一種辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法
【專利摘要】一種辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法。其特征是本發(fā)明利用過碘酸鈉法，對合成的無色孔雀石綠免疫原，用辣根過氧化物酶對其進行標記。該標記方法是由無色孔雀石綠免疫原和辣根過氧化物酶在室溫條件下，在低pH條件下，用過碘酸鈉氧化辣根過氧化物酶的糖鏈，形成的醛化酶可與無色孔雀石綠免疫原的氨基相連，然后進一步用硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的酶標記免疫原，獲得的酶標記免疫原經過50%飽和硫酸銨沉淀,用磷酸鹽緩沖液溶解，經透析后，即可獲得辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原。本發(fā)明成功地合成了可用于檢測無色孔雀石綠殘留的酶標記免疫原，并且，為開發(fā)孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測方法奠定了基礎，還有利于普及推廣應用。
【專利說明】一種辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種辣根過氧化物酶標記免疫原的制備方法，特別是涉及一種辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前在無色孔雀石綠檢測中，常見的標記方法都是對抗體進行標記，但抗體的標記存在著標記后抗體的效價下降較大的不足，不利于無色孔雀石綠殘留檢測。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是要提供一種改進的辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法，它不但能有效地制得用于無色孔雀石綠殘留檢測的酶標記無色孔雀石綠免疫原，而且操作簡單，標記效果理想。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:本發(fā)明的一種辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法操作如下，在室溫條件下:
(1)稱取5mg辣根過氧化物酶放入IOmL離心管中，加入ImL雙蒸水溶解，接著緩慢振蕩中緩緩加入0.2mL新鮮配置的0.lmol/L過碘酸鈉溶液，室溫下避光反應20min，將反應后的液體裝入透析袋中，再放入lmmol/L pH4.4醋酸鈉緩沖液中，4°C暗處透析24h，期間換液4次，然后收集透析袋內的液體，得透析好的辣根過氧化物酶溶液；
(2)先在ImL無色孔雀石綠免疫原溶液中加入0.2mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液，將pH調整到9.1，再將步驟(I)透析好的辣根過氧化物酶溶液用0.2mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液調節(jié)PH到9.1，并加入上述調整pH后的無色孔雀石綠免疫原溶液中，室溫下避光反應2h，在反應結束后的溶液中加入100 μ L新配置的4mg/mL硼氫化鈉溶液，4°C放置2h，得結合物；
(3)取步驟(2)所得結合物并加入等體積飽和硫酸銨,混勻，4°C放置30min,3000rpm離心30min,棄上清,沉淀以3mL0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液溶解,裝入透析袋,在200mL以上的0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中4°C暗處透析24h，期間換液4次，得透析物；
(4)取步驟(3)所得透析物，3000rpm離心30min，除去不溶物，即得辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原。
[0005]所述的透析袋是半周長為22mm，截留分子量為14000的透析袋。
[0006]本發(fā)明利用過碘酸鈉法，對合成的無色孔雀石綠免疫原，用辣根過氧化物酶對其進行標記，該標記方法是由無色孔雀石綠免疫原和辣根過氧化物酶在室溫條件下，在低PH條件下，用過碘酸鈉氧化辣根過氧化物酶的糖鏈，形成的醛化酶可與無色孔雀石綠免疫原的氨基相連，然后進一步用硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的酶標記免疫原，獲得的酶標記免疫原經過50%飽和硫酸銨沉淀，用磷酸鹽緩沖液溶解，經透析后，即可獲得辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原。在所得辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原中加入滅菌甘油至40%?50%濃度，_20°C凍存且可保存?zhèn)溆谩?br> [0007]所使用無色孔雀石綠免疫原且購自上海佩吉生物科技有限公司。[0008]本發(fā)明采用了過碘酸鈉法，本發(fā)明的辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法，且制備過程得到了簡化，標記效果理想，用此方法制備得到的酶標無色孔雀石綠免疫原，可用于檢測無色孔雀石綠殘留的酶標記免疫原，在無色孔雀石綠殘留的檢測中，大大降低了方法的檢測限，對提高無色孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測方法的準確度和靈敏度有了可靠的保證，該方法成功地合成了可用于檢測無色孔雀石綠殘留的酶標記免疫原，并且，為開發(fā)孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測方法奠定了基礎，還有利于普及推廣應用。
