新穎的抗原的檢測方法及利用該檢測方法的裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，包括：步驟(a)，使結(jié)合有產(chǎn)生能夠檢測的信號的標記且與上述抗原特異性地結(jié)合的檢測抗體和分析試樣相接觸，來形成結(jié)果物；步驟(b)，使與要檢測的抗原特異性地結(jié)合的捕獲抗體和上述步驟(a)的結(jié)果物相接觸，來形成結(jié)果物；步驟(c)，使標準物質(zhì)(reference?substance)和檢測抗體相接觸，來形成結(jié)果物，上述標準物質(zhì)包含特異性地結(jié)合有上述檢測抗體的表位，并與固相底物的表面相結(jié)合，上述檢測抗體結(jié)合有產(chǎn)生上述能夠檢測的信號的標記；步驟(d)，測定從上述步驟(b)的結(jié)果物及步驟(c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號；以及步驟(e)，分析所測定的上述信號，來決定上述分析試樣的內(nèi)部抗原的存在與否或量。與現(xiàn)有的抗原檢測方法相比，在本發(fā)明的抗原檢測方法中，能夠調(diào)節(jié)分析試樣的流動(flow)及反應(yīng)時間，以提高反應(yīng)靈敏度，將分析試樣的濃度或檢測反應(yīng)溫度的影響最小化，使得數(shù)據(jù)的安全性、可靠性及再現(xiàn)性優(yōu)秀。并且，即使沒有專業(yè)技術(shù)，也能夠容易操作本發(fā)明的抗原檢測方法及檢測裝置，從而能夠通過現(xiàn)場診斷迅速掌握分析試樣的內(nèi)部檢測抗原的存在與否及量。
【專利說明】新穎的抗原的檢測方法及利用該檢測方法的裝置 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及新穎的抗原的檢測方法及利用該檢測方法的裝置。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 開發(fā)不僅能夠迅速簡單測定復(fù)雜的試樣中的分析對象（例如，抗原），且測定值的 可靠性高的抗原檢測方法的重要性越來越大。例如，在醫(yī)院的緊急情況下，臨床診斷的要點 為不熟練的技師實施復(fù)雜的化學(xué)或免疫化學(xué)分析方法，來迅速準確地測定患者的狀態(tài)。這 種化驗通常由作為臨床化學(xué)家未受過訓(xùn)練的醫(yī)院的工作人員或護士實施。就向醫(yī)院的化 驗室移送血液試樣并實施分析的當(dāng)前的臨床診斷系統(tǒng)而言，在需要迅速的化驗結(jié)果的情況 下，不妥當(dāng)。因此，需要能夠在短時間內(nèi)獲得分析結(jié)果，且利用醫(yī)院的診斷系統(tǒng)來實施化驗 的職員及裝置符合上述要求的測定方法。
[0003] 作為現(xiàn)有的抗原的測定方法，主要利用免疫檢測（immunoassay)。尤其，當(dāng)檢查腫 瘤標記物的項目時，大部分利用免疫檢測（immunoassay)。免疫檢測作為利用抗原抗體反應(yīng) 的檢測，能夠利用選擇性地與要測定的物質(zhì)相結(jié)合的抗體來測定所需的物質(zhì)。代表性的免 疫檢測的種類和原理如下。雖然按不同器官使用的方法和具體的反應(yīng)條件有所差異，但基 本原理幾乎相同。
[0004] 凝集法（顆粒免疫檢測，particle immunoassay)利用因抗原和抗體的結(jié)合而發(fā) 生凝集反應(yīng)（agglutination)的情況。大致測定如下情況，即，在紅細胞或乳膠（latex)、明 膠（gelatin)等附著抗原或抗體，當(dāng)該粒子反應(yīng)時，表示凝集。在凝集測定中，能夠利用池 度測定法（turidimetry)來測定光的吸收程度，或者利用比池法（nephelometry)來測定光 的散射程度。
[0005] 酶免疫測定法（EIA，enzyme immunoassay)利用酶反應(yīng)（enzyme reaction)來 測定抗原和抗體的結(jié)合。大部分預(yù)先在與要測定的物質(zhì)相結(jié)合的抗體附著酶，并發(fā)生抗 原抗體反應(yīng)。之后，若放入與結(jié)合的酶反應(yīng)的底物，則發(fā)生酶反應(yīng)。通常利用的酶有堿 性憐酸酶（alkaline phosphatase)、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase)、β 半 乳糖苷酶（β-galactosidase)等。酶反應(yīng)的產(chǎn)物大部分為帶色物質(zhì)，利用分光光度計 (spectrophotometer)來測定這些帶色物質(zhì)。
[0006] 在放射免疫測定法中，利用放射性同位素（radioisotope)來測定抗原和抗體的 結(jié)合。放射性同位素指在物理方面不穩(wěn)定，且自然發(fā)生衰變（放射性衰變，radioactive decay)而轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的物質(zhì)，在此過程中，放出放射線的物質(zhì)。在要測定的物質(zhì)之類的物 質(zhì)附著放射性同位素，或者在與要測定的物質(zhì)反應(yīng)的抗體附著放射性同位素，從而發(fā)生抗 原抗體反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，能夠測定從反應(yīng)物放出的放射線的量，并計算出所需的物質(zhì)濃 度。多利用的放射性同位素有 125i、131i、3h、14c、32p等。過去多利用放射免疫測定法，但這有 需要使用放射性物質(zhì)的危險，且隨著開發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫測定法等方法，使用上述放射免疫 測定法的情況越來越少。
