專利名稱：一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器。
背景技術(shù)：
生物傳感器是一種將生物信號轉(zhuǎn)變成電信號的儀器，通常由生物識別體系和信號傳送體系構(gòu)成。Clark教授于1956年發(fā)表了一篇關(guān)于氧電極的文章，為生物傳感器的發(fā)展奠定了重要的基礎(chǔ)。生物傳感器具有特異性生物分子識別能力，與一種敏感轉(zhuǎn)換器結(jié)合，以高的選擇性和靈敏度檢測被分析物，成為快速、靈敏檢測水體、大氣等環(huán)境中物質(zhì)的重要方法。根據(jù)生物傳感器中所用分子識別元件上的敏感物質(zhì)不同，可以將生物傳感器分為酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細(xì)胞器傳感器、免疫傳感器和DNA生物傳感器等。細(xì)菌的有氧呼吸過程和發(fā)酵過程與環(huán)境中氧氣含量息息相關(guān)，可以通過監(jiān)測細(xì)菌的生長繁殖進(jìn)而進(jìn)行生物體系氧化還原監(jiān)測，環(huán)境污染監(jiān)測。而眾所周知微生物與人類的生活密切相關(guān)，因此它們對于人類的生活有著十分重要的影響。例如，許多細(xì)菌能夠釋放出毒素使人畜致病，但是同時也有許多細(xì)菌能夠被我們?nèi)祟愃岳茫@通常稱為益生菌。目前，一般檢測細(xì)菌的方法通常是通過測定細(xì)菌的生理、形態(tài)特征或通過測定細(xì)菌的基因組成來鑒定細(xì)菌。這些方法操作起來復(fù)雜看，且需要花費很長的時間，它們已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前對微生物檢測的要求。在這種情況下，許多研究人員努力地探索新的方法，以便對細(xì)菌進(jìn)行快速地檢測。1993年Charach等人在科學(xué)上首次報導(dǎo)了利用帶有細(xì)胞表面受休的聚雙炔薄膜在與對應(yīng)的配體分子結(jié)合時，薄膜的顏色可以由藍(lán)變紅這種現(xiàn)象對流感病毒進(jìn)行了直接的比色檢測。這種親合變色現(xiàn)象引起了人們的廣泛興趣。國內(nèi)有不少單位對此進(jìn)行了研究，但是這些研究都集中于利用聚雙炔的光學(xué)性質(zhì)對細(xì)菌進(jìn)行檢測，而利用電化學(xué)的方法檢測細(xì)菌的報道還很少。大腸桿菌是人和 動物腸道中最著名的一種細(xì)菌，主要寄生于大腸內(nèi)，約占腸道菌中的1%。是一種兩端鈍圓、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌能合成維生素B和K，正常棲居條件下不致病；若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在水和食品中檢出，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)。大腸菌群數(shù)常作為飲水、食物或藥物的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。本實用新型針對大腸桿菌采用電化學(xué)檢測方法出發(fā)，開發(fā)了一種具有檢測設(shè)備簡單、體積小、反應(yīng)靈敏、檢測速度快的生物傳感器。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，從而填補(bǔ)目前市場中對于電化學(xué)檢測菌類儀器設(shè)備的空白。本實用新型解決其上述的技術(shù)問題所采用以下的技術(shù)方案:一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，其主要構(gòu)造有:樹脂片、合金膜、支撐結(jié)構(gòu)檢測層、培養(yǎng)基層、碳糊、注漿孔、銅探針、連接導(dǎo)線、智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)、玻璃試管，所述的樹脂片鍍制有一層合金膜，支撐結(jié)構(gòu)檢測層上沉積有一層培養(yǎng)基層，玻璃試管內(nèi)可灌入碳糊，其玻璃試管一口處開有注漿孔，玻璃試管兩端口各設(shè)有銅探針，銅探針通過連接導(dǎo)線與智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)相連通，智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)輸入端口還與合金膜相連通。上述的合金膜其厚度在2 4mm。上述的培養(yǎng)基層其厚度在8 15mm。上述的玻璃試管與培養(yǎng)基層接觸面處開有毛細(xì)孔。本實用新型微生物傳感器與普通利用聚雙炔的光學(xué)性質(zhì)對細(xì)菌進(jìn)行檢測方法相比具有以下優(yōu)點:解決了對細(xì)菌檢測操作復(fù)雜，且需要花費時間長的問題，提供了一種容易制備且測試操作簡單方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、響應(yīng)時間短、可定量檢測細(xì)菌濃度的生物傳感器，實現(xiàn)了對細(xì)菌的直接檢測。本實用新型可快速地對細(xì)菌進(jìn)行檢測，在醫(yī)療診斷、食品工業(yè)和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域均具有十分重要的意義。

圖1為本實用新型一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器整體結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1-樹脂片，2-合金膜，3-支撐結(jié)構(gòu)檢測層，4-培養(yǎng)基層，5-碳糊，6_注漿孔，7-銅探針，8-連接導(dǎo)線，9-智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)，10-玻璃試管。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖1對本實用新型的具體實施方式
