兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白swp1在制備診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWP1在制備診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的兔腦炎微孢子蟲(chóng)SWP1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在感染微孢子的狐貍腎臟樣品中，擴(kuò)增得到的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2所示的SWP1序列。將融合表達(dá)的SWP1-GST用于樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明該融合表達(dá)的SWP1-GST蛋白對(duì)于檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染的狐貍血清具有良好的特異性，但與弓形蟲(chóng)，新孢子蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)感染的陽(yáng)性血清沒(méi)有交叉反應(yīng)。而且研究結(jié)果表明使用SWP1蛋白作為檢測(cè)抗原，其敏感性明顯高于用PTP2蛋白作為檢測(cè)抗原的敏感性。因此，本發(fā)明為診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)病提供了一種敏感性更高的方法，從而進(jìn)一步推動(dòng)了兔腦炎微孢子蟲(chóng)病的診斷和預(yù)防技術(shù)的發(fā)展。
【專(zhuān)利說(shuō)明】兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWP1在制備診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染的方法，特別涉及一種以兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl作為抗原，利用ELISA方法診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)的方法，以期提高診斷的敏感性，本發(fā)明屬于獸類(lèi)的疾病診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]兔腦炎微抱子蟲(chóng)病是由兔腦炎微孢子蟲(chóng)(又名兔腦炎原蟲(chóng)，Encephalitozooncuniculi)引起的I種慢性、隱性或亞臨床人畜共患的原蟲(chóng)病。兔腦炎原蟲(chóng)具有廣泛的宿主，包括無(wú)脊椎動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、兔形動(dòng)物、草食動(dòng)物、肉食動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等，已報(bào)道的有兔、大鼠、小鼠、豚鼠、野鼠、家犬、牛、狐貍、豬、貂及昆蟲(chóng)(蟬)等，其中家兔的感染率最高，可達(dá)76%。人類(lèi)亦可感染。多數(shù)動(dòng)物通常為隱住感染而不表現(xiàn)臨床癥狀，但可作為傳染源而傳播疾病，有的可引發(fā)致命性疾病。
[0003]本病廣泛分布于世界各地，我國(guó)亦有發(fā)生本病的報(bào)道。近年來(lái)，出現(xiàn)了大量有關(guān)兔腦炎微抱子蟲(chóng)引起艾滋病患者致死性臨床感染的報(bào)道，致使該人畜共患病受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注和聞度重視。
[0004]動(dòng)物最容易被侵害的器官是中樞神經(jīng)和腎臟。對(duì)于食肉動(dòng)物來(lái)說(shuō)，微孢子蟲(chóng)病是新生動(dòng)物的一種嚴(yán)重神經(jīng)性疾病，也是圈養(yǎng)狐貍地方性流行病，能夠造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005]圈養(yǎng)的狐貍可能通過(guò)攝取污染鼠類(lèi)尿液或者糞便的食物以及垂直傳播獲得感染。因本病的血清學(xué)檢測(cè)是活體動(dòng)物或者人類(lèi)重要的診斷方法，因?yàn)橥ǔＧ闆r下不可能通過(guò)組織學(xué)進(jìn)行檢測(cè)，而且檢測(cè)尿液或者糞便病原體敏感性很低。目前已經(jīng)發(fā)表的血清學(xué)診斷方法有直接凝集實(shí)驗(yàn)，間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。
[0006]其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)主要是以細(xì)胞培養(yǎng)的蟲(chóng)體破碎后作為抗原的ELISA。但是蟲(chóng)體培養(yǎng)成本很高，而且蟲(chóng)體生長(zhǎng)緩慢，純化蟲(chóng)體和抗原制備過(guò)程費(fèi)力。
[0007]也有文獻(xiàn)報(bào)道使用大腸桿菌表達(dá)的重組PTP2蛋白或者PTP3蛋白作為診斷抗原但是PTP2蛋白是該蟲(chóng)體極管蛋白，利用重組PTP2蛋白的特異性和敏感性還有待檢驗(yàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種以更敏感的重組蛋白作為抗原，利用ELISA方法檢測(cè)或診斷兔腦炎微孢子蟲(chóng)病的方法，以期提高診斷的敏感性。
[0009]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:
