一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，該方法用熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體對口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的方法可對口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定標(biāo)記，從而可以進(jìn)行口腔鱗癌活細(xì)胞的觀察研究，豐富了研究人員的實(shí)驗(yàn)手段，拓展了相應(yīng)的研究領(lǐng)域。
【專利說明】一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子影像【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squmaous cell carcinoma, OSCC)簡稱口腔鱗癌，為主要發(fā)生于口腔粘膜上皮等部位的惡性腫瘤，是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%-95%，常引起嚴(yán)重的口腔頜面畸形及咀嚼、吞咽和語言等功能障礙并威脅患者生命?？谇击[癌的發(fā)病部位以舌部最多，其次以牙齦為多，此外，在頰粘膜、腭、口底等其它的口腔粘膜、以及頜骨、唾液腺上也有發(fā)生。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中對口腔鱗癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記主要是采用固定后的死細(xì)胞，雖然經(jīng)固定的細(xì)胞形態(tài)完整，成像效果良好，但沒有辦法對口腔鱗癌細(xì)胞活細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定的標(biāo)記，從而無法進(jìn)行口腔鱗癌活細(xì)胞的觀察研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，用熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體對口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
[0007]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體所用的熒光材料為近紅外熒光材料Alexa680。
[0008]進(jìn)一步優(yōu)選的，包括如下步驟:
[0009](I)將近紅外熒光材料Alexa680與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)；
[0010](2)將Alexa680偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體與的口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行避光孵育后洗漆;
[0011](3)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和共聚焦顯微鏡檢測。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述流式細(xì)胞儀檢測的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射濾片670LP。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述共聚焦顯微鏡檢測的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射濾片650LP。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體所用的熒光材料為量子點(diǎn)Qdot800。
[0015]進(jìn)一步優(yōu)選的，包括如下步驟:
[0016](I)將量子點(diǎn)Qdot800與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)；
[0017](2)將QdotSOO偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體與口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行避光孵育后洗滌；
[0018](3)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和共聚焦顯微鏡檢測。[0019]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述流式細(xì)胞儀檢測的激發(fā)波長為407nm，發(fā)射濾片780/60nm。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述共聚焦顯微鏡檢測的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射濾片650LP。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:
[0022]1、本發(fā)明的方法用熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體對口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定標(biāo)記，從而可以進(jìn)行口腔鱗癌活細(xì)胞的觀察研究，豐富了研究人員的實(shí)驗(yàn)手段，拓展了相應(yīng)的研究領(lǐng)域；
[0023]2、本發(fā)明的采用近紅外熒光材料Alexa680和量子點(diǎn)Qdot800作為熒光標(biāo)記材料與口腔鱗癌特異性單克隆抗體尼妥珠進(jìn)行偶聯(lián)，熒光強(qiáng)度高、標(biāo)記特異性強(qiáng)，成像穩(wěn)定且保存時間長；
[0024]3、本發(fā)明的方法操作簡便快速，且成本低廉。
