用于慢性hbv患者的反應預測和療法監(jiān)測的hbv免疫復合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于將患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的方法，所述方法包括步驟：a)確定所述受試者的樣品中HBV免疫復合物的量，b)將步驟a)中獲得的HBV免疫復合物的量與參考值比較，和c)基于步驟b)中比較的結(jié)果，將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感。本發(fā)明進一步涉及確定來自患有HBV感染的受試者的樣品中HBV免疫復合物的量的用途和HBV免疫復合物的檢測劑用于將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的用途。另外，本發(fā)明涉及可將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的裝置和試劑盒。
【專利說明】用于慢性HBV患者的反應預測和療法監(jiān)測的HBV免疫復合 物
[0001] 本發(fā)明涉及診斷學領(lǐng)域。特別地，它涉及用于將患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的 受試者鑒定為對干擾素治療敏感的方法，所述方法包括步驟：a)確定所述受試者的樣品中 HBV免疫復合物的量，b)將步驟a)中獲得的HBV免疫復合物的量與參考值比較，和c)基于 步驟b)中比較的結(jié)果，將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感。本發(fā)明進一步 涉及確定來自患有HBV感染的受試者的樣品中HBV免疫復合物的量的用途和HBV免疫復合 物的檢測劑的用途，用于將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感。另外，本發(fā)明 涉及允許將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的裝置和試劑盒。
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV)引起的肝臟傳染性炎性疾病。該病毒因暴露于 體液而傳播，通過輸血、透析、毒品成癮者共用針頭和圍產(chǎn)期感染傳播是主要的傳播模式。
[0003] 急性乙型肝炎病毒感染以肝臟炎癥、嘔吐和黃疸為特征。癥狀一般持續(xù)幾周并且 隨后逐漸改善，同時免疫系統(tǒng)清除感染。完全康復和建立保護性免疫的概率隨年齡而增加： 盡管僅5 %成人將患有持續(xù)多于數(shù)周的持續(xù)性感染，即慢性HBV感染，但是對于幼兒，這種 比率升至70%、并且對于圍產(chǎn)期感染的新生兒，升至95%。
[0004] 慢性HBV與形成肝硬化和肝癌的嚴重風險相關(guān)，這是為何HBV已經(jīng)由WHO國際癌 癥研究機構(gòu)（WHO, s International Agency for the Research on Cancer，IARC)劃歸為 I類致癌原，即對人致癌的病原體。因此對患者而言接受治療允許患者的免疫系統(tǒng)清除感染 的治療是極為重要的。常見治療方案包括抑制病毒DNA聚合酶的核苷或核苷酸類似物，連 同干擾素 α。一項重要改進是將peg化干擾素（例如Pegasys?])引入療法，從而提供 延長的干擾素半壽期。關(guān)于HBV感染的流行病學和治療的綜述，見J.L.Dienstag N Engl J Med 2008, 359 ; 1486-1500。
[0005] 慢性HBV感染的血清學是復雜的，因為在一方面，抗HBV高滴度與疾病的嚴重性直 接相關(guān)，但在另一方面，發(fā)現(xiàn)抗HBV e抗原抗體在自發(fā)性血清轉(zhuǎn)換（即從血清清除HBV e抗 原）多年前即存在于患者中（Maruyama等人，（1993)，J. Clin. Invest. 91，2586-2595)。盡管 治療改進，但仍僅一部分患者將經(jīng)過治療清除感染，而其他患者將不清除。第二組患者（非 反應個體）的成員常?？梢栽诟みM的治療方案（例如劑量增加、治療延長或額外用藥） 下清除感染。因此將需要能夠預測患者對標準干擾素治療的反應，目的在于從一開始就可 以調(diào)整治療。在最近的改進中，發(fā)現(xiàn)在12周治療后確定患者樣品中HBV可溶性抗原（HBsAg) 的變化允許利用臨界值預測療法成效。然而，臨界值僅對還存在HBV e抗原（HBeAg)陽性 的患者有效，所致患者主要是亞太地區(qū)患者中的病例。在例如歐洲主要為HBeAg陰性的患 者中，臨界值非常難以限定，使用在療法啟動和第12周之間至少10%的下降作為臨時替代 物。
