人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括：（1）人血清樣品前處理得到衍生化產(chǎn)物；（2）對(duì)所述衍生化產(chǎn)物用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)；（3）根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對(duì)所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計(jì)算所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量，所述極長(zhǎng)鏈脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。相比于【背景技術(shù)】，本發(fā)明的前處理過(guò)程快速、靈敏、準(zhǔn)確。
【專利說(shuō)明】人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及極長(zhǎng)鏈脂肪酸檢測(cè)的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]體內(nèi)的超長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸VLCFA (very-long-chain fatty acids)主要包括二十二烷酸(C22:0 )、二十四烷酸(C24:0 )和二十六烷酸(C26:0 )3種，它們只能在過(guò)氧化物酶體中進(jìn)行β_氧化。VLCFA在體內(nèi)主要以酯的方式存在，包括甘油三酯、磷脂、糖脂等，但是也有少部分以游離方式或游離方式結(jié)合血清白蛋白存在。
[0003]測(cè)定血清中VLCFA的含量，可以用來(lái)輔助診斷疑似過(guò)氧化物酶體代謝失調(diào)相關(guān)的遺傳代謝性疾病，包括過(guò)氧化物酶體生源性失調(diào)、X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良以及過(guò)氧化物酶體功能評(píng)價(jià)等。
[0004]目前，廣泛使用的人血清中極長(zhǎng)鏈脂肪酸的檢測(cè)方法為氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，因?yàn)槭褂肎C和GC-MS要求檢測(cè)的化合物必須揮發(fā)性強(qiáng)，熱穩(wěn)定性好，因此，極長(zhǎng)鏈脂肪酸在上機(jī)檢測(cè)之前，必須進(jìn)行相應(yīng)的前處理，使其轉(zhuǎn)化成為適合GC和GC-MS檢測(cè)的化合物，這也就導(dǎo)致極長(zhǎng)鏈脂肪酸的前處理過(guò)程復(fù)雜，分析時(shí)間較長(zhǎng)，應(yīng)用時(shí)
具有一定的局限性。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的前處理方法就是將脂肪酸進(jìn)行硅烷衍生化或甲酯化反應(yīng)，生成硅烷化產(chǎn)物或者甲酯化產(chǎn)物，然后進(jìn)GC或GC-MS檢測(cè)。
[0006]硅烷衍生化的前處理步驟:首先進(jìn)行水解，將在體內(nèi)以酯化方式存在的極長(zhǎng)鏈脂肪酸水解出來(lái)，采用非極性的溶劑萃取游離的脂肪酸，氮?dú)獯蹈芍?，加入衍生化試劑反?yīng)，衍生化產(chǎn)物上機(jī)測(cè)定。
[0007]甲酯化的前處理步驟分為兩種:一種為采用有機(jī)溶劑將游離的脂肪酸及以酯化狀態(tài)存在的脂肪酸使用非極性溶劑或者混合溶劑萃取之后，加入甲酯化試劑，其中游離的脂肪酸進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，酯化狀態(tài)的脂肪酸發(fā)生轉(zhuǎn)甲酯化反應(yīng)，然后采用正己烷萃取甲酯化的產(chǎn)物，氮?dú)獯蹈桑瑥?fù)溶后檢測(cè)；另一種為直接在樣品中加入甲酯化試劑，游離的脂肪酸進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，結(jié)合狀態(tài)的脂肪酸進(jìn)行轉(zhuǎn)甲酯化反應(yīng)，然后采用有機(jī)溶劑萃取甲酯化的產(chǎn)物，氮?dú)獯蹈?，?fù)溶后檢測(cè)。
[0008]由于血清中含有大量非極性的留醇類，在采用非極性的有機(jī)溶劑萃取脂肪酸時(shí)，會(huì)同時(shí)萃取到大量的留醇類雜質(zhì)，這些留醇類化合物上機(jī)檢測(cè)，所得的響應(yīng)非常高，干擾到目標(biāo)化合物在色譜柱上的分離分析，因此在前處理過(guò)程中去除留醇類雜質(zhì)的干擾必不可少。
[0009]針對(duì)留醇類雜質(zhì)的去除，在采用硅烷衍生化方法時(shí)，在水解之后將溶液加鹽酸酸化，使用正己烷萃取，這一步同時(shí)將脂肪酸和非極性的留醇類化合物萃取出來(lái)，然后再加入氫氧化鉀，使脂肪酸發(fā)生皂化反應(yīng)，以離子化狀態(tài)存在于水相層，而沒(méi)有羧基的留醇類雜質(zhì)由于沒(méi)有發(fā)生皂化反應(yīng)，仍然留在了有機(jī)相層，通過(guò)將有機(jī)相層棄除，來(lái)除掉大部分的甾醇類雜質(zhì)，然后在水相層中再次加入鹽酸，使離子化的脂肪酸呈現(xiàn)游離狀態(tài)，加入正己烷萃取，氮?dú)獯蹈?，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，該方法步驟繁瑣，操作復(fù)雜，萃取效率低，不利于得到穩(wěn)定的結(jié)果。而使用甲酯化反應(yīng)的前處理方法中沒(méi)有涉及到留醇類化合物去除的步驟。
[0010]由于目前報(bào)道的測(cè)定血清中極長(zhǎng)鏈脂肪酸的前處理方法都非常復(fù)雜，因此建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的前處理方法就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明實(shí)施例所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，前處理過(guò)程快速、靈敏、準(zhǔn)確。
[0012]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，所述方法包括:
[0013](1)、人血清樣品前處理得到衍生化產(chǎn)物，包括:
[0014]在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標(biāo)溶液，再加入鹽酸-乙腈溶液，充分混勻后在設(shè)定為80?120°C的烘箱中酸水解；
[0015]將酸水解后的溶液靜置冷卻至室溫,加入氫氧化鈉-甲醇水溶液,充分混勻后在設(shè)定為80?120°C的烘箱中堿水解；
[0016]將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性；
[0017]加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液用氮?dú)獯蹈桑跉堅(jiān)屑尤胙苌噭?，置?0?90°C的烘箱中進(jìn)行衍生化反應(yīng)得到衍生化產(chǎn)物；
[0018](2)、對(duì)所述衍生化產(chǎn)物用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)；
[0019]其中，氣相色譜條件包括:
[0020]色譜柱:Rxi_-5SilMS 30mΧ0.25mmΧ0.25 μ m ；
[0021]載氣:氦氣，99.999% ；
[0022]載氣流速:1.0mL/min ；
[0023]進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣；
[0024]進(jìn)樣體積:1 μ L ;
[0025]進(jìn)樣口溫度:300°C;
[0026]Post Run Temp:320°C ；
[0027]Post Run Time:3min ；
[0028]其中，質(zhì)譜條件包括:
[0029]電離源:電子轟擊離子源，70ev ；
[0030]傳輸線溫度:310°C ;
[0031]離子源溫度:280 °C ;
[0032]四極桿質(zhì)量分析器溫度:150°C ；
[0033]溶劑延遲時(shí)間:6min ；