[0025]4、尼妥珠單克隆抗體(Nimotuzumab,h-R3,商品名泰欣生)是一種新的已臨床應(yīng)用的人源化抗EGFR單克隆抗體分子靶向藥物，本方法可用于標(biāo)記其它過表達(dá)EGFR的細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2的共聚焦顯微鏡照片之一(400 X )；
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的共聚焦顯微鏡照片之二(1000 X )；
[0028]圖3為本發(fā)明實(shí)施例4的共聚焦顯微鏡照片(1000X )。
【具體實(shí)施方式】
`[0029]以下通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附`圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0030]實(shí)施例1
[0031](I)按產(chǎn)品說明書操作,將近紅外突光材料Alexa680 (invitrogen公司)與尼妥珠單克隆抗體(百泰公司)偶聯(lián)，制備熒光標(biāo)記的尼妥珠單克隆抗體探針(Alexa680 -Nim)；
[0032](2)取對數(shù)生長期的口腔鱗癌CAL27細(xì)胞消化后，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，離心棄上清，加入PBS調(diào)整細(xì)胞密度至2 X IOVmL,然后將細(xì)胞懸液分至流式專用管中，100 μ L/管。
[0033](3)加入Alexa680 -Nim，使其在PBS中的終濃度為25 μ g/mL，4°C避光孵育半小時。
[0034](3)標(biāo)記實(shí)驗(yàn):分實(shí)驗(yàn)組和對照組
[0035]實(shí)驗(yàn)組:加入4161&680 -附111，使其在？85中的終濃度為25 4 8/1^，41:避光孵育半小時；
[0036]對照組:包括以下四組，其余處理及孵育條件與實(shí)驗(yàn)組相同
[0037]①PBS空白對照
[0038]②用Alexa68O 代替 Alexa68O - Nim,濃度 25 μ g/mL
[0039]③先將細(xì)胞用含尼妥珠單抗IuL的PBS100 μ L在4°C孵育半小時，PBS洗滌I次，再加入含 Alexa680 - Nim 的 PBS100 μ L,濃度 25 μ g/mL
[0040]④小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系C2C12加入Alexa680 - Nim,濃度25 μ g/mL ；
[0041](4)將上述各組分別用PBS洗滌細(xì)胞2次，1300rpm離心5分鐘，重懸于500 μ L PBS中。[0042](5) Beckman流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長633nm，發(fā)射濾片670LP，配套軟件進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果顯示在25 μ g/mL的低濃度下，Alexa680-Nim即可對CAL27細(xì)胞達(dá)到很高的的標(biāo)記率(> 98%)，對照組均未檢測到明顯的熒光。表明Alexa680-Nim對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞的標(biāo)記特異性很強(qiáng)，標(biāo)記率很高。
[0043]實(shí)施例2
[0044](I)按產(chǎn)品說明書操作，將近紅外熒光材料Alexa680與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)，制備突光標(biāo)記的尼妥珠單克隆抗體探針(Alexa680 - Nim)；
[0045](2)生長良好的CAL27細(xì)胞消化后傳代于直徑35mm、中央玻底孔徑IOmm的玻底培養(yǎng)皿中，2 — 3天后細(xì)胞生長至70 - 80%。
[0046](3)標(biāo)記前12小時，將待用細(xì)胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液，標(biāo)記前輕輕吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。
[0047](4)于中央的玻底孔加入含Alexa680_Nim的無血清培養(yǎng)基50uL，濃度100 μ g/mL，4°C避光孵育半小時。
[0048](5)取出細(xì)胞，吸去液體，PBS洗滌3次，加入少量PBS，共聚焦顯微鏡下觀察。
[0049](6)共聚焦顯微鏡觀測條件:激發(fā)波長633nm，發(fā)射濾片650LP。結(jié)果如圖1和圖2所示，可檢測到熒光定位主要定位在胞膜上，胞漿內(nèi)有極少量熒光，胞核里沒有，與EGFR表達(dá)部位一致。而對照組同樣操作則均未檢測到明顯的熒光(對照組設(shè)計(jì)同實(shí)施例1)。表明Alexa680-Nim標(biāo)記的尼妥珠單抗熒光探針可以特異性的標(biāo)記CAL27細(xì)胞表達(dá)的EGFR，特異性很強(qiáng)，標(biāo)記率很高。
[0050]實(shí)施例3
[0051](I)按產(chǎn)品說明書操作，將量子點(diǎn)Qdot800 (invitrogen公司)與尼妥珠單克隆抗體(百泰公司)偶聯(lián)，制備熒光量子點(diǎn)尼妥珠單克隆抗體探針(QdotSOO -Nim)；
[0052](2)取對數(shù)生長期的口腔鱗癌CAL27細(xì)胞消化后，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，離心棄上清，加入PBS調(diào)整細(xì)胞密度至2 X IOVmL,然后將細(xì)胞懸液分至流式專用管中，100 μ I/管，按以下設(shè)計(jì)分別加入不同量的實(shí)驗(yàn)試劑至流式管中；
[0053](3)標(biāo)記實(shí)驗(yàn):分實(shí)驗(yàn)組和對照組
[0054]實(shí)驗(yàn)組:加入Qdot800 - Nim，使其在PBS中的終濃度為20nmol/L，4°C避光孵育半小時；
[0055]對照組:包括以下四組，其余處理及孵育條件與實(shí)驗(yàn)組相同。
[0056]①PBS空白對照
[0057]②用Qdot800 代替 Qdot800 - Nim,濃度 20nmol/L
[0058]③先將細(xì)胞用含尼妥珠單抗IuL的PBS100 μ L在4°C孵育半小時，PBS洗滌I次，再加入含 Qdot800 - Nim 的 PBS100 μ L,濃度 20nmol/L