[0006] 最近，據(jù)報道在HBeAg陽性患者中，在療法啟動之前高含量的包含HBsAG和抗 HBsAg-IgG的HBV復合物與對標準干擾素療法的良好反應相關(guān)。然而，這不允許預測HBeAg 陰性患者?？傊?，目前沒有這樣的方法，所述方法將允許在治療啟動之前對全部患者組預測 療法成效，無論他們的HBeAg狀態(tài)如何。
[0007] 因此，作為本發(fā)明基礎的技術(shù)問題可以視為提供用于符合前述需要的手段和方 法。這個技術(shù)問題通過權(quán)利要求中及下文表征的實施方案解決。
[0008] 因此，本發(fā)明涉及一種用于將患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受試者鑒定為對干 擾素治療敏感的方法，所述方法包括步驟：
[0009] a)確定所述受試者的樣品中HBV免疫復合物的量，
[0010] b)將步驟a)中獲得的HBV免疫復合物的量與參考值比較；并且
[0011] c)基于步驟b)中比較的結(jié)果，將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏 感。
[0012] 本發(fā)明的方法優(yōu)選地是一種體外方法。另外，它可以包括除上文明確提到的那些 之外的步驟。例如，其他步驟可以例如涉及預處理步驟a)的樣品或評價由該方法獲得的結(jié) 果。另外，可以使用內(nèi)部對照，如樣品質(zhì)量對照或性能對照。該方法可以手工地實施或由自 動化輔助。優(yōu)選地，步驟（a)至（c)可以總體上或部分地由自動化輔助，例如由用于確定步 驟（a)中HBV免疫復合物的合適機器人設備和感知設備輔助。
[0013] 如本文所用，術(shù)語"鑒定"意指將受試者劃入對干擾素治療敏感的受試者組（所謂 "反應個體")，或劃入對干擾素治療不敏感的受試者組（所謂"非反應個體")。如本領(lǐng)域技術(shù) 人員將理解，前述鑒定通常不旨在對于待分析的受試者達到100%正確。然而，本術(shù)語要求 評估將對統(tǒng)計顯著部分的待分析的受試者有效。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地使用各種熟知的 統(tǒng)計評價工具（例如，置信區(qū)間確定、P -值測定、student氏t-檢驗、Mann-Whitney檢驗等） 確定某個部分是否為統(tǒng)計顯著。詳見Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wi ley&Sons, New York 1983。優(yōu)選的置信區(qū)間是至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 % 或至少99%。p-值優(yōu)選地是0. 1、0. 05、0. 01、0. 005或0. 0001。優(yōu)選地，本發(fā)明構(gòu)思的概率 允許這種區(qū)分將對給定族群或群體的至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %受試者是 正確的。
[0014] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明方法的鑒定可以在不知曉受試者的HBV e抗原狀態(tài)的情況下 實現(xiàn)，即這種鑒定導致將受試者正確劃分至對干擾素治療敏感的受試者組或?qū)Ω蓴_素治療 不敏感的受試者組，無論所研究受試者的HBeAg狀態(tài)如何。因而，該方法可以適用于血清樣 品中具有可檢測量的HBeAg的受試者以及適用于血清樣品中沒有可檢測量的HBeAg的受試 者。
[0015] 術(shù)語"乙型肝炎病毒（HBV) "指來自嗜肝DNA病毒科的作為乙型肝炎的致病因子的 病毒物種。HBV病毒粒子由外膜（也稱作脂質(zhì)包膜）、二十面體核衣殼和DNA基因組組成。 HBV在本領(lǐng)域中熟知并已得到表征。