[0034]掃描模式:全掃描和選擇離子掃描，全掃描范圍為m/z73.00-500.00 ；
[0035](3)、根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對(duì)所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計(jì)算所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量，所述極長(zhǎng)鏈脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。
[0036]優(yōu)選地，所述酸水解的時(shí)間為40~60min，所述堿水解的時(shí)間為40~60min。
[0037]優(yōu)選地，所述人血清樣品與所述鹽酸-乙腈溶液的體積比為(1:20)~(1:40)，所述人血清樣品與所述氫氧化鈉-甲醇水溶液的體積比為(1:20)~(1:40)；
[0038]所述將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(60:1),所述鹽酸與所述人血清樣品的體積比為(5:1)~(10:1)；
[0039]所述加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液進(jìn)行萃取的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(100:1)。
[0040]優(yōu)選地，所述十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標(biāo)溶液包括十七烷酸和二十七烷酸，其中，所述十七烷酸和二十七烷酸的質(zhì)量比為(8:1)~(15:1)。
[0041]優(yōu)選地，所述衍生化試劑包括雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，所述雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與所述三甲基氯硅烷的比例為99:1。
[0042]優(yōu)選地，氣相色譜的色譜柱升溫程序包括:
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種人血清中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括:(1)、人血清樣品前處理得到衍生化產(chǎn)物，包括:在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標(biāo)溶液，再加入鹽酸-乙腈溶液，充分混勻后在設(shè)定為80~120°C的烘箱中酸水解；將酸水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入氫氧化鈉-甲醇水溶液，充分混勻后在設(shè)定為80~120°C的烘箱中堿水解；將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性；加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液用氮?dú)獯蹈?，在殘?jiān)屑尤胙苌噭?，置?0~90°C的烘箱中進(jìn)行衍生化反應(yīng)得到衍生化產(chǎn)物；(2)、對(duì)所述衍生化產(chǎn)物用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)；其中，氣相色譜條件包括:色譜柱:Rxi?-5Sil MS 30mX0.25mmX0.25 μ m ；載氣:氦氣，99.999% ；載氣流速:1.0mL/min ；進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積:ι μ L ;進(jìn)樣口溫度:300°c ；Post Run Temp:320°C ；Post Run Time:3min ；其中，質(zhì)譜條件包括:電尚源:電子轟擊尚子源，70ev ；傳輸線溫度:310 C ；離子源溫度:280°C ；四極桿質(zhì)量分析器溫度:150°C ；溶劑延遲時(shí)間:6min ；掃描模式:全掃描和選擇離子掃描，全掃描范圍為m/z73.00-500.00 ；(3)、根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對(duì)所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計(jì)算所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量，所述極長(zhǎng)鏈脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸水解的時(shí)間為40~60min，所述堿水解的時(shí)間為40~60min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人血清樣品與所述鹽酸-乙腈溶液的體積比為(1:20)~(1:40)，所述人血清樣品與所述氫氧化鈉-甲醇水溶液的體積比為(1:20)~(1:40)；所述將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(60:1),所述鹽酸與所述人血清樣品的體積比為(5:1)~(10:1)；所述加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液進(jìn)行萃取的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(100:1)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標(biāo)溶液包括十七燒酸和二十七燒酸，其中，所述十七燒酸和二十七燒酸的質(zhì)量比為(8:1)~(15:1)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化試劑包括雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，所述雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與所述三甲基氯硅烷的比例為99:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，氣相色譜的色譜柱升溫程序包括:
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，選擇離子掃描(SIM)模式參數(shù)包括:|
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對(duì)人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計(jì)算所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量的步驟包括:以所述衍生化產(chǎn)物中三種極長(zhǎng)鏈脂肪酸分別與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、全掃描所得的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫(kù)檢索以及與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)作為定性依據(jù)；用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，依據(jù)各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的峰面積分別與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的濃度分別與內(nèi)標(biāo)物的濃度比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所述人血清樣品中各極長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103645263SQ201310720163
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】李維, 程雅婷, 趙蓓蓓, 劉偉霞, 吳華順 申請(qǐng)人:廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司