【具體實施方式】
[0009]以下將對本發(fā)明的辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法作進一步的詳細描述。
[0010]具體步驟如下:
(1)稱取5mg辣根過氧化物酶放入IOmL離心管中，加入ImL雙蒸水溶解，接著緩慢振蕩中緩緩加入0.2mL新鮮配置的0.lmol/L過碘酸鈉溶液，室溫下避光反應20min，將反應后的液體裝入透析袋中，再放入lmmol/L pH4.4醋酸鈉緩沖液中，4°C暗處透析24h，期間換液4次，然后收集透析袋內的液體，得透析好的辣根過氧化物酶溶液；
(2)先在ImL無色孔雀石綠免疫原溶液中加入0.2mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液，將pH調整到9.1，再將步驟(I)透析好的辣根過氧化物酶溶液用0.2mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液調節(jié)PH到9.1，并加入上述調整pH后的無色孔雀石綠免疫原溶液中，室溫下避光反應2h，在反應結束后的溶液中加入100 μ L新配置的4mg/mL硼氫化鈉溶液，4°C放置2h，得結合物；
(3)取步驟(2)所得結合物并加入等體積飽和硫酸銨,混勻，4°C放置30min,3000rpm離心30min,棄上清,沉淀以3mL 0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液溶解,裝入透析袋,在200mL以上的0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中4°C暗處透析24h，期間換液4次，得透析物；
(4)取步驟(3)所得透析物，3000rpm離心30min，除去不溶物，即得辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原。
[0011]上述各步驟均在室溫下進行，所用透析袋均是半周長為22mm，截留分子量為14000的透析袋。
【權利要求】
1.一種辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法，其特征在于通過下列方法制得:在室溫條件下 (1)稱取5mg辣根過氧化物酶放入IOmL離心管中，加入ImL雙蒸水溶解，接著緩慢振蕩中緩緩加入0.2mL新鮮配置的0.lmol/L過碘酸鈉溶液，室溫下避光反應20min，將反應后的液體裝入透析袋中，再放入lmmol/L pH4.4醋酸鈉緩沖液中，4°C暗處透析24h，期間換液4次，然后收集透析袋內的液體，得透析好的辣根過氧化物酶溶液； (2)先在ImL無色孔雀石綠免疫原溶液中加入0.2mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液，將pH調整到9.1，再將步驟(I)透析好的辣根過氧化物酶溶液用0.2mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液調節(jié)PH到9.1，并加入上述調整pH后的無色孔雀石綠免疫原溶液中，室溫下避光反應2h，在反應結束后的溶液中加入100 μ L新鮮配置的4mg/mL硼氫化鈉溶液，4°C放置2h,得結合物； (3)取步驟(2)所得結合物并加入等體積飽和硫酸銨,混勻，4°C放置30min,3000rpm離心30min,棄上清,沉淀以3mL 0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液溶解,裝入透析袋,在200mL以上的0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中4°C暗處透析24h，期間換液4次，得透析物； (4)取步驟(3)所得透析物，3000rpm離心30min，除去不溶物，即得辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原。
2.根據(jù)權利要求1所述的辣根過氧化物酶標記無色孔雀石綠免疫原的制備方法，其特征在于所述的透析袋是半周長為22_，截留分子量為14000的透析袋。
【文檔編號】G01N33/535GK103728448SQ201310747526
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權日:2013年12月31日
【發(fā)明者】楊先樂, 梁楠, 柯江波, 胡利靜, 劉騰飛 申請人:上海海洋大學