一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，本方法采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。該方法包括面粉中偶氮甲酰胺的提取、衍生化的樣品前處理步驟，基質(zhì)匹配校正溶液的制備步驟和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測及確證步驟。本發(fā)明提供的面粉中偶氮甲酰胺的測定方法具有步驟簡便、快速、準(zhǔn)確度和精密高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]面粉能夠?yàn)槿祟愄峁┴S富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、B族維他命、維他命E、鐵元素、微量礦物質(zhì)和纖維素等，全球有35%-40%的人口以面粉為主食，其中中國13億人口也是以面粉作為主食。為了改善面粉的加工性能，往往需要對其進(jìn)行改性。偶氮甲酰胺就是常用的面粉改性劑之一。偶氮甲酰胺是一種黃至橘紅色結(jié)晶性粉末，早期是一種用于生產(chǎn)聚乙烯材料的發(fā)泡劑。由于偶氮甲酰胺具有漂白和氧化雙重作用，現(xiàn)如今，大部分偶氮甲酰胺用于面粉的改性。偶氮甲酰胺的改性機(jī)理是通過氧化面粉蛋白中的巰基使之變成二硫鍵，從而有效地改善面團(tuán)的彈性、韌性及均勻性。然而，偶氮甲酰胺對人體健康具有一定的負(fù)作用。首先，偶氮甲酰胺在面包制作的高溫高濕條件下會降解生成一種致癌物質(zhì)-氨基脲；其次，該化合物本身會引起呼吸道癥狀、哮喘和皮膚過敏。中國、美國、加拿大等國家將面粉中偶氮甲酰胺的添加限量規(guī)定為45mg/kg，而歐盟、澳大利亞、新加坡等則禁止將偶氮甲酰胺用于面粉的改性。
[0003]目前，面粉中偶氮甲酰胺的測定方法主要有碘量法、分光光度法和高效液相色譜法。碘量法即美國谷物化學(xué)師協(xié)會(AACC)方法AACC Method48-71，該方法靈敏度和特異性較差，不適用于面粉中偶氮甲酰胺常規(guī)添加量(ppm級)的分析，只適用于含高濃度偶氮甲酰胺的預(yù)混改性料的分析。分光光度法是將偶氮甲酰胺還原為聯(lián)二脲，然后將聯(lián)二脲轉(zhuǎn)變?yōu)殡?，加入對二甲氨基苯甲醛顯色，然后在460nm下采用分光光度計(jì)檢測。分光光度法具有操作工序繁瑣，耗時(shí)，特異性差等缺點(diǎn)。高效液相色譜法主要采用有機(jī)溶劑(如丙酮、乙腈等)提取面粉中的偶氮甲酰胺，然后采用反相C18柱進(jìn)行色譜分離，紫外檢測器檢測，檢測低限可達(dá)到1.0mg/kg。事實(shí)上，高效液相色譜法的特異性和靈敏度均劣于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)成為食品安全檢測中適用范圍廣、功能強(qiáng)大的檢測工具。目前，還未見采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定面粉中偶氮甲酰胺的報(bào)道。
[0004]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定面粉中偶氮甲酰胺是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)，主要是因?yàn)榉治鲞^程中偶氮甲酰胺會與面粉基質(zhì)反應(yīng)，同時(shí)偶氮甲酰胺在串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中無響應(yīng)。因此，克服和解決上述難題，建立簡單、準(zhǔn)確、靈敏的面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，對于面粉中偶氮甲酰胺的有效監(jiān)控，確保面粉類食品安全，促進(jìn)我國面粉及烘焙行業(yè)的健康和穩(wěn)定發(fā)展，促進(jìn)國際貿(mào)易，都具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，使本方法操作簡單，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，主要包括如下步驟:[0007](I)樣品前處理
[0008]稱取2.0g面粉于50mL離心管中，加入136mg/L對甲苯亞磺酸鈉的N, N- 二甲基甲酰胺溶液IOmL進(jìn)行提取和衍生化,潤旋混勻，振蕩IOmin,于8000r/min離心5min,移取上清液于另一離心管中，再用IOmL對甲苯亞磺酸鈉溶液提取和衍生化一次，合并上清液，渦旋混勻，于8000r/min離心3min，取上清液過0.22 μ m濾膜，獲得待測樣液，供液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜測定和確證；
[0009](2)基質(zhì)匹配校正溶液的制備
[0010]準(zhǔn)確稱取IOOg空白面粉(即不含偶氮甲酰胺的面粉)，添加9.0Omg偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，攪拌至少2h直至混勻，得到90mg/kg偶氮甲酰胺的添加樣品，對90mg/kg偶氮甲酰胺的添加樣品添加空白面粉進(jìn)行逐級稀釋，然后分別稱取2.0g添加偶氮甲酰胺的添加樣品，按照步驟(I)的處理方法進(jìn)行處理，得到若干不同濃度的基質(zhì)匹配校正溶液；
[0011](3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測及確證
