檢測伏馬毒素b1殘留的膠體金試紙卡的制作方法
【專利摘要】本實用新型提供了一種檢測伏馬毒素B1殘留的膠體金試紙卡,包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊,結(jié)合物釋放墊的部分區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下。本實用新型試紙卡樣品吸收墊可以將檢測液體充分吸收,與結(jié)合物釋放墊上噴涂的金標(biāo)抗體完全接觸充分反應(yīng),再層析至反應(yīng)膜上進(jìn)行反應(yīng),可以有效的減少誤差,操作簡便快速、結(jié)果顯示形象直觀準(zhǔn)確、成本低,靈敏度高。
【專利說明】檢測伏馬毒素BI殘留的膠體金試紙卡
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及一種檢測伏馬毒素BI的膠體金試紙卡。
【背景技術(shù)】
[0002]伏馬毒素BI (Fumonisins)是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素,目前已知有28種衍生物,分為A、B、C、P四類。其中以FBl最為常見,在自然污染的玉米中,以伏馬毒素BI量最多,約占伏馬毒素總量的70%。伏馬毒素BI與馬腦白質(zhì)軟化癥、豬的肺水腫癥侯群以及人類食道癌等人畜疾病有關(guān)。另外,伏馬毒素BI還是一種慢性促癌劑,能引起靈長類動物的動脈粥樣硬化樣改變。
[0003]國內(nèi)外已建立了多種伏馬毒素的檢測方法,已經(jīng)應(yīng)用的有高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管氣相色譜法(GC)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)、液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)及酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)等方法。其中高效液相色譜法(HPLC),靈敏度高,在全球范圍內(nèi)的玉米及其制品的調(diào)查中,90%以上的實驗室用的都是HPLC法,其檢測限可以達(dá)到
0.05?0.lmg/kg。但是,該法需要對檢測樣品進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理,儀器化程度高且價格昂貴,分析速度慢,同時要求有專業(yè)的操作人員,不利于在基層推廣使用及大量樣本篩選。免疫學(xué)技術(shù)具有敏感、特異、簡便的特點,近年來已被應(yīng)用于伏馬毒素BI殘留檢測。膠體金免疫層析法檢測時間短,穩(wěn)定性好、操作簡便、無需其他儀器設(shè)備,結(jié)果判斷直觀可靠,適用于進(jìn)行現(xiàn)場快速篩選。
實用新型內(nèi)容
[0004]本實用新型的目的在于針對上述不足提供一種靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好、操作簡單、檢測時間短、檢測伏馬毒素BI的試紙卡。
[0005]本實用新型的試紙卡包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊,結(jié)合物釋放墊不是完全覆蓋在樣品吸收墊之下,而是部分區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下,優(yōu)選結(jié)合物釋放墊的三分之二區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下。這樣可以延長檢測結(jié)果觀察時間,樣品吸收墊也可以將檢測液體充分吸收,與金標(biāo)抗體完全接觸充分反應(yīng),再層析至反應(yīng)膜上進(jìn)行反應(yīng),可以有效的減少誤差,還可以防止檢測樣本中一些干擾成份使金標(biāo)抗體中的蛋白失去活性,影響金標(biāo)抗體與包被原的結(jié)合。
[0006]所述反應(yīng)膜上分別包被有伏馬毒素BI半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡。
[0007]本實用新型試紙卡的底板為PVC板或其它硬質(zhì)不吸水的材料;反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜;樣品吸收墊由聚酯材料或玻璃棉制成;吸水墊為吸水紙;結(jié)合物釋放墊由纖維制成,結(jié)合物釋放墊噴涂有伏馬毒素BI單克隆抗體-膠體金結(jié)合物。
[0008]偶聯(lián)伏馬毒素BI半抗原的載體蛋白可用牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白等,在反應(yīng)膜上的檢測線印跡和質(zhì)控線印跡相互平行且與樣品液流動方向垂直,檢測線印跡位于靠近結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè),質(zhì)控線印跡位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)。
[0009]本實用新型試紙卡具有如下有益效果:
[0010]1.靈敏度高。伏馬毒素BI藥物快速檢測試紙卡以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成,金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成,二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合,膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小,且具有較高的標(biāo)記率。因此,快速檢測試紙卡具有較高的靈敏度,本試紙卡對樣品的檢測限為20μ g/kg。