[0016] 術(shù)語"乙型肝炎病毒感染"或"HBV感染"指HBV在受試者中的可檢測存在。優(yōu) 選地，通過在來自受試者的樣品中檢測出至少一種病毒多肽診斷HBV存在，更優(yōu)選地，檢測 至少一種病毒抗原 HBs (HBsAg，Genbank 登錄號 AAL66340. 1 GI: 18252577, SEQ ID NO: 1)， HBc (HBcAg，Genbank 登錄號 CAA51257. 1 GI: 288930, SEQ ID NO: 2)和 HBe (HBeAg，Genbank 登錄號AAM96930. 1 GI:22530876，SEQ ID N0:3)。技術(shù)人員理解，將HBV多肽作為生物標 記提及，不作為具體多肽提及，并且術(shù)語HBV涵蓋可能包含前述HBV多肽的序列變體的各 種HBV毒株。因此，具有以GenBank登錄號保藏的具體序列的前述多肽應理解為代表生物 標記的示例性序列。根據(jù)本發(fā)明還涵蓋變體多肽，所述變體多肽因至少一個氨基酸添加、 置換和/或缺失而與具體序列的多肽不同，只要它們也合適作為如上文討論的HBV感染的 生物標記。優(yōu)選地，變體多肽與具體多肽同一至少70%、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。如本文所用，術(shù)語"同一"指以如下為特征 的序列同一性：確定兩個核酸序列或氨基酸序列之間相同氨基酸的數(shù)目，其中比對所述序 列以獲得最高等級的匹配?？梢允褂迷谟嬎銠C程序中代碼化的公開技術(shù)或方法如，例如 BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschull990，JMolBiol 215,403)來計算。在一個方面，在 整個氨基酸序列范圍內(nèi)計算同一性百分數(shù)值。對于技術(shù)人員，一系列基于多種算法的程序 可用于比較不同的序列。在這種情況下中，Needleman和Wunsch算法或Smith和Waterman 算法產(chǎn)生特別可靠的結(jié)果。為實施序列比對，可以使用程序PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5,151)或程序 Gap 和 BestFit(Needleman 1970, J Mol Biol 48 ;443;Smith 1981，Adv Appl Math 2, 482)，所述程序是GCG軟件包（Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)的部分。在本發(fā)明的另一個方面，使用程序GAP,在 整個序列區(qū)域范圍內(nèi)采用以下設置確定上文以百分數(shù)（％)提及的序列同一性值：空位權(quán) 重：50,長度權(quán)重：3,平均匹配：10. 000和平均錯配：0. 000,除非另外說明，否則應當總是使 用所述設置作為序列比對的標準設置。
[0017] 還優(yōu)選地，通過在來自受試者的樣品中檢出至少一種病毒多核苷酸、優(yōu)選地病毒 DNA，檢測HBV的存在。病毒多核苷酸或整個HBV基因組的核苷酸序列是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu) 選地，HBV核苷酸序列以GenBank登錄號NC_003977. 1保藏。技術(shù)人員理解，將HBV多核苷 酸作為生物標記提及，不作為具體多核苷酸提及，并且術(shù)語HBV涵蓋包含變異核苷酸序列 的各種HBV毒株。因此，具有以GenBank登錄號保藏的具體序列的前述多核苷酸應理解為 代表生物標記的示例性序列。根據(jù)本發(fā)明還涵蓋變體多核苷酸，所述變體多核苷酸因至少 一個核苷酸添加、置換和/或缺失而不同于具有具體序列的變體多核苷酸，只要它們也合 適作為如上文討論的HBV感染的生物標記。優(yōu)選地，變體多核苷酸與具體多核苷酸同一至 少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %。同 一性可以如本文中他處對氨基酸序列所述那樣計算。
