表征聚合物的裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種裝置，其包括（a）多個腔室，每個腔室與相鄰的腔室通過至少一個孔連通，其中所述裝置含有被定義為第一孔和第二孔的至少兩個孔，（b）用于將所述聚合物的至少一部分從所述第一孔移出并移入所述第二孔的裝置，以及（c）至少一個傳感器，所述傳感器能夠在所述聚合物移動通過所述第一孔和第二孔期間識別所述聚合物的單個成分，條件是當僅使用單個傳感器時，所述單個傳感器不包括設置在一個孔的兩端用來測量通過該孔的離子電流的兩個電極。本發(fā)明還公開了使用該裝置的方法。
【專利說明】表征聚合物的裝置
[0001]背景
納米孔是納米級通道，其在脂質(zhì)膜中天然地形成為蛋白通道(生物學孔)，或通過在固態(tài)基質(zhì)中鉆出或蝕刻出開口而形成(固態(tài)孔)。當這種納米孔被用在包含兩個腔室(由該納米孔隔開)的納米裝置中時，可利用敏感型膜片鉗放大器來施加跨膜電壓并測定通過該孔的離子電流。
[0002]納米孔為廉價的全基因組DNA測序提供了良好的前景。在這個方面，單個DNA分子可被捕獲并通過電泳驅(qū)動通過該孔，每次捕獲事件都被檢測為離子電流的暫時改變。因而,DNA分子的序列可從DNA通過該孔通道時被改變的離子電流記錄內(nèi)的圖表(pattern)中推知。
[0003]原則上，納米孔測序器可不需要樣品擴增，不需使用測序操作期間實現(xiàn)催化功能的酶和試劑，并且不需要用于檢測測序進度的光學儀器，這些中的某一些或全部是常規(guī)的合成法測序所需要的。
[0004]電子納米孔傳感器可被用來檢測不超過血液樣品或唾液樣品中可獲得的DNA濃度/體積。此外，納米孔有希望急劇增加被測序DNA的讀取長度(從450個堿基增加至大于10000個堿基)。
[0005]納米孔測序的兩個主要障礙是:(1)對從頭測序而言，缺乏足以精確確定核酸中每個核苷酸的特性的敏感度(缺乏單核苷酸敏感度)；和(2)檢測期間調(diào)節(jié)每個核苷酸單元通過納米孔的輸送速率的能力。雖然很多研究小組正在開發(fā)和改善納米孔以解決障礙I，但沒有一種方法能在不涉及使用酶或光學儀器的情況下解決障礙2，酶和光學儀器僅在特殊的納米孔技術中有作用，并且與純電子方法相比，它們造成更高的復雜性和成本。
[0006]概述
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種裝置，其包括(a)多個腔室，每個腔室通過至少一個孔與相鄰腔室連通，其中所述裝置含有至少兩個孔，即第一孔和第二孔，(b)用于從第一孔移出至少一部分聚合物到第二孔中的裝置，以及(C)至少一個傳感器，所述傳感器能夠在聚合物經(jīng)過第一孔和第二孔的移動期間識別聚合物的單個成分，但當僅使用單個傳感器時，該單個傳感器不包括位于孔的兩端、用于測量經(jīng)過孔的離子電流的兩個電極。
[0007]在一個實施方式中，第一孔和第二孔的直徑為約I nm至約100 nm，并且彼此間隔約 10 nm 至約 10000 nm。
[0008]在一個實施方式中，傳感器被配置成通過測定與聚合物或聚合物的一個或多個成分相關的電流、電壓、pH、光學特征或駐留時間來識別該聚合物。
[0009]在一個實施方式中，傳感器被配置成形成隧道間隙(tunnel gap)，以當聚合物被加載在第一孔和第二孔時允許聚合物通過該隧道間隙。
[0010]在一個實施方式中，傳感器包括膜，該膜具有形成該隧道間隙的孔。在一個實施方式中，孔是實質(zhì)上圓形的。
[0011]在一個實施方式中，傳感器包括兩個端部，在兩個端部之間形成隧道間隙。
[0012]在一個實施方式中，傳感器包括一個端部和一個實質(zhì)上平坦的表面，在該端部和表面之間形成隧道間隙。在一個實施方式中，傳感器包括兩個電極，這兩個電極被間隔開以在它們之間形成隧道間隙。
[0013]在一個實施方式中,傳感器被放置在第一孔內(nèi)。在另一個實施方式中，傳感器被放置在第一孔和第二孔之間的腔室內(nèi)。在一個實施方式中，提供一種裝置，其中傳感器與第一孔和第二孔對準。
[0014]在一個實施方式中，傳感器包含金、鉬、石墨烯或碳。
[0015]在一個實施方式中，所述隧道間隙為約I nm至約50 nm寬。
[0016]在一個實施方式中，傳感器包括經(jīng)試劑改性的表面。在一個實施方式中，該試劑能夠與聚合物的單元(例如核苷酸)形成非共價鍵。在一個實施方式中，該鍵為氫鍵。在另一個實施方式中，該鍵選自離子鍵、金屬鍵、堆積作用、或范德華相互作用。
[0017]在一個實施方式中，該試劑通過游離酰胺形成氫鍵。這些試劑的非限制性例子為4-巰基苯甲酰胺和1-H-咪唑-2-甲酰胺。在另一個實施方式中，氫鍵通過羧酸形成，例如巰基苯甲酸。在另一個實施方式中，氫鍵通過羥基或醇(例如巰基苯甲醇)形成。
[0018]在一個實施方式中，該試劑利用電荷-電荷相互作用與例如膦酸鹽形成離子鍵，該膦酸鹽與聚合物的帶正電的單元相互作用。
[0019]在一個實施方式中，第一孔和第二孔基本上是共軸的。
[0020]在一個實施方式中，所述裝置包括選自以下的材料:硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳納米管、TiO2, HfO2, Al2O3、金屬層、玻璃、生物納米孔、氧化鉿(HfO2)、具有生物插入孔的膜以及它們的組合。
[0021]在一個實施方式中，第一孔和第二孔為約0.3 nm至約100 nm深。
[0022]在一個實施方式中，所述裝置包括至少兩個電極，用于連接至電源從而在第一孔和第二孔上產(chǎn)生電壓。在一個實施方式中，橫跨第一孔和橫跨第二孔的電壓是獨立可調(diào)的。
[0023]在一個實施方式中，本發(fā)明還提供一種確定多核苷酸的序列的方法，其包括:
(a)加載包含多核苷酸的樣品，
(b)調(diào)節(jié)橫跨第一孔和橫跨第二孔的電壓，從而使所述多核苷酸橫跨兩個孔，其中該多核苷酸以相同的方向移動通過這兩個孔，以及
(c )使用傳感器識別所述多核苷酸的多個核苷酸。
[0024]在一個實施方式中，本發(fā)明還提供一種確定多肽的序列的方法，其包括:
(a)加載包含多肽的樣品，
(b)調(diào)節(jié)橫跨第一孔和橫跨第二孔的電壓，從而使所述多肽橫跨兩個孔，其中該多肽以相同的方向移動通過這兩個孔，以及
(C)使用傳感器識別所述多肽的多個氨基酸。
[0025]附圖簡述
以本發(fā)明的實施方式形式提供的附圖僅是對本發(fā)明示例性的說明，而并非限制，其
中:
圖1-8圖示了具有分離出多個腔室的至少兩個孔的裝置。
[0026]具體而言，圖1是雙孔芯片以及用于實現(xiàn)每個孔的獨立的電壓控制(K,，V2)和電流(/7，厶)測量的雙放大器電子構造的示意圖。圖中顯示有三個腔室A-C，它們除共用孔外在體積上是分離的。合適的芯片參數(shù)例如是，孔間距離10-500 nm，膜厚0.3-50 nm，孔徑1-100 nm。
[0027]圖2是電氣部分的示意圖,通過構建出使所有接入電阻(access resistance)最小化從而有效解耦I1和I2的裝置，V1和V2可主要通過每個納米孔電阻。
[0028]在圖3中使用競爭電壓作為對照，藍色箭頭顯示每個電壓作用力(voltageforce)的方向。假設孔具有相同的電壓作用力影響，使用|Κ7| = \V2\ + ?/Κ，值?/V > O ?O)被調(diào)節(jié)用于K7(G)方向的通道移動。實際操作時，雖然每個孔處的電壓誘導的作用不會等同于K7 = ^但校準實驗可確定出對于既定的雙孔芯片導致產(chǎn)生相等推動力所需的偏壓，并且該偏壓的上下變動隨后可被用于方向控制。
[0029]圖4至7圖示了用于各種不同的傳感器放置構造。具體而言，圖4顯示包含兩個電極的傳感器可被放置在孔內(nèi)。圖5顯示顯示包括兩個電極的傳感器可被放置在孔的出口處。圖6顯示包括兩個電極的傳感器可被放置在兩個孔之間。圖7顯示傳感器被放置在兩個孔之間，傳感器具有兩個電極，其中一個電極是平整的表面。
[0030]圖8顯示了膜形式的傳感器可具有允許聚合物通過的孔。
[0031]圖9顯示具有腔室Α、腔室B和腔室C的雙孔外罩裝置的外部視圖，每個腔室具有一個用于流體獲取和樣品加載的開口。一個雙孔芯片被放置在兩個墊圈之間，每個墊圈構成外罩裝置的每個部件的一部分，兩個部件繞鉸鏈(中間頂部)轉動從而圍繞芯片打開和關閉外罩。
[0032]這些圖中的某一些或全部是示意性說明的示例；因此，它們不必然圖示了所顯示的元件的實際相對尺 寸或位置。這些圖僅為解釋一個或多個實施方式而提供，要清楚地理解的是，它們不被用于限制本發(fā)明權利要求的范圍或涵義。
[0033]詳細描述
在本申請中，文本是指本發(fā)明營養(yǎng)物、組合物和方法的各種實施方式。所描述的各種實施方式用于提供多個解釋性的例子，而不應當被解釋為替代方式的描述。但是，要注意的是，本文提供的各種實施方式的描述可能在范圍上會重疊。本文描述的實施方式僅是解釋性的，而不意在限制本發(fā)明的范圍。