[0011]2.操作簡便快速。使用快速檢測試紙卡時無需任何其它試劑,只要將樣品前處理后用滴管滴入試紙卡孔內(nèi),滴加2?3滴,加樣后計時,7?IOmin內(nèi)觀察結(jié)果。
[0012]3.成本低,投資少。使用快速檢測試紙卡,不需另配儀器設(shè)備及其他試劑,使現(xiàn)場檢測一步到位,成本低廉,投資少,見效快。
[0013]4.顯示檢測結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確??焖贆z測試紙卡以顯示紅線印跡作為試紙卡的陽性和陰性標(biāo)記,即在硝酸纖維素膜上只有質(zhì)控線顯示紅色表示在被檢測樣品液中伏馬毒素BI濃度高于檢測限,檢測線和質(zhì)控線均顯示紅色表示在被檢測樣品中不含伏馬毒素BI或其濃度低于檢測限,結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確、簡單明了,不容易出現(xiàn)誤判。
[0014]5.易于大范圍推廣應(yīng)用。快速檢測試紙卡操作簡單,檢測范圍廣,能較好滿足不同層次人員的需要,具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為伏馬毒素BI快速檢測試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖,其中,1、樣品吸收墊;2、結(jié)合物釋放墊;3、反應(yīng)膜;4、吸水墊;5、檢測線;6、質(zhì)控線;7、底板;
[0016]圖2為伏馬毒素BI快速檢測試紙卡陰性(圖2a)、陽性(圖2b)、無效(圖2c)顯色示意圖,其中T為檢測線,C為質(zhì)控線。
【具體實施方式】
[0017]參見圖1:樣品吸收墊I用聚酯材料制成,結(jié)合物釋放墊2由纖維制成吸附有伏馬毒素BI單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物,反應(yīng)膜3為硝酸纖維素膜,吸水墊4為吸水材料制成,檢測線5包被有伏馬毒素BI半抗原一載體蛋白偶聯(lián)物,質(zhì)控線6包被有羊抗鼠抗抗體,底板7為PVC背襯,在PVC背襯上按順序粘附反應(yīng)膜、吸水墊、結(jié)合物釋放墊和樣品墊,將結(jié)合物釋放墊三分之二區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊下。
[0018]要制成伏馬毒素BI快速檢測試紙卡首先需制備伏馬毒素BI半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物,用于制備檢測線;制備膠體金,用于制備金標(biāo)抗體;制備羊抗鼠抗抗體,用于制作質(zhì)控線。以下是相關(guān)材料的制備方法:
[0019]1.伏馬毒素BI半抗原
[0020]36mg伏馬毒素和Iml 二甲基亞砜(DMSO)的混合液,室溫下緩慢滴加入到14mg對苯二甲醛的Iml DMSO溶液中,滴加完畢后室溫至60°C反應(yīng)2-4小時,除去溶劑,柱層析純化得到伏馬毒素對苯二甲醛單縮合物。
[0021]2.伏馬毒素BI半抗原-載體蛋白的偶聯(lián)
[0022]I)免疫原的制備
[0023]取半抗原13mg溶解于0.8ml 二甲基甲酰胺(DMF)中得到溶液I ;取牛血清白蛋白(BSA)36mg使之充分溶解在3.2ml0.lmol/L的CB (pH9.6)溶液中得到溶液II,將溶液I逐滴緩慢滴加到溶液II中,并于室溫攪拌反應(yīng)24h,用0.0lmol/L的PBS在4°C下透析三天,每天更換三次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì);分裝,于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0024]2)包被原的制備
[0025]將BSA換為卵清蛋白(OVA)按上述方法制備得到包被原。
[0026]3.抗伏馬毒素BI藥物單克隆抗體的制備
[0027]( I)動物免疫
[0028]將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi),免疫劑量為100 μ g/只,使其產(chǎn)生抗血清。
[0029](2)細(xì)胞融合和克隆化
[0030]小鼠血清測定結(jié)果較高后,取其脾細(xì)胞,按8:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液,篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化,直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0031](3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
[0032]將伏馬毒素BI單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成I X IO6個/ml的細(xì)胞懸液,在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管,立即放入37°C水浴中速融,離心去除凍存液后,移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0033](4)單克隆抗體的制備與純化
[0034]將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只,7天后腹腔注射伏馬毒素BI的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X IO6個/只,7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化,-20°C保存。
[0035]4.羊抗鼠抗抗體的制備
[0036]以山羊作為免疫動物,以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫,得到羊抗鼠抗抗體。