[0018] 優(yōu)選地，本文中提及的HBV感染是慢性HBV感染，其中所述慢性HBV感染優(yōu)選地以 HBV在受試者中可檢測地存在多于4周、多于5周、多于6周、多于7周、多于8周、多于9周、 多于10周、多于11周或多于12周為特征。更優(yōu)選地，本文中提及的慢性HBV感染符合疾 病控制中心（CDC)公開的定義，根據(jù)所述定義，慢性HBV感染以如下實驗室標準為特征：乙 型肝炎核心抗原的IgM抗體（IgM抗HBc)陰性並I以下檢驗之一為陽性結(jié)果：乙型肝炎表 面抗原（HBsAg)、乙型肝炎e抗原（HBeAg)或乙型肝炎病毒(HBV) DNA,或者間隔至少6個月 HBsAg陽性或HBV DNA陽性2次（間隔6個月進行的這些檢驗的任何組合都是可接受的）。
[0019] 術(shù)語"干擾素治療"和"標準治療"優(yōu)選地指用干擾素和優(yōu)選地病毒DNA聚合酶 抑制劑治療HBV感染。然而，本發(fā)明還構(gòu)思干擾素治療優(yōu)選地是用干擾素單一治療并且標 準治療優(yōu)選地是用病毒DNA聚合酶抑制劑單一治療。優(yōu)選地，如這個情境下提到的干擾素 是與聚乙二醇共價結(jié)合的干擾素（PEG-干擾素），更優(yōu)選地，干擾素是干擾素2 α，最優(yōu)選 地，干擾素是與聚乙二醇共價結(jié)合的干擾素 2 a (peg-干擾素 2 α，市售為PEGasys?J。 優(yōu)選地，病毒DNA聚合酶抑制劑是核苷酸或核苷類似物，更優(yōu)選地是{[2- (6-氨基-9H-嘌 呤-9-基）乙氧基]甲基}膦酸（例如adefovir?:)。因而，標準或干擾素治療優(yōu)選 地是用干擾素2 α和核苷酸類似物治療。更優(yōu)選地，標準或干擾素治療是用PEG-干擾素 2α和核苷酸類似物治療，并且甚至更優(yōu)選地標準干擾素治療是用PEG-干擾素2α (例如 PEGasys?:)和adefovir?:治療持續(xù)少于1年。最優(yōu)選地，標準干擾素治療是根據(jù)以 下治療計劃用peg-干擾素2α (例如PEGasys?,)和adefovir?_治療：通常，通過皮下 施用（每周皮下注射）實施PEGasys⑧治療持續(xù)48周時間，而將病毒dna聚合酶抑制劑 (核苷/核苷酸類似物）經(jīng)口服施用更長時間，即在80%患者中持續(xù)超過1年。關(guān)于詳細 內(nèi)容，還見 J.L.Dienstag N Engl J Med 2008,359;1486-1500。
[0020] 術(shù)語"對干擾素治療敏感"意指與成功治療的機率相比，可以成功地治療受試者或 可以至少以顯著增加的可能性成功地治療受試者?？梢酝ㄟ^如本文提到的干擾素治療成功 治療的受試者也稱作反應個體。如果將HBV感染、與之相關(guān)的至少一種癥狀或與之相伴的 至少一種并發(fā)癥改善到顯著程度和/或治愈，則如本文提到的治療是成功的。優(yōu)選地，成功 的治療還伴隨在如本文以上所述來自受試者的樣品中可檢測的HBV多肽和/或HBV多核苷 酸減少。更優(yōu)選地，成功的治療特征如下：在治療最多1年、最多50周、最多49周或最多 48周后來自受試者的樣品中不存在可檢測量的HBsAG和/或HBeAG，如治療啟動后60至80 周、優(yōu)選地65至75周，或最優(yōu)選地72周所測定。
[0021] 不能通過干擾素治療成功治療的受試者也稱作非反應個體。在這類受試者中，不 出現(xiàn)HBV感染、與之相關(guān)的至少一種癥狀或至少一個并發(fā)癥的改善或治愈。優(yōu)選地，這種 非反應個體受試者患有嚴重形式的慢性肝炎B病毒感染，其中在干擾素治療之前和之后可 檢出HBsAG，但是不可檢出HBeAG，或其中在標準干擾素治療之前和之后可檢出HBsAG和 HBeAG。應當考慮被鑒定為對干擾素治療不敏感的受試者施用改良治療措施,例如增加干擾 素和/或聚合酶抑制劑的劑量和/或延長治療和/或額外用藥。
[0022] 如本文所用，術(shù)語"HBV免疫復合物"指在至少一種HBV多肽和如下文所述的針對 所述至少一種HBV多肽的至少一種免疫球蛋白（即抗HBV免疫球蛋白）之間形成的復合 物。優(yōu)選地，該復合物在至少一種HBV多肽和多于1種，多于2種、多于3種、多于4種、多 于5種、多于10種、多于20種、多于50種或多于100種針對所述至少一種HBV多肽的抗 HBV免疫球蛋白分子之間形成。優(yōu)選地，HBV多肽選自與上文相關(guān)的一系列HBV抗原，更優(yōu) 選地，HBV多肽是HBsAg?？笻BV免疫球蛋白優(yōu)選地是在受試者的至少一種體液、優(yōu)選地血 液或血清中存在的可溶性免疫球蛋白。優(yōu)選地，抗HBV免疫球蛋白是IgG，更優(yōu)選地是血清 IgG。最優(yōu)選地，包含于HBV免疫復合物中的抗HBV免疫球蛋白是針對HBsAg的IgG，即抗 HBsAG IgG。