[0034]而且，在本申請中，通過識別引用參考了各種公開文獻、專利和公開的專利說明書。這些公開文獻、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容通過引用被合并至本文中，以更加充分地描述本發(fā)明所屬領域的技術狀態(tài)。
[0035]如在說明書和權利要求中所使用的，單數(shù)形式“一個”和“該”，除非另有明確說明，否則都包括復數(shù)引用。例如，術語“一個電極”包括多個電極(包括其混合形式)。
[0036]如本文所使用的，術語“包括”意指裝置和方法包括所引述的部件或步驟，但不排除其他內(nèi)容?！皩嵸|(zhì)上由…組成”，當被用來定義裝置和方法時，是指排除對于組合有任何實質(zhì)性意義的其他部件或步驟?！坝伞M成”是指排除其他部件或步驟。由這些過渡術語的每一個界定的實施方式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0037]所有數(shù)字表示(包括范圍值)，例如距離、尺寸、溫度、時間、電壓和濃度，都是近似值，其可上(+)下(-)變化0.1。要理解的是，即使并非總是明確說明，但所有數(shù)字表示之前都有術語“約”。還要理解的是，即使并非總是明確說明，但本文所述的部件僅是示例性的，并且這些部件的等同體在本領域是已知的。
[0038]檢測聚合物的裝置 本發(fā)明的一個實施方式提供了一種包括多個腔室的裝置，每個腔室通過至少一個孔與相鄰腔室連通。在這些孔中，兩個孔(即第一孔和第二孔)被設置成允許聚合物的至少一部分從第一孔移出并進入到第二孔。而且，該裝置包括能夠在移動期間識別聚合物的傳感器。在一個方面，所述識別需要識別出聚合物的單個成分。優(yōu)選地，當使用單個傳感器時，該單個傳感器不包括設置在孔的兩端以測量通過孔的離子電流的兩個電極。
[0039]在一個方面，該裝置包括由兩個孔相連的三個腔室。具有多于三個腔室的裝置可容易被設計，以在三腔室裝置的任何一側或三個腔室的任何兩個腔室之間包括一個或多個額外的腔室。類似地，該裝置可包括多于兩個的孔以連接這些腔室。
[0040]在一個方面，相鄰兩個腔室之間可具有兩個或更多個孔，以允許多種聚合物同時從一個腔室移動到另一個腔室。這種多孔涉及可提高該裝置中的聚合物分析的處理量。
[0041]在某些方面，該裝置還包括使聚合物從一個腔室移動到另一個腔室的器件。在一個方面，該移動導致同時在第一孔上和第二孔上加載樣品。在另一個方面，該器件進一步使得聚合物以相同的方向移動通過這兩個孔。
[0042]例如，在一個三腔室雙孔裝置(“雙孔”裝置)中，每個腔室可包含用于連接至電源的電極，因而腔室之間的每個孔都設立了單獨的電壓。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，其提供了一種包含上腔室、中腔室和下腔室的裝置，其中上腔室通過第一孔與中腔室連通，中腔室通過第二孔與下腔室連通。
[0043]參考圖1，該裝置包括上腔室(腔室A)、中腔室(腔室B)和下腔室(腔室C)。這些腔室由兩個分隔層或分隔膜(101和102)分隔開，每個分隔層或分隔膜具有獨立的孔(111和112)。而且，每個腔室含有用于連接至電源的電極(121、122和123)。明顯地，上、中和下腔室的標注是相對來說的，并不表示，例如，上腔室相對于地面被設置在中腔室或下腔室之上,或者反之亦然。
[0044]每個孔(111和112)獨立地具有允許小分子或大分子或微生物體通過的尺寸。在一個方面，每個孔的直徑為至少約I nm?；蛘?每個孔的直徑為至少約2 nm、3 nm、4 nm、5nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm、10 nm、ll nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nm、
19nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm 或 100nm。
[0045]在一個方面，孔的直徑不超過約100 nm?；蛘?，孔的直徑不超過約95 nm、90 nm、85 nm、80 nm、75 nm、70 nm、65 nm、60 nm、55 nm、50 nm、45 nm、40 nm、35 nm、30 nm、25 nm、
20nm、15 或 10 nm。
[0046]在一個方面，孔的直徑為約I nm至約100 nm，或約2 nm至約80 nm，或約3 nm至約70 nm，或約4 nm至約60 nm，或約5 nm至約50 nm，或約10 nm至約40 nm，或約15 nm至約30 nm。
[0047]在某些方法，孔具有實質(zhì)上圓形的形狀。本文使用的“實質(zhì)上圓形”是指至少約80%或90%是圓柱形形式。在一些實施方式中，該孔是方形的、矩形的、三角形的、橢圓形的或六角形的。
[0048]每個孔(111和112)獨立地具有深度。在一個方面，每個孔的深度為至少約0.3nm?；蛘?，每個孔的深度為至少約 0.6 nm、l nm、2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9nm、10 nm、ll nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nm、19 nm、20 nm、25 nm、30nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm 或90 nm。
[0049]在一個方面，每個孔的深度不超過約100 nm?；蛘撸撋疃炔怀^約95 nm、90 nm、85 nm、80 nm、75 nm、70 nm、65 nm、60 nm、55 nm、50 nm、45 nm、40 nm、35 nm、30 nm、25 nm、
20nm、15 或 10 nm。
[0050]在一個方面，該孔的深度為約I nm至約100 nm,或約2 nm至約80 nm,或約3 nm至約70 nm,或約4 nm至約60 nm,或約5 nm至約50 nm,或約10 nm至約40 nm,或約15nm 至約 30 nm。
[0051]在一個方面，孔以約10 nm至約10000 nm的距離間隔開。在一個方面，該距離為至少約 10 nm,或至少約 20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、150nm、200 nm、250 nm或300 nm。在另一個方面，該距離不超過約約10000 nm、5000 nm、2000nm、1000 nm、900 nm、800 nm、700 nm、600 nm、500 nm、400 nm、300 nm、250 nm、200 nm、150nm或100 nm。在又一個方面，該距離為約20 nm至約800 nm,約30 nm至約700 nm,約40nm至約500 nm,或約50 nm至約300 nm。
[0052]這兩個孔可被設置在任何位置，只要它們允許腔室之間的流體連通并在它們之間具有所規(guī)定的尺寸和距離。在一個方面，孔被設置得使得沒有阻礙正好位于它們之間。在另一方面，孔是實質(zhì)上共軸的，如圖1所示。
[0053]在一個方面，該裝置通過腔室內(nèi)的電極被連接至一個或多個電源。在某些方面，電源由電壓鉗或膜片鉗構成，以將電壓供應通過每個孔，其也可獨立測量通過每個孔的電流。在這方面，電源可將中腔室設定為兩個電壓源的共同接地點。在一個方面，電源被配置成在上腔室(例如圖1中的腔室A)和中腔室(例如圖1中的腔室B)之間提供第一電壓，在中腔室和下腔室(例如圖1中的腔室C)之間提供第二電壓。
[0054]在某些方面，第一電壓和第二電壓可被各自調(diào)節(jié)。在一個方面，中腔室被調(diào)節(jié)成相對這兩個電壓的接地點(如圖1-3所示)。在一個方面，中腔室包含用于在每個孔和中腔室中電極之間提供傳導性的介質(zhì)。在一個方面，中腔室包含在每個孔與中腔室中電極之間提供電阻的介質(zhì)。保持這種電阻相對納米孔電阻足夠地小，對于解耦通過孔的兩個電壓和電流是有用的，這有助于電壓的獨立調(diào)節(jié)。
[0055]電壓的調(diào)節(jié)可用來控制帶電顆粒在腔室內(nèi)的移動。例如，當兩個電壓被設置成在相同方向，帶適當電荷的顆?？蓮纳锨皇野错樞蛞苿又林星皇液拖虑皇?，或按相反順序移動。在其他方面，帶電顆?？捎缮锨皇一蛳虑皇乙苿又林星皇也⒈３衷谀抢?。
[0056]裝置中電壓的調(diào)節(jié)可特別用于控制大分子的移動，例如帶電聚合物，該大分子足夠地長從而可同時通過兩個孔。在這個方面，分子的移動和移動速率可受電壓的相對幅值和方向的控制，這將在下文進一步描述。
[0057]該裝置可含有適合保持液態(tài)樣品(特別是生物學樣品)的材料和/或適合納米制造的材料。在一個方面，這種材料包括介電材料，例如但不限于，硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳納米管、Ti02、HfO2> Al2O3或其他金屬層，或這些材料的任何組合。例如，單層石墨烯形成約0.3 nm厚的膜，且可被用作含孔膜。在另一個方面，可使用氧化鉿(HfO2)膜。