[0037]5.伏馬毒素BI單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0038]5.1膠體金的制備
[0039]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%,取IOOml置于錐形瓶中,置恒溫電磁攪拌器上攪拌煮沸,在持續(xù)攪拌下每IOOml0.01%氯金酸加入1.25ml 1%檸檬酸三鈉,繼續(xù)煮沸,至液體呈透亮的紅色時停止加熱,冷卻至室溫后補足失水,4°C保存。
[0040]5.2伏馬毒素BI單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0041]在磁力攪拌下,用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7.0,按每毫升膠體金溶液加入20?50 μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入伏馬毒素BI單克隆抗體,繼續(xù)攪拌混勻30min,加入10%BSA至終濃度為1% (體積百分含量),靜置lOmin。12000rpm、4°C離心30min,棄上清液,沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次,用初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸,置4°C備用。
[0042]復(fù)溶緩沖液:含酪蛋白0.02%?0.1%、吐溫-200.05%?0.2% (質(zhì)量百分含量)、ρΗ7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0043]6.伏馬毒素BI快速檢測試紙卡檢測操作方法
[0044]6.1樣本前處理
[0045]稱取4.0g±0.05g粉碎的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中,加入3g NaCl,5ml甲醇和5ml去離子水,用渦旋儀渦動3min ;室溫(20-25) V 3000g以上離心5min ;移取100 μ I上清液與200 μ I樣本復(fù)溶液(0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液)混勻后待檢。
[0046]6.2用試紙卡檢測
[0047]用吸管吸取稀釋后的待檢樣品溶液滴加入試紙卡加樣孔內(nèi),滴加2?3滴,加后計時,反應(yīng)7?IOmin觀察結(jié)果。
[0048]6.3檢測結(jié)果分析
[0049]伏馬毒素BI在樣本中的含量高于或等于試紙卡對其的最低檢測限時,伏馬毒素BI單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與伏馬毒素BI結(jié)合,金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點被封閉,從而在檢測區(qū)內(nèi)因為競爭反應(yīng),不會與伏馬毒素BI半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng),將會在檢測線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶。如圖2所示。
[0050]陰性:當(dāng)質(zhì)控線顯示一條紅色條帶,檢測線同時也顯示出一條紅色條帶,判為陰性,如圖2a所示。
[0051]陽性;當(dāng)質(zhì)控線顯示一條紅色條帶,而檢測線不顯色,判為陽性,如圖2b所示。
[0052]無效:當(dāng)質(zhì)控線不顯示出紅色條帶,則無論檢測線顯示出紅色條帶與否,該試紙卡判為無效,如圖2c所示。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測伏馬毒素BI殘留的膠體金試紙卡,包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水墊,其特征在于,結(jié)合物釋放墊的部分區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下;所述反應(yīng)膜上具有包被有伏馬毒素BI半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線印跡和包被羊抗鼠抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線印跡,所述的結(jié)合物釋放墊噴涂有伏馬毒素BI單克隆抗體-膠體金結(jié)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的試紙卡,其特征在于,所述的檢測線印跡與質(zhì)控線印跡平行。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試紙卡,其特征在于,檢測線印跡位于靠近結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè),質(zhì)控線印跡位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的試紙卡,其特征在于,所述底板為PVC底板或其它硬質(zhì)不吸水的材料,所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜,所述結(jié)合物釋放墊由纖維制成,所述樣品吸收墊由玻璃棉或聚酷材料制成,所述吸水塾為吸水紙。
【文檔編號】G01N33/577GK203535052SQ201320366577
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月25日
【發(fā)明者】萬宇平, 馮才茂, 扶勝, 馮靜, 尚朋朋, 彭鴿, 孫震 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司