應當理解HBV免疫復合物可以包含在本說明書中明確詳述之外的其他分子，然 而，優(yōu)選本發(fā)明的抗HBV免疫球蛋白和HBV多肽形成主要部分的HBV免疫復合物。因此，抗 HBV免疫球蛋白和HBV多肽優(yōu)選地構(gòu)成HBV免疫復合物質(zhì)量的至少25%、至少30%、至少 40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少75%。更優(yōu)選地，HBV免疫復合物基本上由抗 HBV免疫球蛋白和HBV多肽組成，即抗HBV免疫球蛋白和HBV多肽構(gòu)成HBV免疫復合物質(zhì)量 的至少80%、至少90%或至少95%。甚至更優(yōu)選地，HBsAg和抗HBsAG IgG構(gòu)成主要部分 的HBV免疫復合物。最優(yōu)選地，HBV免疫復合物基本上由HBsAg和抗HBsAG IgG組成。
[0023] 技術(shù)人員理解術(shù)語"免疫球蛋白"或"Ig"。它們指免疫球蛋白家族的成員分子，特 征在于它們是由響應于與外來抗原接觸的個體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的可溶性多肽。優(yōu)選地，免 疫球蛋白是來自哺乳動物的免疫球蛋白，并且更優(yōu)選地，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。還優(yōu) 選地，免疫球蛋白選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。更優(yōu)選地，免疫球蛋白是IgG，最優(yōu)選地 是人IgG。人IgG以大約150kDa的分子質(zhì)量和由兩條約50kDa的相同重鏈和兩條約25kDa 的相同輕鏈組成的結(jié)構(gòu)為特征。這兩條重鏈經(jīng)由二硫鍵彼此連接并與輕鏈連接以形成常見 的Y形分子。優(yōu)選地，IgG是糖基化的，更優(yōu)選地IgG通過N-糖基化過程糖基化。優(yōu)選地， IgG 屬于亞組 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 之一。
[0024] 術(shù)語"抗免疫球蛋白抗體"優(yōu)選地涉及來自抗體的蛋白家族中的可溶性分子，所述 抗體識別免疫球蛋白，優(yōu)選地識別人免疫球蛋白，即本發(fā)明的抗免疫球蛋白抗體優(yōu)選地是 抗人免疫球蛋白抗體，更優(yōu)選地識別人IgG，即抗人IgG抗體。本發(fā)明的抗免疫球蛋白抗體 優(yōu)選地是具有低到中等親和力（affinity)的抗體和具有高親合力（avidity)的抗體，如下 文詳述?？贵w對表位的親和力定義為在所述抗體上的抗原識別位點和該表位之間全部非共 價相互作用的強度。具有高親和力的抗體通過許多和/或強烈非共價相互作用與抗原牢固 結(jié)合，并且因此保持與抗原結(jié)合持續(xù)相對長的時間段。在另一方面，具有低親和力的抗體 抗體以少和/或弱的非共價相互作用與抗原進行相互作用，并且因此與抗原快速解離。本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗體的親和力可以由它的解離常數(shù)（K d)描述。優(yōu)選地，Kr1(lm〇l/l至 l(T9m〇l/l的解離常數(shù)表示極高親和力，ΙΟΛιοΙ/Ι的解離常數(shù)表示高親和力，l(T 7m〇l/l的 解離常數(shù)表示低親和力，并且l〇_6mol/l及更高的解離常數(shù)表示很低的親和力。因而，抗免 疫球蛋白抗體的解離常數(shù)優(yōu)選地是l〇_ 6mol/l至l(T8m〇l/l，更優(yōu)選地，解離常數(shù)是ΚΓ7至 ΙΟΛιοΙ/Ι。在包含多于一個結(jié)合位點的分子（例如抗體）中，第一結(jié)合位點的相互作用增 加其他結(jié)合位點相互作用的概率。技術(shù)人員將包含多于一個結(jié)合位點的分子和待結(jié)合的分 子之間這類多重相互作用的強度稱作親合力。高親合力因此可以補償單個結(jié)合位點的相對 低的親和力。因而，抗免疫球蛋白抗體，優(yōu)選地，具有多于2個抗原識別位點，更優(yōu)選地多于 4個抗原識別位點。最優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體具有10個或更多個抗原識別位點。