[0058]具有雙孔微流體芯片器件的微流體裝置可通過多種手段和方法制造。對于包括兩個平行膜的微流體芯片，兩個膜可通過單個束被同時鉆孔以形成兩個同心孔，但在膜的每一側上使用不同的束并結合任何適當?shù)膶始夹g也是可行的。一般而言，外罩確保腔室A-C的密封隔離。在一個方面，外罩會在電壓電極(兩個電壓源和一個接地)和納米孔之間提供最小的接入電阻，以確保每個電壓主要被施加至每個孔上。
[0059]在一個方面，圖9顯示了該裝置另一個實施方式的外部視圖。在圖9中，該裝置含有微流體芯片(標記為“雙核芯片”)，其包括由間隔元件連接的兩個平行的膜。每個膜含有由穿過膜中心的單個光束鉆成的孔(未顯示)。而且，該裝置優(yōu)選具有用于芯片的Teflon?外罩。該外罩確保腔室A-C的密封隔離，并為電解質(zhì)提供最小的接入電阻，從而確保每個電壓主要被施加至每個孔上。
[0060]更具體地，含孔膜可利用具有5-100 nm厚的硅、氮化硅或二氧化硅窗口的TEM(透射電鏡)柵極來制造。可利用間隔元件來隔開膜，利用絕緣體(SU-8、光阻材料、PECVD氧化物、ALD氧化物、ALD氧化鋁)或蒸發(fā)金屬(Ag、Au、Pt)材料，并占據(jù)膜間的腔室B的液態(tài)部分內(nèi)的很小體積。保持器位于液體浴內(nèi)，該液體浴包含了腔室B的最大體積分數(shù)。腔室A和C可通過通向膜密封件的較大直徑通道(以實現(xiàn)低接入電阻)來進入。
[0061]聚焦電子束或離子束可被用來在膜上鉆孔，并自然將它們對其。這些孔這通過向各層施加正確的束聚焦而被蝕刻(收縮)至較小尺寸。任何單納米孔鉆孔方法也可被用來在兩個膜上鉆出一對孔，并考慮對于給定方法可行的鉆孔深度以及膜的厚度。也可以先鉆出具有規(guī)定厚度的微孔，然后再鉆出穿過該膜的納米孔，從而進一步改善膜厚度。
[0062]在另一個方面，向固態(tài)納米孔插入生物學納米孔以形成混合孔，可被用于雙孔法中的任何一個或兩個納米孔(Hall et al., Nat.Nanotech., 5 (12): 874 - 7, 2010)。生物學孔可增加離子電流測量的敏感度，并且在單鏈多核苷酸在該雙孔裝置中被捕獲和控制以用于例如測序時是有用的。
[0063]利用該裝置控制分子的移動
通過存在于該裝置的孔處的電壓，帶電分子可移動通過腔室間的孔。移動的速度和方向可通過電壓的幅值和方向來控制。而且，因為兩個電壓的每一個都可獨立被調(diào)節(jié)，帶電分子的移動和速度可在每個腔室內(nèi)被精細地控制。
[0064]例如，該裝置可被用來以受控的方式混合兩個帶正電的分子。為此，第一個分子最初被加載在上腔室，第二個分子被加載在下腔室。通過第一孔的第一電壓可誘導第一分子從上腔室移動到中腔室。類似地，第二電壓(與第一電壓方向相反)可誘導第二分子從下腔室移動到中腔室。由于電壓的方向相反，兩個分子會被保持在中腔室中從而彼此反應。而且，通過調(diào)節(jié)電壓的相對幅值，每個分子的流入速度被精確調(diào)控，從而產(chǎn)生受控的反應。
[0065]另一個例子涉及帶電聚合物，例如多核苷酸，其長度大于包括兩個孔的深度以及兩孔之間距離的總距離。例如，1000 bp dsDNA為約340 nm長,遠長于間隔20 nm的兩個10 nm長孔的跨度40 nm。在第一步驟中，多核苷酸被加載到上腔室或下腔室的任何一個中。由于在生理條件下(pH約7.4)其帶負電，多核苷酸可被移動通過施加了電壓的孔。因此，在第二步驟中，兩個方向相同且幅值相同或相似的電壓被施加至孔上以誘導多核苷酸按順序移動通過兩個孔。
[0066]大約在多核苷酸達到第二孔的時間，其中一個或兩個電壓可被改變。因為兩孔之間的距離被選擇成短于多核苷酸的長度，當多核苷酸到達第二孔時，其也位于第一孔內(nèi)。因此，在第一孔的電壓方向的迅速改變，會產(chǎn)生一個拉動多核苷酸離開第二孔的作用力(如圖3所示)。[0067]如果此時第一孔處的電壓誘導的作用力的幅度小于第二孔處的電壓誘導的作用力的幅度，那么多核苷酸將繼續(xù)朝第二孔通過兩個孔，但速度降低。在這點上，容易意識到，多核苷酸移動的速度和方向可受兩個電壓的方向和幅值的控制。如下文將進一步描述的，這種移動的精細控制具有廣泛的應用。
[0068]因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種控制帶電聚合物移動通過孔的方法。該方法包括(a)將包含帶電聚合物的樣品加載到上述實施方式的任何一個的裝置的上腔室、中腔室或下腔室中，其中該裝置被連接至電源，用于在上腔室和中腔室之間提供第一電壓，并在中腔室和下腔室之間提供第二電壓；(b)設置初始第一電壓和初始第二電壓，使得聚合物在腔室之間移動，從而將聚合物定位成穿過第一孔和第二孔；和((3)調(diào)節(jié)第一電壓和第二電壓使得兩個電壓產(chǎn)生作用力，拉動帶電聚合物離開中間腔室(電壓競爭模式)，其中所述兩個電壓的幅值在受控條件下不同，因而帶電聚合物以任一個方向和受控方式移動通過兩個孔。
[0069]為在步驟(C)中建立電壓競爭模式，為所使用的每個雙孔裝置確定每個孔處的每個電壓施加的相對作用力，這可通過觀察不同電壓值對多核苷酸移動的影響而利用校準實驗來進行(移動可通過感測多核苷酸中位置已知的且可檢測的特征來測定，這種特征的例子將在下文詳細描述)。例如，如果每個共同電壓的作用力是相等的，那么在每個孔處使用相同電壓值(上腔室和下腔室相對接地的中腔室具有相同極性)在缺乏熱騷動的情況下產(chǎn)生零凈移動(布朗運動的存在和影響在下文描述)。如果每個共同電壓的作用力不相等，那么實現(xiàn)相等作用力要求在于共同電壓時具有較弱作用力的孔處識別和使用較大的電壓。每個雙孔裝置需要校準電壓競爭模式，并且對于通過每個孔的特征影響作用力的特定的帶電聚合物或分子而言也需要校準電壓競爭模式。
[0070]在一個方面，含有帶電聚合物的樣品被加載到上腔室，并且初始第一電壓被設置成從上腔室拉動帶電聚合物到中腔室，初始第二電壓被設置成從中腔室拉動聚合物到下腔室。類似地，樣品可被最初加載至下腔室。
[0071]在另一個方面，含有帶電聚合物的樣品被加載至中腔室，并且初始第一電壓被設置成從中腔室拉動帶電聚合物到上腔室，初始第二電壓被設置成從中腔室拉動帶電聚合物到下腔室。
[0072]術語“帶電聚合物”或“聚合物”是指在溶液的pH時具有足夠的帶電單元使得可通過靜電作用力被拉動通過孔的聚合物。在一個實施方式中，帶電聚合物的每個電源在所選擇的的PH時是帶電的。在另一個實施方式中，帶電聚合物包含通過靜電力被拉進并通過孔的足夠的帶電單元。例如，為本發(fā)明的目的，包含足夠多的、可在選定PH時帶電從而用于本發(fā)明的裝置和方法中的實體部分的肽是帶電聚合物。類似地，為本發(fā)明的目的，包含甲基丙烯酸和乙烯的共聚物，如果甲基丙烯酸殘基具有足夠的帶電羧酸鹽基團從而被用在本文所述的裝置和方法中，那么該共聚物是帶電聚合物。在一個實施方式中，帶電聚合物包含一個或多個位于或靠近聚合物的一個末端的帶電單元。在另一個實施方式中，帶電聚合物包括一個或多個位于或靠近該聚合物的兩個末端的帶電單元。
[0073]在某些方面，帶電聚合物是多核苷酸或多肽。在一個特別的方面，帶電聚合物是多核苷酸。多核苷酸的非限制性例子包括雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA和DNA-RNA雜交體，以及多種類型的蛋白核酸(如PNA、雙體PNA、y-PNA)0[0074]在一個方面，步驟(C)中被調(diào)節(jié)的第一電壓和第二電壓的幅值高達兩個電壓差值的約10倍至約10000倍。例如，兩個電壓分別是90 mV和100 mV。電壓幅值(約100 mV)是它們之間差值10 mV的約10倍。在某些方面，電壓幅值高達它們之間差值的至少約15倍、20 倍、25 倍、30 倍、35 倍、40 倍、50 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、400 倍、500倍、1000 倍、2000 倍、3000 倍、4000 倍、5000 倍、6000 倍、7000 倍、8000 倍或 9000 倍。在某些方面，電壓幅值不大于它們之間差值的約10000倍、9000倍、8000倍、7000倍、6000倍、5000倍、4000 倍、3000 倍、2000 倍、1000 倍、500 倍、400 倍、300 倍、200 倍或 100 倍。
[0075]在一個方面，在步驟(C)中對第一電壓和第二電壓進行實時或在線調(diào)節(jié)，這通過利用專用的硬件和軟件，以至多數(shù)百兆赫的時鐘頻率，主動控制或反饋控制來進行。第一或第二或兩個電壓的自動控制基于第一或第二或兩個離子電流測量值的反饋來實現(xiàn)。
[0076]裝置中的傳感器
本發(fā)明的裝置可用來分析在裝置中移動或保持在裝置內(nèi)的分子或顆粒。在一個方面，該裝置還包括一個或多個用于進行分析的傳感器。預期當使用單個傳感器時，該單個傳感器不包括設置在一個孔的兩側、用于在分子或顆粒(特別是聚合物)移動通過該孔時測定通過該孔的離子電流的一對電極。