[0007] 在熒光免疫測定法中，利用熒光反應(yīng)（fluorescence)來測定抗原和抗體的結(jié)合。 熒光反應(yīng)是指，熒光物質(zhì)吸收特定波長的光，使得熒光物質(zhì)的分子激勵（excitation)，重新 回到原來的狀態(tài)，并放出與吸收的光不同的波長的光的反應(yīng)。當(dāng)利用于免疫測定時，在要測 定的物質(zhì)之類的物質(zhì)附著熒光物質(zhì)，或者在與要測定的物質(zhì)反應(yīng)的抗體附著熒光物質(zhì)，從 而發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，若透射可進行熒光反應(yīng)的波長的光，則與熒光物質(zhì)的 量成正比地呈現(xiàn)熒光，并根據(jù)上述熒光的量來計算測定物質(zhì)的濃度。
[0008] 在化學(xué)發(fā)光免疫測定法中，利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（chemiluminescence)來測定抗 原和抗體的結(jié)合。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是指，使化學(xué)發(fā)光物質(zhì)激勵（excitation)，并回到基態(tài) (ground state)而發(fā)光的現(xiàn)象，這在使分子激勵的能量不是光而是化學(xué)反應(yīng)的方面，與突 光不同。當(dāng)利用于免疫測定時，與其他方法相同，在要測定的物質(zhì)之類的物質(zhì)附著化學(xué)發(fā)光 物質(zhì)，或者在與要測定的物質(zhì)反應(yīng)的抗體附著化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，從而發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。在反 應(yīng)結(jié)束后，并在進行所需的化學(xué)反應(yīng)之后，測定所散發(fā)的發(fā)光程度，由此計算測定物質(zhì)的濃 度。代表性的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾（luminol)、異魯米諾（isoluminol)、n丫陡酯（acridinium ester)等。
[0009] 在本發(fā)明中將要利用的抗原檢測方法是基于熒光免疫測定法的，就現(xiàn)有的熒光免 疫測定法而言，由于因試樣的濃度及反應(yīng)溫度而使抗原的測定數(shù)值發(fā)生變化，因而存在數(shù) 據(jù)的再現(xiàn)性及可靠性下降的問題，而作為改善這種問題的方法，開發(fā)了上述抗原檢測方法。 因此，本發(fā)明人基于利用抗原-抗體反應(yīng)的熒光免疫測定法，確立能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場診斷，并不 受分析試樣的濃度及反應(yīng)溫度的限制的抗原檢測系統(tǒng)。
[0010] 在本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。所引用的論文 及專利文獻的公開內(nèi)容全部引入本說明書作為參照，從而更加明確說明本發(fā)明所屬的技術(shù) 領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0011]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0012] 本發(fā)明人為了開發(fā)新穎的抗原的檢測方法而銳意研究努力。其結(jié)果，在現(xiàn)有的試 驗區(qū)域（test zone)和標準區(qū)域（reference zone)結(jié)合了互不相同的檢測抗體，來檢測僅 與試驗區(qū)域特異性地結(jié)合的抗原的方法，本發(fā)明人與此不同地開發(fā)了如下方法：使標準區(qū) 域和包含與要檢測的抗原相同的表位的標準物質(zhì)（reference substance)相結(jié)合，來在試 驗區(qū)域（test zone)和標準區(qū)域（reference zone)結(jié)合了相同的檢測抗體，由此能夠更加 準確地檢測抗原的存在及量。與現(xiàn)有的抗原檢測方法相比，利用本發(fā)明的檢測方法來調(diào)節(jié) 分析試樣的流動（flow)及反應(yīng)時間，提高反應(yīng)靈敏度，并將分析試樣的濃度或檢測反應(yīng)溫 度的影響最小化，來確認提高數(shù)據(jù)的安全性、可靠性及再現(xiàn)性的情況，從而完成本發(fā)明。
[0013] 因此，本發(fā)明的目的在于，提供新穎的抗原的檢測方法。
[0014] 本發(fā)明的另一目的在于，提供新穎的抗原的檢測裝置。
[0015] 本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點能夠通過以下的
【發(fā)明內(nèi)容】
、發(fā)明要求保護范圍及附圖來 更加明確。
[0016] 【解決課題的技術(shù)方案】
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，上述分 析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法包括：
[0018] 步驟（a)，使結(jié)合有產(chǎn)生能夠檢測的信號的標記且與上述抗原特異性地結(jié)合的檢 測抗體和分析試樣相接觸，來形成結(jié)果物；
[0019] 步驟（b)，使與要檢測的抗原特異性地結(jié)合的捕獲抗體和上述步驟（a)的結(jié)果物 相接觸，來形成結(jié)果物；
[0020] 步驟（c)，使標準物質(zhì)（reference substance)和檢測抗體相接觸，來形成結(jié)果 物，上述標準物質(zhì)包含特異性地結(jié)合有上述檢測抗體的表位，并與固相底物的表面相結(jié)合， 上述檢測抗體結(jié)合有產(chǎn)生上述能夠檢測的信號的標記；
[0021] 步驟（d)，測定從上述步驟（b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信 號；以及
[0022] 步驟（e)，分析所測定的上述信號，來決定上述分析試樣的內(nèi)部抗原的存在與否或 量。