優(yōu)選 地，抗免疫球蛋白抗體是IgG、IgD、IgE，更優(yōu)選地抗免疫球蛋白抗體是包含多于2個抗原識 別位點的抗體，例如IgA，最優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體是在一個分子中包含多于4個抗原 識別位點的抗體，例如IgM。抗免疫球蛋白抗體是多克隆或單克隆的，并且在在適用于抗體 生產(chǎn)的哺乳動物中或哺乳動物細胞中產(chǎn)生。優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體與本發(fā)明免疫球蛋 白的表位特異性結(jié)合。更優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體是抗人免疫球蛋白抗體，即與本發(fā)明的 人免疫球蛋白結(jié)合，甚至更優(yōu)選地，該結(jié)合是對人免疫球蛋白特異的。最優(yōu)選地，抗免疫球 蛋白抗體是抗人IgG抗體，即與人IgG特異性結(jié)合。然而，本發(fā)明還構(gòu)思，抗免疫球蛋白抗體 與由免疫球蛋白與HBV免疫復合物中的HBV多肽結(jié)合所形成的新表位（neoepitope)特異 性結(jié)合。怎樣產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的并且例如包括，根據(jù)已知的方案免疫活動物 或在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體（Sambrook等人，1989,1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual)。優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體在小鼠、大鼠、兔、豬、牛、驢、 山羊、綿羊等中或在卵中產(chǎn)生。然而，本發(fā)明還考慮在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗免疫球蛋白抗 體。優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體是IgM，最優(yōu)選地是單克隆IgM。更優(yōu)選地，抗免疫球蛋白 抗體是抗（聚集的人IgG) IgM，即對人IgG具有如本文以上所述的低親和力和高親合力 的IgM，例如，如WO 2008/135274中所述<h-agg. IgG>IgM，最優(yōu)選地，抗人免疫球蛋白抗 體是 MAb〈h-Agg. -IgG>M-3. 022. 5-IgM(DSM ACC2873)、MAb〈h-Agg. -IgG>M-l. 010. 2-IgM 和 MAb〈h-Agg. -IgG>M-l. 1. 7-IgM(表 1 中顯示），MAb〈h-Agg. -IgG>M-3. 022. 5-IgM(DSM ACC2873)是最優(yōu)選的。
[0025] 優(yōu)選地，抗免疫球蛋白抗體攜帶標簽。如本文所用的術(shù)語"標簽"指能夠產(chǎn)生可檢 測信號的任何物質(zhì)。優(yōu)選地，標簽是色原體、熒光、化學發(fā)光或電化學發(fā)光化合物、催化劑、 酶、酶底物、染料、膠態(tài)金屬或非金屬粒子或有機聚合物顆粒等。
[0026] 如本文所用，術(shù)語"受試者"指哺乳動物，并且優(yōu)選地指人。受試者優(yōu)選地患有HBV 感染。更優(yōu)選地，受試者患有慢性HBV感染。另外，受試者優(yōu)選地具有未知的HBV e抗原狀 態(tài)。
[0027] 術(shù)語"樣品"指體液樣品，指來自組織或器官的樣品，或指從外體表或內(nèi)體表獲得 的洗液/淋洗（wash/rinse)液樣品。樣品優(yōu)選地包含多肽，更優(yōu)選地是HBV抗原，最優(yōu)選 地是HBsAg。本發(fā)明的方法涵蓋血、血漿、血清、尿、唾液或淚液的樣品。這類樣品可以通過 使用刷、（棉）藥簽、刮鏟（spatula)、淋洗液/洗液、鉆取活組織檢查裝置、用針和外科器械 穿刺腔體（cavity)獲得。然而，作為本發(fā)明的樣品，還包括通過熟知技術(shù)獲得的樣品，所述 樣品優(yōu)選地包括來自泌尿生殖道、肛周區(qū)、肛管、口腔、上呼吸消化道和表皮的刮擦、藥簽或 活組織檢查樣品。無細胞流體可以通過分離技術(shù)如過濾或離心從體液或組織或器官獲得。 優(yōu)選地，樣品從已知在被HBV感染的受試者中包含HBV多肽的體液（S卩，優(yōu)選地，血、血清、 唾液等）獲得。應當理解可以進一步加工樣品以實施本發(fā)明的方法。特別地，可能通過本 領(lǐng)域已知的方法和工具從獲得的樣品移除細胞。另外，可通過本領(lǐng)域已知的方法和工具從 獲得的樣品提取和/或純化HBV免疫復合物。因而，術(shù)語樣品還可以指從如上文提到的任 何樣品純化和/或提取的HBV免疫復合物。