[0012]分別取10 μ L待測樣液和任一濃度的基質(zhì)匹配校正溶液，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，獲得待測樣液中偶氮甲酰胺的預(yù)測含量；根據(jù)待測樣液中偶氮甲酰胺含量情況，選定與該濃度(即預(yù)測的待測樣液中偶氮甲酰胺含量情況)相近的基質(zhì)匹配校正溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量；基質(zhì)匹配校正溶液和待測樣液中偶氮甲酰胺衍生產(chǎn)物的響應(yīng)值均在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測的線性范圍內(nèi)，基質(zhì)匹配校正溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定；如果待測樣液中與基質(zhì)匹配校正溶液相同的保留時(shí)間有峰出現(xiàn)，則對其進(jìn)行確證分析，判定待測樣液中含有偶氮甲酰胺，采用基質(zhì)匹配校正溶液外標(biāo)法定量。
[0013]為優(yōu)化上述技術(shù)方案，上述確證分析為:偶氮甲酰胺衍生產(chǎn)物質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生產(chǎn)物相一致，并且在除去背景后的樣品譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)；同時(shí)所選擇離子的豐度比與偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生產(chǎn)物的相關(guān)離子的豐度比在允許偏差之內(nèi)；則判定待測樣液中存在偶氮甲酰胺。偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生產(chǎn)物由偶氮甲酰胺用對甲苯亞磺酸鈉按照步驟(I)中提取和衍生化得到的。
[0014]在上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測中采用色譜柱=C18色譜柱，IOOmmX 2.1mm(內(nèi)徑)，1.7ym ;流動(dòng)相:Α相:乙腈，B相:0.2%甲酸/5mmol/L乙酸銨溶液，采用梯度梯度洗脫；流速:0.3mL/min ;柱溫:40°C，進(jìn)樣量:10μ L0
[0015]上述梯度洗脫程序?yàn)?Α相/B相，初始為95:5，持續(xù)至2.0分，經(jīng)線性梯度3.0分至10:90，持續(xù)至4.5分，再經(jīng)線性梯度5.0分至95:5。
[0016]上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測中的串聯(lián)質(zhì)譜條件:電離方式:電噴霧電離(ESI)；掃描方式:正離子掃描；檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓:2.0kV ;離子源溫度:IlO0C ;定性離子對 m/z230.0/187.0、m/z230.0/90.9;定量離子對 m/z230.0/156.9;錐孔電壓 15V;碰撞能量 IOeV 時(shí)為 m/z230.0/187.0, 12eV 時(shí)為 m/z230.0/156.9，30eV 時(shí)為 m/ζ230.0/90.9。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下的優(yōu)點(diǎn):通過N，N-二甲基甲酰胺提取、對甲苯亞磺酸鈉衍生化、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定等對面粉中偶氮甲酰胺進(jìn)行了測定和確證，方法具有簡單，快速，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度較高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0018]圖1為偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖；
[0019]圖中A為離子對m/z230/156.9的MRM圖，B為離子對230/90.9的MRM圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步的描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0021]本實(shí)施例采用的是重慶文琪食品有限公司生產(chǎn)的散裝面粉。具體測定過程如下:
[0022](I)稱取2.0g面粉于50mL離心管中，加入136mg/L對甲苯亞磺酸鈉的N, N- 二甲基甲酰胺溶液IOmL進(jìn)行提取和衍生化,潤旋混勻，振蕩IOmin,于8000r/min離心5min,移取上清液于另一離心管中，再用IOmL對甲苯亞磺酸鈉溶液提取和衍生化一次，合并上清液，渦旋混勻，于8000r/min離心3min，取上清液過0.22 μ m濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定和確證。
[0023](2)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定條件
[0024]①液相色譜條件
[0025]I)色譜柱:C18色 譜柱，IOOmmX 2.1mm (內(nèi)徑)，1.7 μ m,或相當(dāng)者；
[0026]2)流動(dòng)相:乙腈(A)，0.2%甲酸/5mmol/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫程序見表1 ;