[0023] 本發(fā)明人為了開發(fā)新穎的抗原的檢測方法而銳意研究努力。其結(jié)果，在將現(xiàn)有的 試驗區(qū)域（test zone)和標準區(qū)域（reference zone)結(jié)合了互不相同的檢測抗體，來檢測 僅與試驗區(qū)域特異性地結(jié)合的抗原，本發(fā)明人與此不同地開發(fā)了如下方法：使標準區(qū)域和 包含與要檢測的抗原相同的表位的標準物質(zhì)（reference substance)相結(jié)合，來在試驗區(qū) 域（test zone)和標準區(qū)域（reference zone)結(jié)合了相同的檢測抗體，由此能夠更加準確 地檢測抗原的存在及量。與現(xiàn)有的抗原檢測方法相比，利用本發(fā)明的檢測方法來調(diào)節(jié)分析 試樣的流動（flow)及反應(yīng)時間，提高反應(yīng)靈敏度，并將分析試樣的濃度或檢測反應(yīng)溫度的 影響最小化，來確認提高數(shù)據(jù)的安全性、可靠性及再現(xiàn)性的情況。
[0024] 上述抗原的檢測方法為測定存在于分析試樣內(nèi)的抗原的存在及量的方法，本發(fā)明 人在考慮到如下問題之后，為了開發(fā)用于改善這些問題的抗原的檢測方法而努力，其結(jié)果， 設(shè)計出了本發(fā)明的方法，具體問題如下：在現(xiàn)有的抗原檢測方法中，在分析試樣為人類的 血漿的情況下，i)與標準區(qū)域相結(jié)合的標準物質(zhì)不能成為來源于人類的肽或可與該肽相 結(jié)合的物質(zhì)，因而在選定標準物質(zhì)上受限，并且，ii)在試驗區(qū)域（test zone)和標準區(qū)域 (reference zone)結(jié)合了互不相同的檢測抗體，由此檢測結(jié)果有可能根據(jù)抗體對抗原的 親和度（affinity)而不同，iii)在分析試樣為高濃度的情況下，與結(jié)合于試驗區(qū)域的檢測 抗體的飽和度無關(guān)地，標準區(qū)域的檢測抗體繼續(xù)以規(guī)定水平與標準區(qū)域相結(jié)合，因而試驗 區(qū)域的測定信號/標準區(qū)域的信號強度的比率值不規(guī)定，iv)無法排除基本上隨著利用抗 原-抗體反應(yīng)而伴隨的溫度的影響。
[0025] 以下，對這種本發(fā)明的方法的分析試樣的內(nèi)部抗原的測定方法進行詳細說明。
[0026] 【步驟（a):檢測抗體和分析試樣的接觸】
[0027] 首先，使結(jié)合有產(chǎn)生可檢測的信號的標記且與上述抗原特異性地結(jié)合的檢測抗體 和分析試樣相接觸。
[0028] 可利用本發(fā)明的方法的分析試樣包含來源于所有哺乳動物的有機物質(zhì)（organic materials)及人為地合成的有機分子（organic molecules),但并不局限于此。上述分析 試樣優(yōu)選為全血、血漿、血清、體液或細胞培養(yǎng)上清液。
[0029] 上述有機分子（organic molecules)意味著在碳、氮、氧和/或硫原子之間具有共 價鍵的分子。有機分子可選自一氧化碳等小尺寸的分子到聚合物（polymer)等復(fù)雜的大尺 寸的分子，或者上述有機分子可以為糖苷分子。
[0030] 在本說明書中，術(shù)語"抗原"包含可利用本發(fā)明的方法來檢測的所有分子。例 如，上述抗原為存在于體內(nèi)的小分子即藥物、毒素、自身抗體（autoantibody)、自身抗原 (autoantigen)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸及其他分子?？纱嬖谟趯ο螅╯ubject)的血清 內(nèi)的抗原并不僅局限于藥物，例如包含巴比妥鹽（barbiturate)、三環(huán)類抗抑郁藥（TCA, tricyclic antidepressants)、毛地黃（Digitalis)、癌相關(guān)抗原（例如，與乳房、精巢、腦、 肝、大腸、胰臟、胃或肺癌相關(guān)的抗原）、病毒抗原（例如，與人類免疫缺陷病毒（HIV)、流感 或其他病毒相關(guān)的抗原）、細菌抗原（例如，全身性細菌感染）、激素（例如，促甲狀腺激素 (TSH)、人生長激素、黃體酮、睪丸素、絨毛膜促性腺激素（hCG))、血漿蛋白質(zhì)（例如，纖維 蛋白降解產(chǎn)物（FDP)、C-反應(yīng)蛋白（CRP)、癌胚抗原（CEA)、甲胎蛋白（AFP)、癌胚蛋白）、原 生動物抗原（protozoal antigens)、血小板抗原（plaque antigens)、半抗原（例如，血管 緊張素 I、血管升壓素、生長抑素、心房利鈉激素 （atrial natriuretic hormone)、內(nèi)皮素 (endoserine)、黃體生成素釋放激素（LHRH)、肛裙娃肽（kassinin)或其他肽）、類固醇（例 如，皮質(zhì)醇）及細胞因子（例如，白細胞介素-1、干擾素-α、干擾素-β、干擾素、白細胞 介素-2、白細胞介素-4、白細胞介素-6、白細胞介素-7、白細胞介素-12、白細胞介素-15、 B7、CD28或其他免疫球蛋白超家族（IgSF)成員）。
[0031] 上述病毒抗原包含公知的各種病毒抗原，例如，包含與A型肝炎病毒、B型肝炎病 毒、C型肝炎病毒、流感、水痘（varicella)、腺病毒、單純皰疫病毒I型、單純皰疫病毒II 型、牛瘟（rinderpest)、鼻病毒、?？刹《尽⑤啝畈《?、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、乳多 空病毒、巨細胞病毒、棘狀病毒（echino virus)、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎 病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人類免疫缺陷病毒I型、人類免疫缺陷病毒II 型、微小核糖核酸病毒科、腸病毒、披膜病毒（例如，甲病毒屬、黃病毒屬、冠狀病毒屬、狂犬 病病毒、埃博拉病毒、人類T細胞白血病病毒I型、人類T細胞白血病病毒II型、慢病毒多 瘤病毒、細小病毒屬、EB(epstein-barr)病毒、人類皰疫病毒-6、皰疫病毒1或水痘病毒） 相關(guān)的抗原或者從上述病毒所生產(chǎn)的抗原，但并不局限于此。