[0077]在一個方面，該裝置包括適合識別聚合物或聚合物的單個成分的傳感器。單個成分的非限制性例子包括單體單元以及具有接近或位于單體單元上的改性處理的單體單元。這種改性處理的例子包括，但不限于，導致產(chǎn)生例如5-甲基胞嘧啶、5_羥甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶的甲基化。當聚合物是多核苷酸時，單個成分可為一個或多個核苷酸單元或被蛋白質(zhì)因子結合的、或被PNA或其他合成分子或代謝物等結合的核苷酸單元。當聚合物是多肽時，單個成分可為一個或多個氨基酸或改性的氨基酸。對氨基酸的改性的例子包括，但不限于，N-聯(lián)糖基化、O-聯(lián)糖基化、磷酸化、乙酰化、模擬化(summuolation)、甲基化。而且，不同形式的聚糖可被區(qū)分，例如區(qū)分復合聚糖和高甘露糖型聚糖(例如區(qū)分Man-5與Man_8, 9)。
[0078]用在裝置中的傳感器可為適合識別分子或顆粒(例如聚合物)的任何傳感器。例如，傳感器可被配置成通過測定與聚合物或聚合物的一個或多個單個成分相關的電流、電壓、pH、光學特征或駐留時間來識別該聚合物。
[0079]在一個實施方式中，傳感器測定聚合物或聚合物的成分(或單元)的光學特征。這種光學測定的一個非限制性的例子是通過紅外光譜法來識別，紅外光譜測定與被測定的單元的躍遷能匹配的獨特輻射吸收(即共振頻率)。例如，DNA的每個堿基以及每個單獨的氨基酸都具有以獨特的可測量頻率共振的官能團，因此可以識別每個單元。
[0080]這種光學測量的另一個例子包括通過測定在特定波長的UV光線吸收量來識別。例如，單獨的DNA在260 nm處強吸收，但在280 nm處弱吸收。信號的變換，即280>260，表明蛋白質(zhì)存在或結合至DNA。另一個UV監(jiān)測蛋白質(zhì)存在的例子是在215-220 nm處測量，因為肽鍵在該范圍內(nèi)強吸收。在該范圍吸收值的增加表示樣品中存在已結合的蛋白或蛋白。
[0081]這種光學測定的另一個例子使用熒光光譜測定法，從而在電子被激光或其他能源激發(fā)而進入較高能量狀態(tài)并返回至基態(tài)后，來檢測分子的特定熒光頻率。當返回至基態(tài)時，發(fā)射光子的頻率可被測定。對于被研究的分子來說，熒光可以是固有的性質(zhì)或者是附加的標記。可被直接加入靶分子中或加入被設計用來識別靶分子上的特征的探針中的普通熒光團標記可為例如 Alex Fluor 488、555、594、647。
[0082]在一個實施方式中，當使用駐留時間測量值時，基于一個單元通過該傳感裝置所花的時間長度，它們可將該單元的尺寸與特定單元相關聯(lián)。
[0083]在一個實施方式中，當使用駐留時間測量值時，這些測量值將與傳感器(或傳感器上的官能團)和聚合物之間的靜摩擦(摩擦相互作用)的量相關聯(lián)。相互作用的強度(即，弱或強)對于該聚合物或聚合物的單元是特異性的，并可基于其通過傳感裝置的時間長度來進行識別。
[0084]進一步地，傳感器可包括位于傳感器遠端的酶，該酶能夠?qū)⒕酆衔锏哪┒藛卧獜拇文┒藛卧呀庀聛?，從而提供聚合物的游離的單個分子單元。該單個單元(例如單個核苷酸或氨基酸)可被上述類型的、位于孔的遠端的傳感器所檢測。
[0085]因此，傳感器可被放置在裝置的使得能夠進行這種測量的位置(圖4)。在一個方面，傳感器可包括兩個電極(151和152)并且可被放置在其中一個孔中。當聚合物移動通過孔時，這兩個電極即處于該聚合物的兩側，因而可以通過測定通過單個成分的電流或電壓或其變化值來識別該單個成分。
[0086]類似地，具有電極161和162的傳感器可被放置在其中一個孔的出口處(圖5)。在一個方面，一個孔的出口鄰近該第一-第二孔對的另一個孔。在另一個方面，傳感器可被放置在兩孔之間。除了位置外，傳感器的類型和構造也可改變。如圖6-8所示，傳感器可包括兩個具有相對窄的末端的電極171和172，并且電極之間具有間隙(圖6)。在一個方面，其中一個電極(181)可包括實質(zhì)上平坦的表面，而另一個電極(182)可具有窄的末端(圖7)。
[0087]在另一個方面，傳感器不包括電極而是呈膜或支架(191)形式，其具有允許聚合物通過的開口(例如孔)。例如，具有開口(可正如與其他納米孔一樣的納米孔)的一層或多層石墨烯膜可作為輔助傳感器，其本身可位于兩孔之間的腔室內(nèi)。在一個方面，該石墨烯膜包含單層、雙層或多于兩層。
[0088]在一些實施方式中，傳感器被配置成當聚合物被加載在第一孔和第二孔中時靠近聚合物。因此，當聚合移動通過這兩個孔時，傳感器足夠靠近該聚合物以測定該聚合物。在這點上，傳感器可與這兩個孔對齊，要么位于其中一個孔中，要么在兩孔之間(如圖4-8所示)。
[0089]在一些實施方式中，傳感器被配置以形成隧道間隙，該隧道間隙允許聚合物通過。在圖4-8所示的裝置中，隧道間隙形成于電極之間或由所述開口形成。當聚合物移動通過該隧道間隙時，傳感器即可識別該聚合物的單個成分。
[0090]已經(jīng)證明，單個核苷酸可在精度為0.8 nm的隧道間隙中被辨別。
[0091]在一些實施方式中，傳感器可利用與每種DNA堿基形成獨特非共價鍵的試劑(例如苯并酰胺和羧基酰胺咪唑)而被功能化。在這點上，所述間隙可更大，且仍可實現(xiàn)有效測量。例如，當被功能化后，2.5 nm的間隙可與0.8 nm間隙一樣有效。利用功能化的傳感器的通道傳感被稱為“識別隧道效應(“Recognition tunneling”)”。結合利用掃描隧道顯微鏡(STM)和識別隧道效應，可識別出短DNA寡聚物中側翼為其他堿基的一個DNA堿基。
[0092]識別隧道效應還可提供“通用閱讀器”，其被設計成以獨特方向氫鍵鍵合至四種DNA堿基(A、C、T、G)中的每一個，并且也鍵合至由于表觀遺傳改性而天然出現(xiàn)的堿基5-甲基-胞嘧啶(mC)。[0093]常規(guī)識別隧道效應的限制在于它僅可檢測隨機結合在間隙中的或碰巧在顯微運動期間位于該間隙中的游離擴散的DNA，而無法明確地捕獲至該間隙。而且，當識別試劑在優(yōu)化敏感度后被加入到納米孔通道的電極隧道間隙中時，將不再有STM設置的共同缺點。
[0094]因此，在一個實施方式中，傳感器包括經(jīng)試劑改性的表面。在一個方面，該試劑能夠與核苷酸形成非共價鍵。在特別的方面，該鍵是氫鍵。該試劑的非限制性例子包括4-巰基苯甲酰胺和1-H-咪唑-2-甲酰胺。
[0095]本技術中的方法的顯著優(yōu)點在于原則上它們可被改造以提供同聚區(qū)域(堿基重復)中進展的直接追蹤。離子電流感測無法進行直接堿基重復追蹤。追蹤重復序列是必要的，因為例如特定單核苷酸重復的缺失和插入是許多類型疾病的標志，包括脆性X染色體綜合癥、囊腫性纖維化、多種形式的惡性癌癥以及其他疾病。而且，我們期望檢測的表觀遺傳化學改性通常出現(xiàn)在GpC富集/重復區(qū)。此外，DNA圖譜通常是檢測DNA聚合物內(nèi)的重復區(qū)(短串聯(lián)重復序列)來進行的。
[0096]在離子電流感測中，對于長度大于影響電流(當在孔中時)的核苷酸數(shù)目(如相對MspA蛋白納米孔的4個核苷酸)的同聚區(qū)域，同聚ssDNA通過孔時不存在每個核苷酸移動的獨特信號。預期理想的納米孔測序平臺應利用輔助感測方法，該方法可追蹤每一核苷酸運動進程，同時還實現(xiàn)單核苷酸敏感度。寡聚物中相鄰核苷酸之間的轉換應可通過識別隧道效應觀察到，使得它成為允許直接的堿基重復序列追蹤的候選測序法。
[0097]因此，本技術的方法可為一個或多個識別隧道效應位點提供DNA遞送速率控制，每個位點位于其中一個或兩個納米孔通道中，或在納米孔之間，并且電壓控制可保證每個核苷酸在每個位點停留足以實現(xiàn)穩(wěn)健識別的時間段。
[0098]本發(fā)明的裝置和方法中的傳感器可包含金、鉬、石墨烯或碳或其他合適材料。在一個特別的方面，傳感器包括由石墨烯制成的部分。石墨烯可作為導體和絕緣體，因此通過石墨烯和納米孔的隧道效應電流可對易位的DNA進行測序。
[0099]在一些實施方式中，隧道間隙的寬度為約I nm至約20 nm。在一個方面，間隙的寬度為至少約 I nm，或至少約 1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、12 或 15 nm。在另一個方面，間隙的寬度不超過約20 nm，或不超過約19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、
6、5、4、3或2 nm。在一些方面，該寬度為約I nm至約15 nm,約I nm至約10 nm,約2 nm至約10 nm,約2.5 nm至約10 nm,或約2.5 nm至約5 nm。
[0100]在裝置中表征聚合物
聚合物(例如DNA分子)可在本發(fā)明的裝置中被分析。在一個方面，如上所述，聚合物被加載到裝置中的至少兩個孔內(nèi)。在加載聚合物后，它位于適合由傳感器通過測定與該聚合物或聚合物的成分有關的電流、電壓、pH、光學特征或駐留時間來檢測的位置。
