%，活性炭對(duì)桔霉素的吸附率為99.70%。被酸性氧化鋁吸附的桔霉素具有最高的解吸率，被中性氧化鋁吸附的桔霉素解吸率較低，被活性炭吸附的桔霉素很難洗脫下來。酸性氧化鋁除雜效果顯著，因此選用酸性氧化鋁作為填料，純化富集桔霉素。
[0034]本發(fā)明中，酸性氧化鋁是指:三氧化二鋁，CAS登記號(hào)1344-28-1，白色粉末，使用酸性溶劑預(yù)處理過，具有微弱陽離子特性。其來源為:上海五四化學(xué)試劑有限公司，Q/BKUS5-1999 層析用。
[0035]二、洗脫體系的確定
[0036]選擇酸性氧化鋁柱。將0.5mL桔霉素濃度為0.001mg/mL的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(甲醇為溶劑)以lmL/min的流速通過裝柱量為0.500g的酸性氧化鋁柱(柱體積為3mL)，再用20mL洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液，在39°C ±2°C的水浴上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋干后，1.0mL甲醇復(fù)溶，用0.45 μ m有機(jī)濾膜過濾，再進(jìn)行HPLC分析。重復(fù)5次，計(jì)算各種洗脫劑的洗脫率。
[0037]預(yù)備實(shí)驗(yàn):
[0038]1、單溶劑:氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、甲醇(pH2.5)。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇(pH2.5)洗脫效果最好，洗脫率為33.82%。
[0039]2、復(fù)配溶劑為備選洗脫體系:氯仿:甲醇=80: 20、氯仿:甲醇=90: 10、丙酮:正己烷=40: 60、乙酸乙酯:石油醚=90: 10、60%甲醇(pH2.5)、70%甲醇(pH2.5)、80%甲醇(pH2.5),85% 甲醇(ρΗ2.5),90% 甲醇(ρΗ2.5),95% 甲醇(ρΗ2.5)、70% 乙醇(ρΗ2.5),80%乙醇(ρΗ2.5),90%乙醇(ρΗ2.5)。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，80%甲醇(ρΗ2.5)在酸性氧化鋁上的洗脫劑最高，為74.26%。
[0040]另，對(duì)甲醇、氯仿、乙酸乙酯、氯仿:甲醇=80: 20、氯仿:甲醇=90: 10、丙酮:正己烷=40: 60、乙酸乙酯:石油醚=90: 10、60%甲醇(ρΗ2.5)進(jìn)行洗脫桔霉素的測(cè)試。[0041]食品中對(duì)桔霉素HPLC檢測(cè)形成干擾的物質(zhì)主要是極性較大的物質(zhì)。用60%甲醇(PH2.5)和甲醇洗脫吸附桔霉素的酸性氧化鋁柱，桔霉素的洗脫率分別為0%和0.21%?？梢赃x擇其中一種洗脫雜質(zhì)溶劑，作為食品粗提物過柱后減少雜質(zhì)的清洗液。
[0042]正式實(shí)驗(yàn):采用分別調(diào)pH2.7、pH2.5、pH2.3、pH2.l、pH2.0、pH不調(diào)節(jié)的80%甲醇。結(jié)果顯示:80%甲醇(pH2.1)是酸性氧化鋁的桔霉素最佳洗脫劑，洗脫率為83.65%。因此選用80%甲醇(pH2.1)為洗脫劑。
[0043]備注:洗脫體系的pH均用磷酸調(diào)節(jié)，溶劑比值均為體積比。不同濃度的甲醇均為甲醇與加水后總體積的百分比，乙醇同樣。
[0044]實(shí)施例1
[0045]液體樣品桔霉素提取:取三個(gè)食品樣品，再分別按照表2中加入不同量的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品后，進(jìn)行提取操作。
[0046]醬油、米醋提取方法一樣。各取IOOmL液體樣品，按照表2加標(biāo)準(zhǔn)品。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在45°C ±2°C下，減壓濃縮，至無液體滴出時(shí)，濃縮物和瓶一起放入_80°C冰箱中冷凍至固態(tài)，在_30°C，14Pa條件下冷凍干燥2天，收集粉末。粉末樣品移入250mL的錐形瓶中，加入50mL60%的乙醇溶液(預(yù)備實(shí)驗(yàn)獲得最佳工藝)，置于超聲儀中超聲20min (預(yù)備實(shí)驗(yàn)獲得最佳工藝)，靜置2min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%的乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，靜置2min，收集上清液。合并上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在39°C ±2°C水浴里進(jìn)行減壓蒸發(fā)至幾乎無液體滴出。 將該瓶放于通風(fēng)櫥中至干燥狀態(tài)后，加入IOmL甲醇復(fù)溶，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液，8000rpm離心15min。取出上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶,減壓蒸發(fā)至無液體滴出。放入通風(fēng)櫥中至干燥狀態(tài)后，2.0mL甲醇定容，移至2mL離心管。
[0047]實(shí)驗(yàn)選用酸性氧化鋁為柱填料，裝柱規(guī)格為1.0g，干法上柱后加壓使填料壓實(shí)。用IOmL甲醇活化后，分別取前面處理好的食品樣品提取液過柱，先用20mL60%甲醇(pH2.5)洗脫雜質(zhì)。再用40mL洗脫液80%甲醇(pH2.1)以lmL/min流速洗脫，加壓使其流干，收集洗脫液，在39°C ±2°C溫度下水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋干后，1.0mL甲醇復(fù)溶，再用0.45 μ m有機(jī)濾膜過濾，最后進(jìn)行HPLC分析測(cè)定。