[0032] 上述細菌抗原包含公知的各種細菌抗原，例如，包含與分枝桿菌立克次氏體 (Mycobacteria rickettsia)、支原體（Mycoplasma)、奈瑟菌屬（Neisseria spp·)、軍團 菌（Legionella)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、鏈球菌（Streptococci)、白喉棒狀桿 菌（Corynebacteria diphtheriae)、破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani)、百日咳桿菌 (Bordetella pertussis)、嗜血桿菌屬（Haemophilus spp·)、衣原體屬（Chlamydia spp.) 或產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli)相關(guān)的抗原或者從上述細 菌所生產(chǎn)的抗原，但并不局限于此。
[0033] 上述原生動物抗原包含公知的各種原生動物抗原，例如包含與瘧原蟲 屬（Plasmodia)、艾美球蟲屬（Bimeria)、利什曼蟲屬（Leishmania)或錐體蟲屬 (Trypanosoma)相關(guān)的抗原或者從上述原生動物所生產(chǎn)的抗原，但并不局限于此。
[0034] 上述癌相關(guān)抗原（cancer-related antigen)包含公知的各種癌相關(guān)抗原，例如， 包含存活素（survivin)、細胞周期蛋白D1、人類表皮生長因子受體2(Her2/neu)、K-ras、 胰凝乳蛋白酶原、X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白（ΧΙΑΡ,Χ-linked inhibitor of apoptosis protein)、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、表皮生長因子（EGF, Epidermal Growth Factor)受體、癌胚抗原（CEA)、前列腺特異性抗原（PSA)、甲胎蛋白、β 2微球蛋白、膀胱癌 抗原（BTA)、嗜鉻粒蛋白A、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S-100蛋白質(zhì)、TA-90蛋白質(zhì)、組織肽抗 原（TPA)及人絨毛膜促性腺激素（hCG)，但并不局限于此。優(yōu)選地，上述癌相關(guān)抗原為前列 腺特異性抗原。
[0035] 除了上述抗原之外，本發(fā)明的抗原包含污染物質(zhì)、毒素、有毒化學(xué)物質(zhì)、法醫(yī)學(xué)物 質(zhì)或與其類似的物質(zhì)。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述抗原為藥物、毒素、自身抗體（autoantibody)、自身 抗原（autoantigen)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸或癌相關(guān)抗原，更優(yōu)選為癌相關(guān)抗原。
[0037] 本發(fā)明的方法利用兩種形態(tài)的抗體，即檢測抗體及捕獲抗體。術(shù)語"檢測抗體"意 味著可與由上述捕獲抗體捕獲的上述抗原或標準物質(zhì)相結(jié)合的抗體。在本說明書中，術(shù)語 "捕獲抗體"意味著可與要從分析試樣檢測的上述抗原相結(jié)合的抗體。可利用于本發(fā)明的方 法的抗體用于檢測分析試樣內(nèi)的抗原，并包含與分析試樣內(nèi)的抗原特異性地結(jié)合的核苷酸 序列的表位。利用于本說明書的抗體不僅包含可與要檢測的表位、抗原或抗原片段相結(jié)合 的整個抗體，還包含抗體片段（例如，F(xiàn)(ab'）2、Fab'、Fab、Fv)。利用于本發(fā)明的抗體為多 克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。
[0038] 對于上述抗原的抗體可利用在該領(lǐng)域中通常所實施的方法，例如融合方法 (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology,6 :511-519(1976))、重組 DNA方法（美國專利第481656號）或噬菌體抗體庫方法（Clackson et al，Nature, 352 : 624-628(1991)及 Marks et al，J。Mol。Biol.，222 :58,1-597(1991))來制成。在 Harlow， E.and Lane, D. , Using Antibodies ：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999 ；Zola,H. ,Monoclonal Antibodies ：A Manual of Techniques，CRC Press， Inc.，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1984;及Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUN0L0GY，Wiley/ Greene，NY，1991中詳細記載了制造抗體的一般過程，上述文獻插入于本說明書作為參照。
[0039] 上述檢測抗體結(jié)合有產(chǎn)生可檢測的信號的標記。術(shù)語"信號"意味著可檢測的 參數(shù)（parameter)，包含光學(xué)參數(shù)、電性參數(shù)或磁性參數(shù)的流動、突光放射、紅外線放射、 紫外線放射、化學(xué)發(fā)光、光反射或上述信號的吸收程度。產(chǎn)生可檢測的信號的標記包含化 學(xué)物質(zhì)（例如，生物素）、酶（堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶及細胞色素 Ρ450)、放射性物質(zhì)（（例如，14C、125I、3H、32P及 35S)、熒光物質(zhì)（例如，熒光素）、發(fā)光物質(zhì)、化 學(xué)發(fā)光物質(zhì)（chemiluminescent)及突光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，fluorescence resonance energy transfer),但并不局限于此。在 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999 中記載了各種標記 (label)及標記方法。優(yōu)選地，作為產(chǎn)生可檢測的信號的標記，利用熒光物質(zhì)。