[0101]例如，多核苷酸可通過具有相同方向的兩個電壓被加載到兩個孔中。在該例子中，當施加在第一孔的電壓方向被逆轉并且新的電壓誘導作用力在幅值上稍微小于施加在第二孔上的電壓誘導作用力，多核苷酸會繼續(xù)以相同方向移動，但移動速度顯著降低。在這點上，提供電壓通過第二孔的放大器也測定通過第二孔的電流，該離子電流隨后確定通過該孔的一個核苷酸的特性，因為每個不同核苷酸的通過都會產(chǎn)生不同的電流信號(例如，基于離子電流幅值的改變)。據(jù)此，多核苷酸中每個核苷酸的識別揭示出了多核苷酸的順序。
[0102]在某些方面，用于多核苷酸的重測序的重復受控遞送進一步改善了測序質(zhì)量。對于每個方向的受控遞送，每個電壓被改變得更大。 申請人:還預期，通過兩個孔的兩個電流可與增加的精確性相關聯(lián)。發(fā)明人預期，布朗運動可能導致分子運動的波動，從而影響分子的受控遞送。但是這種作用可通過例如在DNA測序期間DNA的重復受控遞送以及取測序用測量值的平均值來最小化或避免。而且，發(fā)明人預期，布朗運動對大分子(如多核苷酸和多肽)的受控運動的影響，特別是在競爭作用力拉動該大分子分離，從而在分子內(nèi)生成張力時不明顯。發(fā)明人預期，DNA通過表面電荷改性黏附至孔壁或通過化學試劑黏附至孔表面從而產(chǎn)生摩擦，也可緩解布朗運動對雙孔法控制性能的影響。
[0103]這種方法為現(xiàn)有技術尚未被解決的問題提供了 一個容易的解決方案。
[0104]例如，已知要實現(xiàn)受控遞送和納米孔測序所需的精確感測有兩個競爭性的障礙。一個是需要在孔處提供相對高的電壓，從而提供足夠的測序敏感度。另一方面，高電壓導致多核苷酸快速通過該孔，而不能具有用于識別每個核苷酸的足夠的時間。
[0105]更具體地，納米孔測序平臺要求多核苷酸通過孔的通過速率被控制在I ms/核苷酸(nt)或更慢，同時仍生成序列敏感電流。這需要足夠高的信噪比以檢測電流信號(高電壓更好)，但需要分子以足夠慢的速度移動通過孔以確保測量值位于記錄帶寬(recordingbandwidth)內(nèi)(低電壓更好)。在單孔實施方式中，多核苷酸速度與電壓成比例，因此更高的電壓對于感測更好，但對于降低多核苷酸速度更不利:在促進多核苷酸捕獲的電壓時，速度為I ms/nt和更快(快>1000倍)。另一方面，較低的電壓降低了感測性能，還增加了由于布朗運動導致的速度波動的相對貢獻(削弱了讀數(shù)精確性)。
[0106]除本文所描述的之外，目前沒有一種方法在不涉及使用酶或光學器件(兩者均僅在特殊納米孔技術中起作用)的情況下排除這些障礙。
[0107]多種方法已被提出用來解決與感測能力確實以及在低電壓下操作相關的問題。一種方法是改造生物學納米孔以改善其敏感度。另一種方法是使用石墨烯膜，單層石墨烯膜的厚度小于ssDNA中核苷酸之間的距離。還有一種方法是利用在非?？拷{米孔的位置測量的輔助電流(即，隧道效應電流)。
[0108]生物學納米孔已在第一種方法中測試。a_溶血素納米孔是研究中最常用的生物學孔。研究顯示，a-溶血素可分解同聚物中的單個核苷酸取代物以及其他形式全核堿基DNA中的脫堿基(I’，2’ -雙脫氧)殘基。但是，單核苷酸敏感度在具有野生型(WT)a-溶血素的雜聚體DNA中是不可能的，其中離子電流受通道中約10個核苷酸的影響。a-溶血素的蛋白質(zhì)工程化已被用來改善其DNA分析和測序的敏感度。一種這種突變孔使用具有共價連接的銜接分子(Clarke et al., Nat.Nano tech, 4 (4): 265 - 70, 2009)的 a_ 溶血素,該銜接分子能夠以高精確性區(qū)分四種5’ -單磷酸核苷分子。但是，這種突變孔顯得不具有用于測定通過該孔的完整雜聚體ssDNA的序列的敏感度。
[0109]另一個示例性生物學孔是MspA，其具有漏斗樣形狀，該形狀將離子電流的敏感度集中到通道的底部。而且，通過MspA和a-溶血素實現(xiàn)DNA速率降低可通過利用酶來實現(xiàn)。如圖1所不(Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012),DNA的速率降低是利用位于MspA納米孔上的酶來實現(xiàn)的。但是，這導致非確定性的感測期間、由回溯導致的重復讀數(shù)、以及無法感測同聚區(qū)域。phi29聚合酶介導的DNA易位的機制已形成于(Cherfet al., Nat.Biotech., 30 (4): 344-8, 2012) a_溶血素,并在更敏感的MspA納米孔上實施(Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012)。聚合-催化易位的逐步速率是2.5-40 nt/s，這符合DNA速率降低的要求。但是，雖然生物孔上的酶可降低易位速率，但仍缺乏對每個核苷酸的駐留時間的控制，這會使得重復序列的非受控追蹤(blindtracking)非常困難，并對區(qū)分單核苷酸讀取上的長停頓提出了挑戰(zhàn)。在敏感度方面，如圖3 所不(Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012),讀取重復性 DNA 模板可利用MspA上的phi29來實現(xiàn)。圖3a顯示了由重復的CAT三核苷酸構成(僅一個CAG三聯(lián)體位于序列中間)的DNA模板的示例性軌跡。*代表(通過人為分析)檢測到的作為兩個水平之間的重復轉移(repeated transition)的“切換(toggle)”,其是基于酶的控制方法所固有的并且導致讀取錯誤。圖3b顯示了圖3a的理想化形式，其中平均電流水平用已知DNA序列校準，并去除了圖3a中顯示的所測量的期間的差異。理想化顯示出了由單個dG取代打斷的三水平的重復模式。四個水平受該單個dG的影響，最大偏差最接近該取代，表明殘基電流主要受約4個核苷酸影響。通過的MspA的離子電流受最接近該限制性孔洞的約4個核苷酸的影響，這顯著增加了識別序列的復雜性。雖然如本領域所表明的，理想上可以建立對應44 = 256個組合的每一個的不同電流幅值庫，但主要的庫將很難實現(xiàn)。原因在于識別通道電流記錄中的步驟轉移(step transition),對半幅值方法來說需要至少2的信噪比(SNR)(對于基于Markov方法來說，SNR≥1.5)。當在記錄帶寬時RMS噪音為0.5PA，幅值變化必須至少為I PA以達到所需的SNR，導致對于MspA來說在40 pA的幅值范圍內(nèi)僅有約40個可檢測水平(或，在SNR 1.5時最多53個水平)。而且，因為范圍并非被均勻使用，所以會觀察到少于40個水平，并且雖然進一步過濾可降低噪音以增加幅值分辨率，但也導致漏掉比已經(jīng)存在的更多的更快ssDNA運動轉移。 [0110]目前，沒有一種納米孔的離子電流感測可提供核酸測序的單核苷酸敏感度。而且，對生物學孔和固態(tài)孔(石墨烯)的敏感度的改進一直在進行并且持續(xù)處于研究中。一個問題在于離子電流感測不允許直接追蹤同聚區(qū)域(堿基重復序列)內(nèi)的進展，因為同聚ssDNA移動通過孔時沒有獨特的單核苷酸信號。追蹤重復序列是必要的，這是因為，例如，人線粒體DNA內(nèi)特定單核苷酸重復(7，9 nt)的缺失和插入已表明是多種類型癌癥的病因(Sanchez-Cespedes, et al., Cancer Research, 61 (19): 7015 - 7019, 2001)。雖然生物學孔上的酶可以降低易位速率，但仍缺乏對每個核苷酸的駐留時間的控制。另一方面，使用具有雙孔控制的恒定遞送速率，消除了非確定性停頓，并可精確估算重復序列長度。重復讀取重復序列部分多次也可改善估算錯誤并識別錯誤邊界，并且這可在不逆轉由酶引起的聚合化學反應的情況下實現(xiàn)。
[0111]最近的研究表明，利用單個納米孔無法實現(xiàn)僅通過降低電壓就能降低速率(Lu etal., Biophysical Journal, 101 (I): 70-9, 2011)。相反，當電壓降低時，單鏈DNA (ssDNA)的速率變得更加隨意(包括回溯)，因為布朗運動對速度波動的影響越來越大。該研究還顯示需要高電壓作用力來抑制布朗運動誘導的速度波動，否則即使使用理想化的單核苷酸敏感性納米孔傳感器也會影響測序測量值。
[0112]本發(fā)明提供的基于雙孔裝置的測序方法提供了一個解決這些問題的容易的方案并且相對現(xiàn)有方法具有額外的優(yōu)點。與在高電壓或低電壓時具有足夠測序敏感度的一個或兩個孔相配合，雙孔控制解決了單納米孔實施方式中的測序速率控制問題。這種孔可包括在固態(tài)基質(zhì)中的生物學孔、橫跨固態(tài)基質(zhì)的膜內(nèi)生物學孔、或固態(tài)孔(例如在石墨烯、硅或其他基質(zhì)中)。在一個方面，可在一個或兩個孔處使用酶(例如生物學孔(如MspA)上的Phi29)，使用高電壓生成用于測序的大信號以及低的差動電壓，該低的差動電壓在每個酶上產(chǎn)生一個作用力，該作用力足以將酶保持在每個孔的頂部位置并允許聚合-催化的DNA移動，但并非大得足以停止或分解這些酶。這種構造通過顯著增強測量信號并允許兩個孔同時讀取 DNA 的一個鏈而能改善在 Cherf ei a7.，Nat.Biotech., 30(4):344-8, 2012和 Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012 中描述的方法。