[0028] 術(shù)語"確定"指對樣品中存在的HBV免疫復合物的量定量，即測量所述HBV免疫復 合物的量或濃度，優(yōu)選地半定量或定量地測量。可以直接或間接地進行測量。確定免疫復 合物的量可以按照技術(shù)人員已知的多種方式，例如凝膠過濾層析，隨后蛋白質(zhì)印跡法、免疫 共沉淀法等完成。優(yōu)選地，通過在下文實施例中描述的方法確定HBV免疫復合物的量。有 利地，發(fā)現(xiàn)在實施例中使用的夾心-ELISA允許可靠地對HBV免疫復合物定量。另外，發(fā)現(xiàn) 使用聚集的抗體，例如聚集的IgG，作為抗人Ig抗體，導致高度改善的信噪比。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明，可以通過用于確定樣品中多肽或肽的量的全部已知手段實現(xiàn)確定 HBV免疫復合物的量，只要其適用于特異性檢測本發(fā)明的HBV免疫復合物。優(yōu)選地，將使用 與HBV免疫復合物特異性結(jié)合、從而可對其進行檢測的檢測劑。檢測劑優(yōu)選地涵蓋與所述 復合物特異性結(jié)合的抗體或其片段、與所述復合物特異性結(jié)合的適配體（aptamer)、抗運載 蛋白（Anticalin)或設計的錨蛋白重復序列蛋白（DARPin)。優(yōu)選地，適用雙特異性免疫測 定法，即如下測定法，其中信號的存在或強度將取決于包含于HBV免疫復合物中的兩種分 子（即HBV多肽和抗HBV免疫球蛋白）的存在。所述工具包括可以按各種夾心、競爭或其他 分析模式利用標記分子的免疫測定法裝置和方法。所述測定法將形成指示HBV免疫復合物 存在或不存在的信號。另外，信號強度可以優(yōu)選地直接或間接地相關(guān)于（例如反比于）樣品 中存在的HBV免疫復合物的量。所述方法優(yōu)選地包括生物傳感器、與免疫測定法偶聯(lián)的光 學裝置、生物芯片、分析裝置如質(zhì)譜儀、NMR分析儀或色譜裝置。另外，方法包括基于微量平 板ELISA的方法、全自動化或機器人免疫測定法（例如在多參數(shù)生物芯片平臺或Elecsys? 分析儀上可用）、CBA (酶促鈷結(jié)合測定法，例如在Roche-Hitachi?分析儀上可用）和乳膠 凝集測定法（例如在Roche-Hitachi?分析儀上可用）。
[0030] 如本文所用的術(shù)語"量"涵蓋本文中提及的HBV免疫復合物的絕對量、本文中提及 的HBV免疫復合物的相對量或濃度，以及與之相關(guān)的任何值或參數(shù)。這些值或參數(shù)包括通 過測量從本文中提及的HBV免疫復合物獲得的來自所有特定物理或化學特性的強度信號 值，例如，響應于本文中提及的多肽從生物讀出系統(tǒng)確定的表達水平，或從特異性結(jié)合的配 體獲得的強度信號。應當理解也可以通過所有標準數(shù)學操作獲得與前述量或參數(shù)相關(guān)的 值。
[0031] 如本文所用的"比較"涵蓋將待分析樣品所包含的本文提及的HBV免疫復合物的 量與本說明書中他處所述的合適參比樣品中的所述HBV免疫復合物的量比較。還涵蓋將樣 品中HBV免疫復合物的量與HBV抗原、優(yōu)選地HBsAg的量的比率與合適的參考比率比較。應 當理解如本文所用的比較，指比較相應的參數(shù)或值，例如，將如本文提到的HBV免疫復合物 絕對量與所述HBV免疫復合物的絕對參比量比較；將如本文提到的HBV免疫復合物的濃度 與所述HBV免疫復合物的參比濃度比較；將測試樣品中從如本文提到的HBV免疫復合物獲 得的強度信號與參比樣品中所述HBV免疫復合物的相同類型的強度信號比較；或?qū)BV免 疫復合物的量對如本文提到的HBV抗原的量的比率與相應的參考比率比較。在本發(fā)明的方 法中提及的比較可以人工地或在計算機輔助下實施。對于計算機輔助比較，測定的量或比 率的值可以與對應于由計算機程序在數(shù)據(jù)庫中存儲的合適參比的值比較。該計算機程序還 可以借助專家系統(tǒng)評價該比較的結(jié)果。因此，本文中提及的鑒定的結(jié)果可以按合適的輸出 格式自動提供。