[0040] 上述標記可根據(jù)發(fā)散的波長而觀察出分別不同的熒光信號，優(yōu)選地，上述標記 以與檢測抗體相結(jié)合的形態(tài)與捕獲抗體或標準物質(zhì)相結(jié)合。上述標記可包含公知的各 種熒光物質(zhì)，例如，熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、藻紅蛋白、熒光黃、B-藻紅蛋 白、9-卩丫陡異硫氰酸酯（9-acridine isothiocyahate)、突光黃VS、4-乙酰氨基-4' -異 硫代氰酸根合苗 _2,2，_ 二橫酸（4_acetamid〇-4' -iso-thio-cyanato stilbene-2， 2' -disulfonic acid)、7_二乙基氨基-3_(4'-異硫氰酸苯基）-4-甲基香豆素（7_di ethylamin〇-3-(4 ' -isothiocyanate phenyl) -4-methyl coumarin)、玻拍酉先亞胺-花 丁酸（succinimidyl-pyrene butyrate)、4-乙酰氨基-4' -異硫代氰酸根合苗-2, 2' -二磺酸衍生物、LC?-Red 640、LC?-Red 705、PC5、Cy5、Cy5. 5、麗絲胺、異硫氰酸酯 (isothiocyahate)、赤蘚紅異硫氰酸酯（erythrosine isothiocyanate)、二乙烯三胺五乙 酸酯（diethylene triamine pentaacetate)、l_二甲氨基萘_5_橫酸鹽（l-dimethylamino naphthyl-5-sulfonate)、1-苯胺基 _8_ 萘石黃酸（l-anilin〇-8-naphthalene sulfonate)、 2_ 對甲苯氛基 _6_ 蔡橫酸鹽（2-p-toluidinyl-6_naphthalene sulfonate)、3_ 苯 基-7-異氰酸基香豆素（3-phenyl-7_isocyanato coumarin)、9_異硫氰酸卩丫陡、卩丫陡橙、 N-(對-(2_苯并惡唑基）苯基）馬來醜亞胺（N-(p-(2-benzoxazolyl)phenyl)maleimide)、 苯并惡二唑（benzoxadiazole)、苗（stilbene)及花（pyrene),但并不局限于此。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的方法，與抗原-特異性檢測抗體相結(jié)合的標記放出的信號測定為熒 光信號，可分別測定試驗區(qū)域及標準區(qū)域的兩信號，來確認要檢測的抗原的存在與否及量。 上述檢測抗體及捕獲抗體具有與上述抗原特異性地結(jié)合的親和性（affinity)，并不與利用 于本發(fā)明的方法的其他任何試劑反應(yīng)。
[0042] 【步驟（b):捕獲抗體及上述步驟（a)的結(jié)果物的接觸】
[0043] 接著，使上述步驟（a)的結(jié)果物和與要檢測的抗原特異性地結(jié)合的捕獲抗體相接 觸。S卩，使步驟（a)的結(jié)果物與試驗區(qū)域（test zone)或標準區(qū)域（reference zone)的抗 原-特異性捕獲抗體或標準物質(zhì)相結(jié)合。
[0044] 在本說明書中，術(shù)語"捕獲抗體"如步驟（a)所述。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述捕獲抗體與固相底物的表面相結(jié)合，上述捕獲抗體 存在于實現(xiàn)反應(yīng)物的連續(xù)流動的一個反應(yīng)容器的底物表面上，上述反應(yīng)容器為設(shè)有微通道 的微芯片。
[0046] 在本說明書中，術(shù)語"固相底物（solid substrate) "能夠以固相載體（solid support)或與固相（solid phase)相同的含義使用，并意味著非液相物質(zhì)。優(yōu)選地，上述固 相底物可形成于上述微通道內(nèi)，例如，能夠以在膜（membrane)、毛細管的一部分或微通道內(nèi) 流動/粘附的小直徑珠子（small diameter beads)存在。這種形態(tài)的公知的物質(zhì)包含聚 苯乙烯（polystyrene)、聚丙烯（polypropylene)、玻璃、金屬及凝膠等碳氫化合物聚合物。 上述固相底物能夠以試紙條、微量滴定板、粒子（例如，珠子）、親和柱及免疫印跡膜（例如， 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride)膜）的形態(tài)存在（參照美國專利第5143825號、 美國專利第5374530號、美國專利第4908305號及美國專利第5498551號）。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的其他優(yōu)選實例，上述微芯片的微通道包括試驗區(qū)域（test zone)及 標準區(qū)域（reference zone),上述試驗區(qū)域的表面結(jié)合有上述捕獲抗體，上述標準區(qū)域結(jié) 合有上述標準物質(zhì)。
[0048] 在本說明書中，術(shù)語"試驗區(qū)域（test zone)"為包括在上述微芯片的微通道內(nèi)的 區(qū)域，試驗區(qū)域的表面結(jié)合有上述捕獲抗體，在捕獲抗體結(jié)合有要檢測的上述抗原及與上 述抗原特異性地結(jié)合的檢測抗體。
[0049] 在本說明書中，術(shù)語"標準區(qū)域（reference zone) "為包括在上述微芯片的微通道 內(nèi)的區(qū)域，標準區(qū)域的表面結(jié)合有標準物質(zhì)（reference substance)，在標準物質(zhì)結(jié)合有與 要檢測的上述抗原特異性地結(jié)合的檢測抗體。
[0050] 在本說明書中，術(shù)語"標準物質(zhì)"意味著可使上述檢測抗體結(jié)合的物質(zhì)，根據(jù)本發(fā) 明的優(yōu)選實例，上述標準物質(zhì)為與上述抗原相同的物質(zhì)或者包含上述表位的上述抗原的片 段。