[0113]此外，本發(fā)明的方法可在孔處產(chǎn)生足夠高的電壓以確保在孔處的利用離子電流感測的檢測靈敏度。有理由相信，高電壓會對布朗運動產(chǎn)生足夠的抑制從而確保以恒定速率通過每個孔，并且在每個孔外部的DNA的構造會影響DNA在任何方向的運動能量學。此外，該方法中使用的電壓競爭(圖3)可被調(diào)節(jié)以使得分子在孔中停留足夠長的時間，從而允許分析分子。進一步地，本發(fā)明不需要使用酶、光學儀器或DNA附接物。因此，該方法提供了高信噪比檢測通過納米孔的電流，同時調(diào)節(jié)分子遞送速率，這是單納米孔實施方式不可能具有的能力。
[0114]該方法可被用來識別帶電聚合物中單體的成分。在一個方面，當聚合物是單鏈DNA或RNA時，該單體單元是核苷酸。在另一個方面，當聚合物是雙鏈DNA或RNA時，該單體單元可為核苷酸對。
[0115]在一個方面，該方法可被用來識別聚合物的改性部分，例如結合至單體的分子，特別是當結合的分子帶電時。但是，該結合的分子并不必須帶電，因為即使是中性分子也可通過其尺寸改變離子電流。
[0116]在另一個方面，該改性部分包括聚合物的分子結合。例如，對于DNA分子，該結合的分子可為DNA結合蛋白，例如RecA、NF-kB和p53。在另一個方面，該改性部分是結合至特定單體或片段的顆粒。例如，結合至特定DNA位點用于基因分型或DNA圖譜的量子點或熒光標記物可通過該裝置被檢測。因此，本發(fā)明的裝置提供了用于基因分型和DNA圖譜(不限于此)的廉價方式。
[0117]在一個方面，聚合物在一端被附接至固體載體，例如珠子。
[0118]在一個實施方式中，本發(fā)明還提供了確定多核苷酸的序列的方法，該方法包括:(a)將包含多核苷酸的樣品加載到上述任一實施方式的裝置的上腔室，其中該裝置被連接至電源以在上腔室和中腔室之間提供第一電壓并在中腔室和下腔室之間提供第二電壓，其中該多核苷酸任選地在該多核苷酸的一端被附接至固體載體；(b)設置初始第一電壓和初始第二電壓，使得該多核苷酸從上腔室移動至中腔室，并從中腔室移動至下腔室，從而將聚合物定位成橫跨第一孔和第二孔；(C)調(diào)節(jié)第一電壓和第二電壓使得兩個電壓產(chǎn)生將該多核苷酸拉離中腔室的作用力，其中兩個電壓的幅值在受控條件下不同，使得多核苷酸以一個方向且以受控方式移動通過這兩個孔；和((1)識別移動通過其中一個孔的多核苷酸的每個核苷酸，這是通過在該核苷酸通過該孔時測定通過該孔的離子電流實現(xiàn)的。
實施例
[0119]本發(fā)明將通過以下實施例被進一步界定。對于本領域技術人員來說，明顯地，可對主題和方法做出許多改變而不背離本發(fā)明的范圍。
[0120]實施例1.單個dsDNA分子在孔中的捕獲和控制
該實施例顯示，當測量到每個獨立的離子孔電流的變化時，可容易地檢測到DNA被捕獲到雙孔裝置中的每個孔中。
[0121]該實施例證實了 dsDNA (珠子附接或未附接至一端)的雙孔捕獲。也可開發(fā)出利用帶珠ssDNA的實驗。
[0122]一旦捕獲并拖住DNA，最靠近珠子的孔電壓(VI，圖1，假設從腔室A捕獲)可被逆轉并增加直至DNA上的競爭作用力將其向腔室A拉回。在實驗期間，任一孔中的離子電流可輕易檢測出DNA的捕獲和離開。
[0123]當使用珠子時，珠子具有防止珠子通過任何一個或兩個孔的合適尺寸。本領域中已經(jīng)開發(fā)出保證珠子-DNA呈1:1比率的方法。例如，共軛至生物素化的DNA雙鏈體(或ssDNA)的單價鏈霉親和素涂布的量子點(QDs; QD655, Invitrogen)可提供直徑范圍為20-30 nm的珠子，使用金顆粒或乳膠可獲得更大的珠子(30-100 nm)。在設計實驗時可考慮珠子對流體動力學和電荷的影響(因為它與捕獲速率有關)。
[0124]沒有珠子的情況下,dsDNA以約0.1 ms/kbp的速率通過孔?？墒褂瞄L度為500 bp至4 kbp的DNA以及1-噬菌體dsDNA分子(~48kbp)。DNA樣品可從腔室A被遞送至兩個孔，這可利用每個孔的共同電壓極性來促進從腔室A捕獲并通過腔室B進入腔室C (圖1)來實現(xiàn)。dsDNA的大得持續(xù)長度(一庫恩長度為100 nm)保證了每個孔內(nèi)的DNA片段很可能是完全伸展的且為棒狀。電壓和離子濃度可被改變以確定出恰當?shù)牟东@速率。不同的緩沖離子濃度也可被用在每 個腔室中以提高或改變捕獲速率以及表示DNA存在于每個孔中的傳導變化值。
[0125]使用直徑為10 nm的納米孔或更大的納米孔使得dsDNA和納米孔壁之間的相互作用(例如摩擦和粘滯)最小化。對于較大的孔，雖然dsDNA可以未折疊和折疊的構象被捕獲，但在較高電壓和較短(≤3 kbp) dsDNA時更可能的是單行(未折疊)構象。對于孔間距離為500 nm或更小時，發(fā)明人預期，對于在I M KCl中至少200 mV的電壓，在第一孔(腔室A和B之間)捕獲后，雙孔捕獲的可能性非常聞。
[0126]達到電壓影響控制熱擴散并以高可能性導致捕獲的徑向距離，對于各種孔尺寸(6-15 nm直徑)、電壓(120-500 mV)來說,預計為至少900 nm,其中dsDNA長度至少為4 kbp(Gershow and Golovchenko, Nature Nanotechnology, 2:775 - 779, 2007)。這些發(fā)現(xiàn)證實在單(第一)孔捕獲dsDNA后很可能實現(xiàn)迅速的dsDNA雙孔捕獲。
[0127]通過這兩個孔實現(xiàn)DNA的捕獲和控制可利用主動控制硬件和實時算法。發(fā)明人已開發(fā)出用于DNA控制的主動控制硬件/軟件。參見,例如，Gyarfas et al, Biophys.J.,100:1509-16，2011) ; Wilson et al., ACS Nan0., 3(4):995-1003, 2009;以及 Benneret al., Nat.Nanotech., 2(11):718-24, 2007。有用的軟件為在 FPGA(現(xiàn)場可編程門陣列)系統(tǒng)(PC1-7831R, National Instruments)上運行的 LabVIEW 軟件(第 8 版，NationalInstruments, Austin, TX)。所提及的FPGA可同時控制至多4個放大器。而且,用于數(shù)字化數(shù)據(jù)并將數(shù)據(jù)記錄在PC上的Axon Digidata 1440Α數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)具有16個輸入通道，足以并行地記錄多達8個放大器的電壓和電流。其他涉及實時控制和測量的硬件/軟件的實時操作系統(tǒng)也可被用于控制放大器、以及數(shù)字化并記錄數(shù)據(jù)。
[0128]發(fā)明人還開發(fā)出了被稱為“納米鉗”的低噪音電壓鉗放大器(Kim et al., IEEETrans.0n Biom.Circ.And Syst.1n press, May 2012; Kim et al., Elec.Lette.,47 (15): 844-6, July, 2011; Lii1^Kim et al., Proceedings of the IEEE InternationalSoC Design Conference (ISOCC), November, 2010),用來功能化和優(yōu)化一個或多個納米孔在小印跡、多通道裝置中的使用。任何其他商業(yè)上的臺式電壓鉗或膜片鉗放大器，或集成的電壓鉗或膜片鉗放大器，都可被用于雙孔控制和測量。
[0129]對于多種固態(tài)孔材料和直徑，0.1-10 kbp需要約I ms來易位。利用FPGA-控制的放大器，人們可檢測捕獲并在0.020 ms內(nèi)啟動競爭電壓控制，這要比I kbp DNA的I ms的總通過時間快得多；因此，很可能在DNA逃離之前(未連接珠子)觸發(fā)控制方法。作為控制的證明，分子離開孔的時間和方向可被證實隨競爭電壓的幅值和差值而變化(圖3)。在單孔實驗中，實驗觀察到長的O lkbp) dsDNA通過孔時速度有大的波動，這些波動太大而不可能是由于擴散布朗運動導致的。在Lu, et al., Biophysical Journal, 101 (I): 70 - 79,2011中，凈速度波動(B卩，DNA長度除以總通過時間)的主要原因被建模為是由于以下原因?qū)е碌模?，未在孔?nèi)的DNA的電壓影響部分誘導的粘性阻力以及孔內(nèi)吸引的電壓區(qū)域延伸的部分。該模型與試驗數(shù)據(jù)很好地吻合。值得注意的是，如果在捕獲時dsDNA的質(zhì)心與孔共線，那么凈速度更快，但如果它偏離孔，那么凈速度較慢。當競爭電壓被施加在兩孔裝置中時，除非電壓差足夠高，否則dsDNA速度將不受這種粘性阻力誘導的擾動的影響。原因在于，當dsDNA被兩個孔捕獲并且施加競爭電壓后，孔之間的dsDNA會完全展開并呈棒狀，因此不會參與制造出靠近任一個內(nèi)部孔入口處的結構。另一方面,在孔的外側的dsDNA結構受到遠離中間通道的每個局部孔電壓的恒定作用力，因此不太可能影響孔進入動力學。這種結構可能意向受控的遞送動力學，可利用校準實驗來對此進行定量。