[0059]④小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系C2C12加入Qdot800 - Nim,濃度20nmol/L ；
[0060](4)將上述各組分別用PBS洗滌細(xì)胞2次，1300rpm離心5分鐘，重懸于500 μ L PBS中；
[0061](5) BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，激發(fā)波長407nm，發(fā)射濾片780/60nm，配套軟件進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果顯示:在20nmol/L的低濃度下，Qdot800 - Nim即可對CAL27細(xì)胞達(dá)到很高的的標(biāo)記率(> 99%)，熒光強(qiáng)，對照組則不能檢測到熒光，表明Qdot800 -Nim對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞的標(biāo)記特異性很強(qiáng)，標(biāo)記率很高。
[0062]實(shí)施例4
[0063](I)按產(chǎn)品說明書操作,將量子點(diǎn)Qdot800 (invitrogen公司)與尼妥珠單克隆抗體(百泰公司)偶聯(lián)，制備熒光量子點(diǎn)尼妥珠單克隆抗體探針(QdotSOO -Nim)；
[0064](2)生長良好的CAL27細(xì)胞消化后傳代于直徑35mm、中央玻底孔徑IOmm的玻底培養(yǎng)皿中，2 — 3天后細(xì)胞生長至70 - 80%。
[0065](3)標(biāo)記前12小時，將待用細(xì)胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液，標(biāo)記前輕輕吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。
[0066](4)于中央的玻底孔內(nèi)加入含Qdot800 -Nim的無血清培養(yǎng)基50uL，濃度IOOnmol/L，4°C避光孵育半小時。
[0067](5)取出細(xì)胞，吸去液體，PBS洗滌3次，加入少量PBS，共聚焦顯微鏡下觀察。
[0068](6)共聚焦顯微鏡觀測條件:激發(fā)波長488nm，發(fā)射濾片650LP。結(jié)果如圖3所示，CAL27細(xì)胞胞膜、胞漿中表達(dá)的EGFR被明亮的熒光所標(biāo)記呈現(xiàn)。量子點(diǎn)的非特異性吸附非常低，對照組幾乎觀察不到熒光(對照組設(shè)計(jì)同實(shí)施例3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，QdotSOO標(biāo)記的尼妥珠單抗熒光探針可以特異性的標(biāo)記CAL27細(xì)胞表達(dá)的EGFR，標(biāo)記效果好。
[0069]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，SP依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:用熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體對口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體所用的熒光材料為近紅外熒光材料Alexa680。
3.如權(quán)利要求2所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將近紅外熒光材料Alexa680與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)； (2)將Alexa680偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體與口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行避光孵育后洗滌； (3)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和共聚焦顯微鏡檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述流式細(xì)胞儀檢測的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射濾片670LP。
5.如權(quán)利要求3所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述共聚焦顯微鏡檢測的激發(fā)波長為633nm，發(fā)射濾片650LP。
6.如權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述熒光偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體所用的熒光材料為量子點(diǎn)QdotSOO。
7.如權(quán)利要求6所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將量子點(diǎn)Qdot800與尼妥珠單克隆抗體偶聯(lián)； (2)將QdotSOO偶聯(lián)的尼妥珠單克隆抗體與口腔鱗癌活細(xì)胞進(jìn)行避光孵育后洗滌； (3)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和共聚焦顯微鏡檢測。
8.如權(quán)利要求7所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述流式細(xì)胞儀檢測的激發(fā)波長為407nm，發(fā)射濾片780/60nm。
9.如權(quán)利要求7所述的一種穩(wěn)定熒光標(biāo)記口腔鱗癌活細(xì)胞的方法，其特征在于:所述共聚焦顯微鏡檢測的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射濾片650LP。
【文檔編號】G01N33/533GK103675262SQ201310741811
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】步榮發(fā), 黃雪蕾 申請人:步榮發(fā), 黃雪蕾