[0048]液相測(cè)定條件:島津ODS 柱(Hypersil 0DS2, 5 μ m, 250 X 4.6mm)，RF-1OA熒光檢測(cè)器，柱溫為25 V。流速為0.8mL/min,進(jìn)樣；量10 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)為λ ex=331nm, λ em=500nm,流動(dòng)相:乙腈:超純水(pH2.5)=30:70。桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品在100 μ g/mL-0.01 μ g/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2=L 0000)，重復(fù)5次進(jìn)樣，精密度為0.074%,說明該色譜條件具有良好地重現(xiàn)性，符合實(shí)驗(yàn)要求。
[0049]表1醬油和米醋樣品中桔霉素提取物檢出限
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種酸性氧化鋁柱分離提純桔霉素的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用酸性氧化鋁為提純柱的柱填料，柱體積為3mL，裝柱量為0.5g~1.0g，使用干法上柱； (2)用IOmL甲醇預(yù)淋洗柱，然后上樣，樣品過柱后，先用20mLpH2.5的60%甲醇洗脫雜質(zhì)，再用40mL pH2.1的80%甲醇洗脫桔霉素，收集洗脫液，水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，得到提純自樣品的桔霉素； 所述不同濃度的甲醇均為甲醇與加水后總體積的百分比；上樣和洗脫時(shí)的流速均為1mT,/mi η ； 所述樣品是:醬油液體樣品的凍干粉、米醋液體樣品的凍干粉、腐乳樣品的勻漿處理物或大米樣品粉碎物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品的制備過程是: AUOOmL醬油的液體樣品，在45°C ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者， 取IOOmL米醋的液體樣品，在45°C ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者， 取10.0g腐乳樣品，加入20mL60%乙醇溶液，用打漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理；或者， 將大米樣品放入粉碎機(jī)中粉碎成粉末，稱取20.0g ； B、向前一步驟所得·樣品中加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液；合并上清液進(jìn)行減壓蒸發(fā)至無液體滴出；干燥后加入IOmL甲醇復(fù)溶，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液；離心后取出上清液減壓蒸發(fā)至無液體滴出；放至干燥狀態(tài)后，2.0mL甲醇定容，移至2mL離心管備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述60%甲醇和80%甲醇均使用磷酸調(diào)節(jié)pH值。
4.一種用于確定權(quán)利要求1所述方法中桔霉素回收率的方法，其特征在于，是在其樣品的制備過程中加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；其過程具體包括: A、取三個(gè)IOOmL醬油的液體樣品，分別按9.6μ g、12.0y g、14.4μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；在451: ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者， 取三個(gè)IOOmL米醋的液體樣品，分別按4.8 μ g、6.0 μ g、7.2 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；在450C ±2°C下減壓濃縮至無液體滴出，濃縮物冷凍至固態(tài)后冷凍干燥2天，收集粉末狀樣品；或者， 取三個(gè)10.0g腐乳樣品，加入20mL60%乙醇溶液，用打漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理后，分別按·4.8 μ g、6.0 μ g、7.2 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品；或者， 將大米樣品放入粉碎機(jī)中粉碎成粉末，取三份樣品，各稱取20.0g,分別按1.0μ g、·1.2 μ g、1.5 μ g加入桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品； B、向前一步驟所得樣品中加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%乙醇溶液，置于超聲儀中超聲20min，收集上清液；合并上清液進(jìn)行減壓蒸發(fā)至無液體滴出；干燥后加入IOmL甲醇復(fù)溶，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液；離心后取出上清液減壓蒸發(fā)至無液體滴出；放至干燥狀態(tài)后，2.0mL甲醇定容，移至2mL離心管備用。`
【文檔編號(hào)】G01N30/14GK103713070SQ201310711669
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】王向陽, 王芳 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)