[0130]由隨機的橫向DNA移動誘導的作用力不確定性可能是最小的。此外，電壓作用力導致DNA移動的相反方向的電滲透流(EOF)，導致DNA比不存在所誘導的抗衡離子流時移動得更慢。因為分子的不同徑向位置可導致納米孔中的不同EOF場，一個問題是有效的電荷密度(因而是凈驅(qū)動作用力)是否在DNA徑向位置的波動期間改變得足夠大以誘導速度波動。在孔壁與DNA之 間的距離為I nm或更大時，DNA在I M KCl中的有效電荷密度被認為是穩(wěn)定的。
[0131 ] 此外，SiN納米孔具有本質(zhì)上排斥DNA的負表面電荷。因此，雖然分子會經(jīng)歷徑向位置波動，但通過使用直徑大于幾納米的SiN孔，每個恒定的電壓值很可能會在兩個孔的每一個處產(chǎn)生恒定的有效作用力，因而當在雙孔裝置中使用兩個競爭電壓時在較大的力的方向產(chǎn)生恒定的速度。其他孔材料表面的處理可產(chǎn)生與SiN相當?shù)男Ч?br> [0132]由布朗運動導致的DNA隨機平移運動造成的速度不確定性可通過增加競爭電壓來降低。可進行試驗來確定是否出現(xiàn)這種降低。單納米孔研究(Lu, et al., BiophysicalJournal, 101(1):70 - 79，2011)證實，增加競爭作用力可降低布朗運動造成的不確定性。該研究分析了由布朗運動引起的速度波動(出現(xiàn)在快速(納秒)時間范圍)以及由該波動導致的測序誤差。假設一個假想的且理想化的單核苷酸傳感器(在〉22 MHz帶寬無噪音檢測)，布朗運動單獨導致75%的讀取誤差。預測誤差的相關參數(shù)是慫TVW* (0.34 nm)，它是熱能與將DNA易位核苷酸之間的距離a (0.34 nm)所做的功之間的比率。在該比率中，力Z7 =Vl是驅(qū)動DNA的電壓K與電荷密度I (dsDNA為0.2 e7bp)的乘積。對于本發(fā)明的控制方法，增加電壓50倍導致產(chǎn)生5%的讀取誤差，更高的電壓會進一步降低誤差。但是，對于單個的孔，因為平均速度I ?為/?//?/)，其中i/為擴散常數(shù)，DNA速度也隨著A增加，使得
V
對測序帶寬提出更加不切實際的要求。
[0133]為維持22 MHz帶寬，單個納米孔的作用力增加50倍的同時還需溶液粘度增加50倍以維持相同的I ,。但是，實際上，22 MHz帶寬已經(jīng)大大高于用于單核苷酸測序的
V
任何試驗用納米孔平臺已經(jīng)證實的或可能證實的帶寬。而且，對于單個納米孔，增加粘度僅減慢 DNA 至多 10 倍(Fologea, et al.，Nano Lett.，5(9): 1734 - 7，2005)。使用該雙孔平臺，每個電壓可被保持得足夠高，這可抑制由布朗運動引起的波動，而決定DNA凈速度的差異電壓可被調(diào)節(jié)以確?？刂扑俾试趯嶋H的測序帶寬(標稱為I kHz)之內(nèi)。另一種抑制布朗運動誘導的速度波動的方法是使用反饋控制。在一個方面，利用10 kHz帶寬的第二孔電流反饋以在10 kHz帶寬啟動第一孔電壓，布朗運動可被抵消，從而在這些kHz閉環(huán)帶寬控制DNA上的可檢測特征保持在第二孔內(nèi)或附近。這種能力在一個維度上類似于在兩個空間維度上抑制布朗運動的反布朗運動電動力(ABEL)阱，并且通過在Hz閉環(huán)帶寬光學地推動(optical forcing)連接至分子的珠子而起作用(Wang and Moerner, ACSNano, 5:5792-9, 2011)。有過在DNA和(帶正電的)納米孔壁之間制造靜摩擦力的先例。例如，Bashir 及其同事們(Venkatesan et al., Adv.Mater., 20 (8): 1266 - 75, 2010;Venkatesan et al., Adv.Mater., 21:2771 - 6, 2009)報道了 Al2O3 孔顯著降低易位速率的可能性，這是由于它們獨特的通過濺射形成帶正電的晶疇的能力引起的——帶負電的DNA磷酸鹽骨架在橫穿Al2O3孔時與正電表面相互作用，減緩其移動。Dekker及其同事們的近期工作(Kowalczyk e i ，Nan0.Lett., 12:1038-44，2012)顯不，與通常使用的KCl離子溶液相比，LiCl減慢DNA速率10倍，這提供了一種任何納米孔設備都可受益的方法。
[0134]實施例2.結合至DNA的RecA蛋白絲的檢測盒定位
該實施例顯示，雙孔裝置可被用來定位DNA結合蛋白在dsDNA上的結合，并且可用于具有特定序列或不結合至特定序列的蛋白質(zhì)。
[0135]如實施例1所證實的，DNA樣品可從腔室A中捕獲。RecA蛋白催化ATP依賴性DNA鏈-交換反應，該反應將破損的DNA與未受損DNA的互補區(qū)域配對。使用難水解的ATP類似物ATPgS，結合至dsDNA的RecA蛋白絲當首先以生理性鹽組裝時在高鹽(例如IM KCl)中是非常穩(wěn)定的。作為水解緩慢的ATPgS的替代物，該實施例也可使用ADP-A1F4 (四氟化鋁)，它完全不會轉換(turnover),并且導致RecA更緊密地結合至DNA。
[0136]通過20-30 nm納米孔檢測結合至1-DNA的RecA蛋白絲已被證實(Kowalczyk etal., Nano Lett., 10 (I): 324—8，2010; Smeets et al., Nano Lett., 9 (9): 3089-95,2009;以及Hall et al.Nano Lett.，9(12):4441-5, 2009)，但長度〈20 bp 的蛋白絲(6個或更少的RecA蛋白)無法使用單個納米孔來解析(因為易位速率與測量SNR之間耦合)。
[0137]該實施例的初始實驗使用結合了珠子和未結合珠子的1-DNA，其已被暴露于不同濃度的RecA，以生成幾乎未包被、部分包被以及完全包被的DNA。每個孔電流的實時監(jiān)測可被用來調(diào)整受控遞送的進展，并且會與蛋白絲的位置定位相關聯(lián)。重復測量每個DNA會提高RecA定位的精確度。
[0138]當RecA結合至DNA時，所增加的電荷和體積，以及在高鹽時的穩(wěn)定性，使得它成為在利用本文提出的儀器的受控遞送期間實現(xiàn)檢測和位置定位的理想候選物。
[0139]對結合了 RecA的DNA的控制也可在不使用珠子(其被連接用以阻礙易位)的情況下實現(xiàn)。對于實施例1中的dsDNA實驗，主動電壓控制可被用來在DNA離開納米孔之前迅速啟動競爭電壓控制。因為結合至DNA的帶電物質(zhì)通過改變DNA的凈電荷和硬度而影響DNA在電場中的運動，因此運動控制隧道效應實驗可審核結合至dsDNA的RecA對用于控制dsDNA的運動的力平衡的影響。
[0140]該實施例可證實，所觀察到的最短的蛋白絲長度在低RecA濃度時能夠以高SNR和足夠慢的且受控的速度被檢測到，因而如果存在的話，任何結合在分離物中的RecA蛋白都可被檢測到。
[0141]因此，該雙孔裝置提供了一種全新的用于基礎研究的單分子儀器，因為人們可驗證檢測額外蛋白質(zhì)向RecA-DNA蛋白絲的結合的能力，這種結合會增加蛋白絲寬度，因而可通過所觀察到的電流的降低而被檢測到。例如，結合至RecA-DNA蛋白絲的蛋白質(zhì)包括LexA和噬菌體I阻遏蛋白，其利用RecA來感測細胞的狀態(tài)并打開或關閉下游調(diào)節(jié)事件。
[0142]校準實驗可包括檢測結合至DNA上的特定序列(位點)的蛋白質(zhì)，使得蛋白誘導的電流變化隨后可允許估算DNA通過孔的速率以及速度控制性能。結合至dsDNA上的特定位點的示例性蛋白質(zhì)包括Lac阻遏蛋白(結合至21 bp區(qū)段)、噬菌體I阻遏蛋白(具有位于1-DNA上的多個操作子位點)以及其他蛋白。
[0143]實施例3.檢測和定位單鏈DNA內(nèi)的雙鏈區(qū)段
該實施例證實了利用不同長度的雙鏈區(qū)段形成多至10 kb的ssDNA。
[0144]在第一步中，可通過長片段PCR制造出10 kbp dsDNA。該鏈的一端被生物素化，以用于連接珠子，并且這些鏈通過化學變形而分開。未連接珠子的10 kb ssDNA隨后用作雙孔實驗中的被測量鏈。具有期望尺寸的互補單鏈區(qū)段可通過PCR以及隨后進行的珠子捕獲(bead capturing)和鏈分離來制造。