[0051] 上述抗體、抗原或標準物質(zhì)可通過物理吸附或化學(xué)粘附來附著于固相底物。在適 當(dāng)?shù)木彌_液中的抗體或抗原和固相材料之間通過反應(yīng)來執(zhí)行物理吸附。緩沖液有磷酸鹽緩 沖液、Tris-鹽酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液等。在4?37°C溫度下，尤其在室溫條件下，混合 上述緩沖液并維持特定時間而執(zhí)行反應(yīng)?？赏ㄟ^使用肽附著方法中的碳化二亞胺法來執(zhí)行 化學(xué)附著。其他化學(xué)法為由戊二醒（glutaraldehyde)或三聚氯氰（cyanuric chloride) ("肽合成法"、丸善（Maruzen)、1975或"酶免疫測定法"、交流書版、"蛋白質(zhì)核酸酶"、特別 號31，1987)等二價橫向連接的試劑執(zhí)行的方法。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述分析試樣適用于上述微芯片，適用的上述分析試樣 通過形成于上述微通道的流動與上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域相接觸。并且，上述分析試樣可 依次與上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域相接觸，或者依次與上述標準區(qū)域及試驗區(qū)域相接觸。
[0053] 如上所述，本發(fā)明的檢測方法表現(xiàn)為在使檢測抗體與分析試樣相接觸之后，與捕 獲抗體相接觸，但這只便于記載，并不排除如下情況：在本發(fā)明的檢測方法中，i)在以相反 方式進行上述過程的情況下，即，首先執(zhí)行使分析試樣與上述捕獲抗體相接觸的步驟，接著 使分析試樣和捕獲抗體的反應(yīng)結(jié)果物與檢測抗體相接觸，以及ii)使分析試樣同時與檢測 抗體及捕獲抗體相接觸。
[0054] 在上述過程中，首先執(zhí)行使分析試樣與上述檢測抗體相接觸的步驟，接著使分析 試樣和檢測抗體的反應(yīng)結(jié)果物與捕獲抗體相接觸，這種情況下，可在微芯片內(nèi)或微芯片外 進行上述分析試樣和檢測抗體的反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的具體的一實施例，在微芯片外進行上 述反應(yīng)。
[0055] 【步驟（c):標準物質(zhì)（reference substance)及結(jié)合有產(chǎn)生可檢測的信號的標記 的檢測抗體的接觸】
[0056] 在使檢測抗體及上述步驟（a)的結(jié)果物相接觸之后，使標準物質(zhì)（reference substance)與檢測抗體相接觸，上述標準物質(zhì)包含特異性地結(jié)合有上述檢測抗體的表位， 并與固相底物的表面相結(jié)合，上述檢測抗體結(jié)合有產(chǎn)生上述可檢測的信號的標記，
[0057] 在本說明書中，就術(shù)語"表位"而言，抗體結(jié)合的抗原的部位意味著抗原決定簇 (antigenic determinant)，上述標準物質(zhì)可包含一種以上的表位，或者包含一種以上的相 同的表位，但優(yōu)選地，上述檢測抗體結(jié)合的表位選擇在標準物質(zhì)上可僅發(fā)現(xiàn)一次的序列。
[0058] 【步驟⑷：信號的測定】
[0059] 接著，使用信號測定裝置來測定從上述步驟（b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的 標記所產(chǎn)生的信號。上述信號測定裝置的詳細說明見以下內(nèi)容。
[0060] 【步驟（e):信號的分析】
[0061] 分析在上述步驟（d)中所測定的信號，來決定上述分析試樣內(nèi)的抗原的存在與否 或量。
[0062] 根據(jù)上述信號的量（amount)來決定抗原的存在及量，術(shù)語"量（amount) "以包括 在可測定上述信號的靈敏度（sensitivity)的特定電平（level)內(nèi)為前提，意味著作為物 理參數(shù)的上述信號的強度（intensity)增加、減少或維持的程度。例如，若信號以10單位 增加，且信號的測定靈敏度在1單位的范圍內(nèi)，則可測定信號量。上述信號的量能夠以任意 單位表示。
[0063] 可在設(shè)有微通道（microchannel)的微芯片中實施上述步驟（a)?步驟（d)或上 述步驟（b)?步驟（d)，上述信號分析是測定由上述微通道提供的反應(yīng)開始區(qū)域、試驗區(qū) 域、標準區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū)域中的信號而實施的。
[0064] 可從上述反應(yīng)開始區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū)域的信號計算出出錯率（％)，在出錯率為 20%以上的情況下，重新實施分析，以提高試驗區(qū)域及標準區(qū)域信號的可靠性。術(shù)語"出錯 率（error rate)"是因分析試樣的粘性或流動性（flow)不規(guī)定而導(dǎo)致信號的分析結(jié)果不 同，且由于實施分析的實驗人員操作不熟練而導(dǎo)致信號的分析結(jié)果不同，因而將由此產(chǎn)生 的誤差最小化，并為了獲得數(shù)據(jù)的可靠性而測定的值。
[0065] 術(shù)語"反應(yīng)開始區(qū)域"及"反應(yīng)結(jié)束區(qū)域"為包括在上述微芯片的微通道內(nèi)的區(qū)域， 是以規(guī)定間隔劃分微通道內(nèi)的信號測定區(qū)域的區(qū)域（0-900)中的一部分。
[0066] 上述反應(yīng)開始區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū)域可根據(jù)抗原的種類來改變區(qū)域。根據(jù)一例，在 利用本發(fā)明的方法來檢測PSA抗原的實驗中，反應(yīng)開始區(qū)域為整個"0?900"范圍中的 180?370的區(qū)域，反應(yīng)結(jié)束區(qū)域相當(dāng)于700?880的區(qū)域（參照圖1)。