[0010]本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的兔腦炎微孢子蟲(chóng)SWPl基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在感染微孢子的狐貍腎臟樣品中，擴(kuò)增出SWPl基因的部分序列(21位氨基酸到終止密碼子)，通過(guò)序列測(cè)定分析基因序列。同GB-Ml的SWPl序列相比，本發(fā)明所擴(kuò)增得到的SWPl序列有一段重復(fù)序列的缺失(序列已提交到Genebank，序列號(hào)為KF169728)，擴(kuò)增得到的SWPl序列的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0011]將融合表達(dá)的SWPl-GST用于樣品的檢測(cè)。結(jié)果表明該融合表達(dá)的SWPl-GST蛋白對(duì)于檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染的狐貍血清具有良好的特異性，但與弓形蟲(chóng)，新孢子蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性血清沒(méi)有交叉反應(yīng)。而且結(jié)果顯示SWPl蛋白的敏感性明顯高于PTP2蛋白。
[0012]故本發(fā)明 申請(qǐng)人:提出了兔腦炎微孢子蟲(chóng)(Encephalitozoon cuniculi)孢壁蛋白SWPl在制備診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染試劑中的應(yīng)用。
[0013]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl為與GST融合表達(dá)的重組蛋白SWP1-GST，其中兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所
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[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl與GST融合表達(dá)的重組蛋白SWPl-GST通過(guò)以下方法制備得到:
[0015](I)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的兔腦炎微孢子蟲(chóng)SWPl基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在感染兔腦炎微孢子蟲(chóng)的狐貍腎臟樣品中，擴(kuò)增出編碼SEQ ID N0.1所示的孢壁蛋白SWPl的核苷酸序列，或通過(guò)序列合成的方法直接合成編碼SEQ ID N0.1所示的孢壁蛋白SWPl的核苷酸序列；
[0016](2)從PGEX-4T1載體上擴(kuò)增GST標(biāo)簽序列，并將其插入到PcoldIII載體的NdeI位點(diǎn)中，然后將所擴(kuò)增或合成得到的SWPl基因序列插入到pColdIII原核表達(dá)載體的XhoI和EcoRI位點(diǎn)之間，與GST標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，用GST純化樹(shù)脂純化，即得SWP1-GST。
[0017]更優(yōu)選的，所述的編碼SEQ ID N0.1所示的孢壁蛋白SWPl的核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0018]本發(fā)明為診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)病提供了一種敏感性更高的方法，從而進(jìn)一步推動(dòng)了兔腦炎微孢子蟲(chóng)病的診斷和預(yù)防技術(shù)的發(fā)展。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為純化的重組SWP1-GST，PTP2-GST以及GST蛋白的SDS-PAGE分析；
[0020]UMarker ;2、SffPl-GST ;3、PTP2_GST ;4、GST ;
[0021]圖2為以SWPl-GST為檢測(cè)抗原通過(guò)ELISA檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)，新孢子蟲(chóng)以及隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性血清的結(jié)果；
[0022]圖3為分別以SWPl-GST以及PTP2-GST為檢測(cè)抗原通過(guò)ELISA檢測(cè)狐貍血清樣品的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0024]實(shí)施例1重組兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl-GST的制備
[0025]1、編碼重組兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl的核苷酸序列的擴(kuò)增
[0026]本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的兔腦炎微孢子蟲(chóng)SWPl基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在感染微孢子的狐貍腎臟樣品中，擴(kuò)增出SWPl基因的部分序列(21位氨基酸到終止密碼子)，通過(guò)序列測(cè)定分析基因序列。同GB-Ml的SWPl序列相比，本發(fā)明所擴(kuò)增得到的SWPl序列有一段重復(fù)序列的缺失(序列已提交到Genebank，序列號(hào)為KF169728)，擴(kuò)增得到的SWPl序列的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0027]2、將所擴(kuò)增得到的序列插入到pColdIII原核表達(dá)載體的XhoI和EcoRI位點(diǎn)之間，與GST標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，用GeneScript公司的GST純化樹(shù)脂純化，得到融合蛋白SWP1-GST。同時(shí)用同樣方法表達(dá)GST蛋白和GST蛋白和PTP2蛋白的融合蛋白PTP2-GST。