[0145]可使用具有不同長度且位于被測量的10 kb ssDNA內(nèi)多個位點的ssDNA區(qū)段，以一組 100 nt 的區(qū)段開始。在 Skinner et al., Nano Lett., 9 (8): 2953-60, Jan 2009 中，利用通過單個固態(tài)孔的離子電流來區(qū)分dsDNA與ssDNA同聚物，以及嘌呤和嘧啶同聚物。因此，利用該雙孔裝置，在足夠高的電壓下，將DNA中的單鏈區(qū)段和雙鏈區(qū)段區(qū)分開來的可能性是很高的。定位ssDNA和dsDNA區(qū)段使得納米孔測序能夠使用雜交輔助方法(即使所提出的該方法依賴于非常昂貴的雜交輔助工序)，并且可用來在長的距離內(nèi)展示出靶DNA序列的位置和特性(靶向測序)。人們還可利用單鏈DNA結合(SSB)蛋白作為珠子，該珠子通過結合至ssDNA并通過產(chǎn)生比dsDNA更大的阻抗來進一步放大ssDNA與dsDNA在離子電流方面的差別。
[0146]實施例4.長ssDNA的捕獲和控制以及RecA的定位
該實施例證實了長ssDNA的捕獲和控制以及結合至該ssDNA的RecA蛋白絲的檢測和定位。此外，它還顯示該雙孔裝置可以檢測到ssDNA內(nèi)的嘌呤和嘧啶同聚區(qū)段。
[0147]可如在Stefan et al., Nano Lett., 10:1414-20，2010 中所不的那樣，通過 20nm SiN 膜中的 10 nm 孔對 7 kb ssDNA 進行隨機理順(detangling)。雖然 Stefan et al.2010中的單納米孔方法通過被理順的ssDNA與孔/膜表面之間的機械接觸作用力來解開ssDNA，但發(fā)明人預期雙孔競爭電壓裝置可通過作用于最靠近每個孔的DNA骨架上的每個電壓作用力來通過電泳強迫ssDNA在足夠高的競爭電壓下在靠近孔并在孔之間進行理順。
[0148]理順以及隨后的ssDNA通過雙孔裝置的速率的精確控制對于長ssDNA分子的最終測序是重要的。在足夠高的電壓(約400 mV)時，可以區(qū)分ss-DNA內(nèi)的嘌呤同聚區(qū)段和嘧唳同聚區(qū)段(Skinner et al., Nano Lett., 9 (8): 2953-60, Jan 2009),這對于診斷應用并且可能對于癌癥研究都是有價值的。
[0149]該實施例還利用了 RecA，或其他單鏈DNA結合(SSB)蛋白，作為可檢測的“減速障礙”，該減速障礙能夠通過結合至ssDNA并制造處較大的阻抗來辨別ssDNA離子電流。這些減速障礙將允許直接量化可能的受控ssDNA速度，這又證實了所需要的I ms/nt是可實現(xiàn)的。因為RecA不需要結合至特定的三核苷酸序列位點，而優(yōu)選結合至TGG重復序列并且還趨于結合至已經(jīng)形成RecA蛋白絲的地方，因此，校準實驗需要使用確實會結合至特定的已知序列位點的其他ssDNA結合分子。根據(jù)競爭電壓值確定分子的速度需要具有已知的結合位點，當通過每個孔時，這些位點可被檢測到。一個非限制性的例子是使用雜交制一個或多個已知位點的雙鏈(或系有珠子的雙鏈)，由此可利用電流的變化來檢測每個雙鏈從每個孔通過，并且隨后估算對于選定電壓值的通過鏈速度。隨后，RecA蛋白絲可形成在這些分子上并可被檢測，并將雙鏈特征保持為基準檢測點，RecA蛋白絲可相對該基準監(jiān)測點被檢測，進而可推知它們的位置。
[0150]確定基因單倍體型的方法以及通過向dsDNA中加入熒光標記物的DNA圖譜方法(Xiao, et al., Us patent n0.7771944 B2, 2010)也可使用該雙孔裝置，因為珠子標記物(例如，量子點或任何熒光標記物)體積更大，并且就像dsDNA上的結合蛋白一樣，會產(chǎn)生電流變化。而且，該雙孔法比使用高分辨率成像方法(即，全內(nèi)反射熒光顯微鏡)來檢測和定位標記物位置更簡單且便宜很多。還要注意的是，對于檢測較大的特征(蛋白質(zhì)、雙鏈區(qū)段、珠子連接物)來說，相比于檢測較小的特征，受控遞送期間由布朗運動導致的任何速度波動具有小得多的害處。
[0151]要理解的是，雖然本發(fā)明已結合以上實施方式來描述，但前文的描述和實施例僅是解釋性的且并非是對本發(fā)明的范圍的限制。對于本發(fā)明所屬領域技術人員來說，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點和改進都是顯而易見的。
【權利要求】
1.一種裝置，包括(a)多個腔室，每個腔室與相鄰的腔室通過至少一個孔連通，其中所述裝置含有被定義為第一孔和第二孔的至少兩個孔，(b)用于將所述聚合物的至少一部分從所述第一孔移出并移入所述第二孔的裝置，以及(c)至少一個傳感器，所述傳感器能夠在所述聚合物移動通過所述第一孔和第二孔期間識別所述聚合物的單個成分，條件是當僅使用單個傳感器時，所述單個傳感器不包括設置在一個孔的兩端用來測量通過該孔的離子電流的兩個電極。
2.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中所述第一孔和第二孔的直徑為約Inm至約100nm,并且彼此隔開約10 nm至約10000 nm。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的裝置，其中所述傳感器被配置成通過測量與所述聚合物有關或與所述聚合物的一個或多個成分有關的電流、電壓、pH、光學特征或駐留時間來識別所述聚合物。
4.根據(jù)前述權利要求的任一項所述的裝置，其中所述傳感器被配置成形成隧道間隙，當所述聚合物被加載到第一孔和第二孔中時，允許所述聚合物通過所述隧道間隙。
5.根據(jù)權利要求4所述的裝置，其中所述傳感器包括具有形成所述隧道間隙的孔的膜。
6.根據(jù)權利要求5所述的裝置，其中所述孔是實質(zhì)上圓形的。
7.根據(jù)權利要 求4所述的裝置，其中所述傳感器包括兩個端部，在該兩個端部之間形成一個隧道間隙。
8.根據(jù)權利要求4所述的裝置，其中所述傳感器包括一個端部和一個實質(zhì)上平坦的表面，在該端部和表面之間形成一個隧道間隙。
9.根據(jù)權利要求4所述的裝置，其中所述傳感器包含兩個電極，所述兩個電極間隔開以在它們之間形成一個隧道間隙。
10.根據(jù)前述任一項權利要求所述的裝置，其中所述傳感器被設置在所述第一孔內(nèi)。
11.根據(jù)權利要求1-9的任一項所述的裝置，其中所述傳感器被設置在所述第一孔和第二孔之間的腔室內(nèi)。
12.根據(jù)權利要求11所述的裝置，其中所述傳感器對準所述第一孔和第二孔。
13.根據(jù)前述任一項權利要求所述的裝置，其中所述傳感器包含金、鉬、石墨烯或碳。
14.根據(jù)權利要求4-13的任一項所述的裝置，其中所述隧道間隙的寬度為約Inm至約20 nm。
15.根據(jù)權利要求4-14的任一項所述的裝置，其中所述傳感器包括由試劑實現(xiàn)的表面改性。
16.根據(jù)權利要求15所述的裝置，其中所述試劑能夠與核苷酸形成非共價鍵。
17.根據(jù)權利要求16所述的裝置，其中所述鍵是氫鍵。
18.根據(jù)權利要求15所述的裝置，其中所述試劑選自4-巰基苯甲酰胺和1-H-咪唑-2-甲酰胺。
19.根據(jù)前述任一項權利要求所述的裝置，其中所述第一孔和第二孔基本上是共軸的。
20.根據(jù)前述任一項權利要求所述的裝置，其中所述裝置包含選自以下的一種材料:硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳納米管、TiO2, HfO2, Al2O3、金屬層、玻璃、生物學納米孔、具有生物學孔插入體的膜以及它們的組合。
21.根據(jù)前述任一項權利要求所述的裝置，其中所述第一孔和所述第二孔的深度為約0.3 nm 至約 1000 nm。
22.根據(jù)前述任一項權利要求所述的裝置，所述裝置進一步包括至少兩個用于連接至電源的電極，從而生成橫跨第一孔的電壓和橫跨第二孔的電壓。
23.根據(jù)權利要求22所述的裝置，其中所述橫跨第一孔的電壓和所述橫跨第二孔的電壓是獨立可調(diào)的。
24.—種確定多核苷酸的序列的方法,包括: Ca)將包含多核苷酸的樣品加載到權利要求23所述的裝置中， (b)調(diào)節(jié)橫跨第一孔的電壓和橫跨第二孔的電壓，從而將所述多核苷酸放置成橫跨這兩個孔，其中所述多核苷酸以相同方向移動通過這兩個孔；以及 (c)使用所述傳感器識別所述多核苷酸的多個核苷酸。
25.—種確定多肽的序列的方法,包括: Ca)將包含多肽的樣品加載到權利要求23所述的裝置中， (b)調(diào)節(jié)橫跨第一孔的電壓和橫跨第二孔的電壓，從而將所述多肽放置成橫跨這兩個孔，其中所述多肽以相同方向移動通過這兩個孔；以及 (c)使用所述傳感器識別所述多肽的多個氨基酸。
【文檔編號】G01N33/487GK104024850SQ201380003740
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權日:2012年10月10日
【發(fā)明者】丹尼爾·亞歷山大·海勒, 特沃·J·墨林 申請人:雙孔兄弟公司