[0027]3)流速:0.3mL/min ；
[0028]4)柱溫:40°C ;
[0029]5)進(jìn)樣量:10 μ L。
[0030]表1液相色譜梯度洗脫程序
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，主要包括如下步驟: (1)樣品前處理 稱取2.0g面粉于50mL離心管中，加入136mg/L對甲苯亞磺酸鈉的N, N- 二甲基甲酰胺溶液IOmL進(jìn)行提取和衍生化,潤旋混勻，振蕩IOmin,于8000r/min離心5min,移取上清液于另一離心管中，再用IOmL對甲苯亞磺酸鈉溶液提取和衍生化一次，合并上清液，渦旋混勻，于8000r/min離心3min，取上清液過0.22 μ m濾膜，獲得待測樣液，供液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜測定和確證； (2)基質(zhì)匹配校正溶液的制備 準(zhǔn)確稱取IOOg空白面粉，添加9.0Omg偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，攪拌至少2h直至混勻，得到90mg/kg偶氮甲酰胺的添加樣品，對所述90mg/kg偶氮甲酰胺的添加樣品添加空白面粉進(jìn)行逐級稀釋，然后分別稱取2.0g所述添加偶氮甲酰胺的添加樣品，按照步驟(I)的處理方法進(jìn)行處理，得到若干不同濃度的基質(zhì)匹配校正溶液； (3)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測及確證 根據(jù)待測樣液中偶氮甲酰胺含量情況，選定濃度相近的基質(zhì)匹配校正溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量；基質(zhì)匹配校正溶液和待測樣液中偶氮甲酰胺衍生產(chǎn)物的響應(yīng)值均在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測的線性范圍內(nèi)，基質(zhì)匹配校正溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定；如果待測樣液中與基質(zhì)匹配校正溶液相同的保留時(shí)間有峰出現(xiàn)，則對其進(jìn)行確證分析，判定待測樣液中含有偶氮甲酰胺，采用基質(zhì)匹配校正溶液外標(biāo)法定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，其特征在于:所述確證分析為:偶氮甲酰胺衍生產(chǎn)物質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生產(chǎn)物相一致，并且在除去背景后的樣品譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)；同時(shí)所選擇離子的豐度比與偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生產(chǎn)物的相關(guān)離子的豐度比在允許偏差之內(nèi)；則判定待測樣液中存在偶氮甲酰胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，其特征在于:所述偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生產(chǎn)物由偶氮甲酰胺用對甲苯亞磺酸鈉按照步驟(I)中的提取和衍生化得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，其特征在于:在所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測中采用色譜柱=C18色譜柱，IOOmmX 2.1mm (內(nèi)徑)，1.7 μ m ;流動(dòng)相:A相:乙腈，B相:0.2%甲酸/5mmol/L乙酸銨溶液，采用梯度梯度洗脫；流速:0.3mL/min ;柱溫:40°C,進(jìn)樣量:10 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，其特征在于:梯度洗脫程序?yàn)?Α相/B相，初始為95:5，持續(xù)至2.0分，經(jīng)線性梯度3.0分至10:90，持續(xù)至4.5分，再經(jīng)線性梯度5.0分至95:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種面粉中偶氮甲酰胺的測定和確證方法，其特征在于:所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測中的串聯(lián)質(zhì)譜條件:電離方式:電噴霧電離(ESI);掃描方式:正離子掃描；檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓:2.0kV;離子源溫度:110°C;定性離子對 m/z230.0/187.0、m/z230.0/90.9;定量離子對 m/z230.0/156.9;錐孔電壓 15V;碰撞能量 IOeV 時(shí)為 m/z230.0/187.0, 12eV 時(shí)為 m/z230.0/156.9，30eV 時(shí)為 m/z230.0/90.9。
【文檔編號】G01N30/88GK103698457SQ201310726084
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】王俊蘇, 彭濤, 周啟明, 唐伯彬, 王國民, 王雅, 郗存顯, 向露, 李賢良 申請人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院