[0028]3、純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。
[0029]實(shí)施例2重組兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl在診斷或檢測(cè)狐貍血清中兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染中的應(yīng)用
[0030]1、待檢樣品:疑似兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染的200份狐貍血清樣品、兔腦炎微孢子蟲(chóng)(Encephalitozoon cuniculi)感染的陽(yáng)性狐貍血清樣品3份，弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)感染的陽(yáng)性狐貍血清樣品、新孢子蟲(chóng)(Neospora Caninum)感染的陽(yáng)性狐貍血清樣品，隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium parvum)感染的陽(yáng)性狐貍血清樣品。
[0031]2、方法
[0032](I)將實(shí)施例1制備得到的純化后的融合蛋白SWPl-GST用BCA蛋白濃度試劑盒(Pierce)測(cè)定濃度后包被ELISA板(捷特)，每孔包被0.lug，4°C包被過(guò)夜。用5%脫脂乳37°C封閉2h后，加入用5%脫脂乳100倍稀釋的血清樣品，37°C孵育Ih。用PBST洗6次之后，加入用5%脫脂乳5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗狗IgG (Jacson)，37°C孵育lh。用PBST洗6次之后，加入TMB底物顯色，405nm測(cè)定OD值。用實(shí)施例1表達(dá)并純化后的GST蛋白和PTP2-GST融合蛋白作為對(duì)照。
[0033](2)結(jié)果判定=SWPl-GST及PTP2-GST蛋白包被孔的OD值減去GST蛋白包被孔的OD值即為該樣品的實(shí)際值。實(shí)際值大于0.1的樣品判為陽(yáng)性。
[0034]3、結(jié)果
[0035]結(jié)果表明SWPl-GST蛋白檢測(cè)狐貍血清具有良好的特異性，和弓形蟲(chóng)，新孢子蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性血清沒(méi)有交叉反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。
[0036]應(yīng)用重組蛋白SWPl-GST以及PTP2-GST包被的ELISA板分別檢測(cè)200份狐貍血清。結(jié)果顯示SWPl蛋白的敏感性明顯高于PTP2蛋白，結(jié)果如圖3所示。
[0037]綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)狐貍血清樣品，重組SWPl和PTP2蛋白均具有很好的特異性，但是重組SWPl蛋白比PTP2蛋白更為敏感，檢出的陽(yáng)性率較高。
【權(quán)利要求】
1.兔腦炎微孢子蟲(chóng)(Encephalitozooncuniculi)孢壁蛋白SWPl在制備診斷或檢測(cè)兔腦炎微孢子蟲(chóng)感染試劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl為與GST融合表達(dá)的重組蛋白SWP1-GST，其中兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl的氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWPl與GST融合表達(dá)的重組蛋白SWPl-GST是通過(guò)以下方法制備得到: (1)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的兔腦炎微孢子蟲(chóng)SWPl基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在感染兔腦炎微孢子蟲(chóng)的狐貍腎臟樣品中，擴(kuò)增出編碼SEQ ID N0.1所示的孢壁蛋白SWPl的核苷酸序列，或通過(guò)序列合成的方法直接合成編碼SEQ ID N0.1所示的孢壁蛋白SWPl的核苷酸序列； (2)從PGEX-4T1載體上擴(kuò)增得到GST標(biāo)簽序列，并將其插入到PcoldIII載體的NdeI位點(diǎn)中，然后將所擴(kuò)增或合成得到的SWPl基因序列插入到pColdIII原核表達(dá)載體的XhoI和EcoRI位點(diǎn)之間，與GST標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，用GST純化樹(shù)脂純化，即得SWP1-GST。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的編碼SEQID N0.1所示的孢壁蛋白SffPl的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103728458SQ201310751122
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】賈洪林, 張彥龍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所, 東北林業(yè)大學(xué), 哈爾濱動(dòng)物生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司, 哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司