做一個詳細(xì)的說明。實施例:一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，其主要構(gòu)造有:樹脂片1、合金膜2、支撐結(jié)構(gòu)檢測層3、培養(yǎng)基層4、碳糊5、注漿孔6、銅探針7、連接導(dǎo)線8、智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)9、玻璃試管10,所述的樹脂片I鍍制有一層合金膜2,支撐結(jié)構(gòu)檢測層3上沉積有一層培養(yǎng)基層4,玻璃試管10內(nèi)可灌入碳糊5,其玻璃試管10 —口處開有注漿孔6，玻璃試管10兩端口各設(shè)有銅探針7，銅探針7通過連接導(dǎo)線8與智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)9相連通,智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)9輸入端口還與合金膜2相連通。所述的合金膜2其厚度在2 4mm。其合金膜2采用35%的鉬金和65%的白銀所組成。所述的培養(yǎng)基層4其厚度在8 15mm。其培養(yǎng)基層4是甘露糖或唾液酸。所述的玻璃試管10與培養(yǎng)基層4接觸面處開有毛細(xì)孔。下面針對整個大腸桿菌試驗培養(yǎng)、檢測過程作一個實例的講解:[0020]一、大腸桿菌的培養(yǎng):將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅、美蘭及配置培養(yǎng)基所用的水在121°C的條件下滅菌約5小時之后，依次取出冷卻至室溫，然后將大腸桿菌(E.coli)接種到盛有牛肉蛋白胨培養(yǎng)基的試管內(nèi)。將接種后的試管放置于搖床內(nèi)，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度至37.5°C ,培養(yǎng)24h。取出滅菌后的蛋白胨、水、伊紅、美藍(lán)、培養(yǎng)基冷卻至室溫，在無菌操作平臺上將它們分別裝入平板中，最后將裝好的平板放在避光的地方以待用。二、將培養(yǎng)好的大腸桿菌稀釋后混入碳糊中:把大腸桿菌原溶液稀釋到10— 5、10— 6、10— 7，截留液稀釋到10— 5、10— 6、10— 7、10— 8，然后把上面稀釋的溶液以及留出液保存好待用。不同濃度下的稀釋后的溶液和截留液各取
0.lmL，分別放入已培養(yǎng)好的不同培養(yǎng)基上攤平。需要注意的是在整個實驗過程中，所有操作都需要在無菌室和酒精燈火焰旁邊操作。把已經(jīng)涂好的培養(yǎng)基一同放在培養(yǎng)箱中，調(diào)整培養(yǎng)箱的溫度對其進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間達(dá)到24h后，可以對培養(yǎng)基上的菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)。將石墨粉與環(huán)氧樹脂按比例混合后通過注漿孔6注入一些于玻璃試管10內(nèi)，將培養(yǎng)好的大腸桿菌與少量培養(yǎng)基、碳粉和甲基硅油混合成碳糊5，將獲得的碳糊5填充滿玻璃試管10的小腔中，制成大腸桿菌修飾的碳糊工作電極。三、設(shè)備實驗開始及其數(shù)據(jù)結(jié)論:大腸桿菌屬于兼性厭氧型細(xì)菌，在適當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液中(PBS，pH 7.0)有氧條件下進(jìn)行有氧呼吸，無氧條件下可以進(jìn)行無氧呼吸或發(fā)酵。將制備的包含細(xì)菌的碳糊5通過銅探針7電極開始工作，因智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)9與合金膜2、銅探針7電極相連通，因此當(dāng)工作電極啟動時，其智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)9通過循環(huán)伏安法可測得大腸桿菌的存在，及相關(guān) 的數(shù)量或濃度。
權(quán)利要求1.一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，其主要構(gòu)造有:樹脂片(I)、合金膜(2)、支撐結(jié)構(gòu)檢測層(3)、培養(yǎng)基層(4)、碳糊(5)、注漿孔(6)、銅探針(7)、連接導(dǎo)線(8)、智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)(9)、玻璃試管(10)，其特征在于:樹脂片(I)鍍制有一層合金膜(2)，支撐結(jié)構(gòu)檢測層(3)上沉積有一層培養(yǎng)基層(4)，玻璃試管(10)內(nèi)可灌入碳糊(5),其玻璃試管(10) — 口處開有注漿孔(6)，玻璃試管(10)兩端口各設(shè)有銅探針(7)，銅探針(7)通過連接導(dǎo)線(8)與智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)(9)相連通，智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)(9 )輸入端口還與合金膜(2 )相連通。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，其特征在于所述的合金膜(2)其厚度在2 4_。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一 種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，其特征在于所述的培養(yǎng)基層(4)其厚度在8 15mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，其特征在于所述的玻璃試管(10)與培養(yǎng)基層(4)接觸面處開有毛細(xì)孔。
專利摘要本實用新型涉及一種微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種檢測大腸桿菌的生物傳感器。一種快速檢測大腸桿菌的一體化薄膜生物傳感器，所述的樹脂片鍍制有一層合金膜，支撐結(jié)構(gòu)檢測層上沉積有一層培養(yǎng)基層，玻璃試管內(nèi)可灌入碳糊，其玻璃試管一口處開有注漿孔，玻璃試管兩端口各設(shè)有銅探針，銅探針通過連接導(dǎo)線與智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)相連通，智能循環(huán)伏安掃描一體機(jī)輸入端口還與合金膜相連通。本實用新型解決了對細(xì)菌檢測操作復(fù)雜，且需要花費時間長的問題，提供了一種容易制備且測試操作簡單方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、響應(yīng)時間短、可定量檢測細(xì)菌濃度的生物傳感器，實現(xiàn)了對細(xì)菌的直接檢測。
文檔編號G01N27/48GK203117162SQ20132016142
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者徐云鵬, 燕春暉 申請人:徐云鵬