[0067] 微通道內(nèi)的信號測定區(qū)域由反應(yīng)開始區(qū)域、試驗區(qū)域、標準區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū)域 構(gòu)成，當(dāng)以曲線圖表示各區(qū)域中的信號時，以如下方式計算信號量。在曲線圖中，橫軸可由 以規(guī)定間隔劃分微通道內(nèi)的信號測定區(qū)域的區(qū)域（〇?900)表示，縱軸可由熒光信號的量 (強度）表示。
[0068] 【數(shù)學(xué)式1】
[0069]
[0070]【數(shù)學(xué)式2】
【權(quán)利要求】
1. 一種分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于， 包括： 步驟（a)，使結(jié)合有產(chǎn)生能夠檢測的信號的標記且與上述抗原特異性地結(jié)合的檢測抗 體和分析試樣相接觸，來形成結(jié)果物， 步驟（b)，使與要檢測的抗原特異性地結(jié)合的捕獲抗體和上述步驟（a)的結(jié)果物相接 觸，來形成結(jié)果物， 步驟（c)，使標準物質(zhì)和檢測抗體相接觸，來形成結(jié)果物，上述標準物質(zhì)包含特異性地 結(jié)合有上述檢測抗體的表位，并與固相底物的表面相結(jié)合，上述檢測抗體結(jié)合有產(chǎn)生上述 能夠檢測的信號的標記， 步驟（d)，測定從上述步驟（b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號，以 及 步驟（e)，分析所測定的上述信號，來決定上述分析試樣的內(nèi)部抗原的存在與否或量； 上述步驟（a)?步驟（d)或上述步驟（b)?步驟（d)在設(shè)有微通道的微芯片實施，上 述信號分析是測定由上述微通道提供的反應(yīng)開始區(qū)域、試驗區(qū)域、標準區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū) 域中的信號而實施的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述捕獲抗 體與固相底物的表面相結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述捕獲抗 體及標準物質(zhì)存在于實現(xiàn)反應(yīng)物的連續(xù)流動的一個微芯片的底物表面上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述微芯片 的微通道包括試驗區(qū)域及標準區(qū)域，上述試驗區(qū)域的表面結(jié)合有上述捕獲抗體，上述標準 區(qū)域結(jié)合有上述標準物質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述分析試 樣適用于上述微芯片，所適用的上述分析試樣通過形成于上述微通道的流動與上述試驗區(qū) 域及標準區(qū)域相接觸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述分析試 樣依次與上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域相接觸，或者依次與上述標準區(qū)域及試驗區(qū)域相接觸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述標準物 質(zhì)為與上述抗原相同的物質(zhì)或者包含上述表位的上述抗原的片段。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，所測定的上 述信號的分析用來計算從上述步驟（b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號 的強度的比率。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于， 所測定的上述信號的分析還包括計算在上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域所測定的信號的出 錯率的分析步驟； 上述出錯率是測定從上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域位于規(guī)定距離的反應(yīng)開始區(qū)域及反應(yīng) 結(jié)束區(qū)域的信號而出現(xiàn)的； 從上述反應(yīng)開始區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū)域計算出的出錯率為20%以上的情況下，重新實施 上述信號分析； 上述出錯率由[I (反應(yīng)開始區(qū)域的信號-反應(yīng)結(jié)束區(qū)域的信號）1/反應(yīng)開始區(qū)域的信 號]χιοο來計算。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述分析試 樣為全血、血漿、血清、體液或細胞培養(yǎng)上清液。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述抗原為 藥物、毒素、自身抗體、自身抗原、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸或癌相關(guān)抗原。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述抗原 為癌相關(guān)抗原。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，從上述步驟 (b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號的強度的比率值相對于上述步驟 (a) 的分析試樣的濃度成線性比例。
14. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，從上述步驟 (b) 的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號的強度的比率值不受實施上述分析 試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法的溫度變化的影響。
15. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，從上述步驟 (b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號的強度的比率值在實施上述分析試 樣的內(nèi)部抗原的檢測方法的10?30°C溫度范圍下表示相同的值。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法，其特征在于，上述分析試 樣的內(nèi)部抗原的濃度在〇. 〇〇〇lng/ml?4500ng/ml范圍。
17. -種分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，包括： (a) 微芯片，設(shè)有微通道，上述微通道用于收容分析試樣，并實現(xiàn)反應(yīng)； (b) 試驗區(qū)域，形成于上述微通道的一個部位，上述試驗區(qū)域的表面結(jié)合有與要檢測的 抗原特異性地結(jié)合的捕獲抗體；以及 (c) 標準區(qū)域，形成于上述微通道的一個部位，上述標準區(qū)域的表面結(jié)合有標準物質(zhì)， 上述標準物質(zhì)包含特異性地結(jié)合有檢測抗體的表位。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述分析 試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置還包含檢測抗體，上述檢測抗體結(jié)合有產(chǎn)生能夠檢測的信號的 標記，并與上述抗原特異性地結(jié)合。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述 分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置還包括測定單元，上述測定單元測定從上述標記所產(chǎn)生的 信號。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述分析 試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置還包括分析單元，上述分析單元計算在上述試驗區(qū)域及標準區(qū) 域所測定的信號的強度的比率。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于， 上述分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置還包括分析單元，上述分析單元計算在上述試驗 區(qū)域及標準區(qū)域所測定的信號的出錯率； 上述出錯率是測定從上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域位于規(guī)定距離的反應(yīng)開始區(qū)域及反應(yīng) 結(jié)束區(qū)域的信號而出現(xiàn)的； 從上述反應(yīng)開始區(qū)域及反應(yīng)結(jié)束區(qū)域計算出的出錯率為20%以上的情況下，重新實施 上述信號分析； 上述出錯率由I (反應(yīng)開始區(qū)域的信號-反應(yīng)結(jié)束區(qū)域的信號）1/反應(yīng)開始區(qū)域的信 號X 100來計算。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述分析 試樣適用于上述微芯片，所適用的上述分析試樣通過形成于上述微通道的流動與上述試驗 區(qū)域及標準區(qū)域相接觸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述分析 試樣依次與上述試驗區(qū)域及標準區(qū)域相接觸，或者依次與上述標準區(qū)域及試驗區(qū)域相接 觸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述標準 物質(zhì)為與上述抗原相同的物質(zhì)或者包含上述表位的上述抗原的片段。
25. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述分析 試樣為全血、血漿、血清、體液或細胞培養(yǎng)上清液。
26. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述抗原 為藥物、毒素、自身抗體、自身抗原、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸或癌相關(guān)抗原。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述抗原 為癌相關(guān)抗原。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述信號 的強度的比率值相對于上述分析試樣的濃度成線性比例。
29. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，從上述步 驟（b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號的強度的比率值不受上述分析試 樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置工作時的溫度變化的影響。
30. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，從上述步 驟（b)的結(jié)果物及步驟（c)的結(jié)果物的標記所產(chǎn)生的信號的強度的比率值在實施上述分析 試樣的內(nèi)部抗原的檢測方法的10?30°C溫度范圍下表不相同的值。
31. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析試樣的內(nèi)部抗原的檢測裝置，其特征在于，上述分析 試樣的內(nèi)部抗原的濃度在〇. 〇〇〇lng/ml?4500ng/ml的范圍。
【文檔編號】G01N33/53GK104126121SQ201380010090
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月20日
【發(fā)明者】鄭燦一, 李昌燮, 黃正九, 丁鐘植 申請人:納諾恩科技有限公司