[0032] 如本文所用，術(shù)語"參考值"指HBV免疫復合物的量，所述量允許評估樣品所來源 的受試者應對干擾素治療敏感或?qū)Ω蓴_素治療不敏感。合適的參考值可以從待分析的參比 樣品連同樣品一起（即同時或相繼）確定。
[0033] 原則上，可以基于給定的HBV免疫復合物的平均值或均值（average or mean)，通 過采用標準統(tǒng)計學方法，對如本文所述的受試者組或群組計算參考量。具體而言，一種檢驗 法驗如旨在診斷某事件存在與否的方法的準確度由其接受者操作特征（R0C)最佳描述（特 別見Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577)。R0C曲線是因在觀察到的整個數(shù)據(jù)范圍內(nèi)連續(xù) 變動決策閾值所產(chǎn)生的全部靈敏度與特異性成對值的曲線。診斷方法的臨床表現(xiàn)取決于 其準確度，即其將受試者正確劃至某種預后或診斷的能力。通過在適于進行區(qū)分的完整閾 值區(qū)間將靈敏度對1-特異性作圖，R0C曲線指示兩種分布之間的重疊。在y-軸上是靈敏 度或真陽性部分，其定義為真陽性試驗結(jié)果數(shù)對真陽性數(shù)和假陰性試驗結(jié)果數(shù)的乘積的比 率。在疾病或病癥存在的情況下，這又稱作陽性（positivity)。它完全從患病的亞組計算。 在X-軸上是假陽性部分或1-特異性，其定義為假陽性試結(jié)果數(shù)對真陰性數(shù)和假陽性結(jié)果 數(shù)的乘積的比率。它是特異性的指標并且完全從未患病的亞組計算。因為完全通過使用來 自兩個不同亞組的試驗結(jié)果分別計算真陽性分數(shù)和假陽性分數(shù)，所以R0C曲線與群組中事 件的患病率無關(guān)。R0C曲線上的每個點表示與特定決策閾值相對應的靈敏度/-特異性配對 物。完美區(qū)分（結(jié)果的兩個分布中無重疊）的檢驗具有穿過左上角的R0C曲線，其中真陽 性分數(shù)是1.0或100% (完美靈敏度），假陽性分數(shù)是〇(完美特異性）。無區(qū)分（兩個組的 結(jié)果的相同分布）的檢驗的理論曲線是從左下角至右上角的45°對角線。大部分曲線落 在這兩種極端情況之間。如果ROC曲線完全落在45°對角線以下，則通過將"陽性"標準從 "大于"逆轉(zhuǎn)至"小于"或相反操作容易地糾正這種情況。定性地，曲線越靠近左上角，則檢 驗的總準確度越高。取決于所需的置信區(qū)間，可以從ROC曲線導出閾值，所述閾值允許以靈 敏度和特異性的適宜平衡分別診斷或預測給定事件。因此，可以優(yōu)選地通過如上文所述那 樣建立所述群組的ROC并從中導出閾值量，產(chǎn)生針對本發(fā)明方法所用的參考。取決于診斷 方法的所需靈敏度和特異性，ROC曲線允許導出合適的閾值。
[0034] 優(yōu)選地，如本文所用的參考量從治療之前的受試者樣品獲得，但是對所述樣品，已 知它們的供體是否響應治療。該參考量水平可以是離散的數(shù)值或可以是數(shù)值范圍。顯然，參 考水平或量可以在HBV免疫復合物的個體種類之間變動。因此，測量系統(tǒng)優(yōu)選地用一份樣 品或用一系列樣品校準，所述樣品包含已知量的HBV免疫復合物或多種HBV免疫復合物。更 優(yōu)選地，該系統(tǒng)用一系列混合物校準，所述混合物包含限定體積的僅含HBsAg的血清，即， 包含大量的HBsAg但不含抗HBV免疫球蛋白或HBV免疫復合物的血清，和僅含抗HBsAg免疫 球蛋白的血清，例如，包含高滴度抗HBsAG IgG但不包含HBsAg或HBV免疫復合物的血清。 技術(shù)人員理解在這種情況下HBV免疫復合物的量將優(yōu)選地表述為任意單位（AU)。因此，優(yōu) 選地通過將從樣品獲得的信號與包含于校正曲線中的信號比較，確定HBV免疫復合物或多 種HBV免疫復合物的量。
[0035] 適用于個體受試者的參考量可以根據(jù)各種生理學參數(shù)如年齡、性別或亞群變動。 因此，合適的參考值可以通過本發(fā)明的方法，從待分析的參考樣品連同測試樣品一起（即 同時或相繼）確定。另外，可以優(yōu)選地使用閾值量作為參考量。優(yōu)選地，高于閾值量的HBV 免疫復合物的量表示輕度的HBV感染；并且等于或低于閾值量的HBV免疫復合物的量表示 重度的HBV感染。應當理解前述的量可以因統(tǒng)計學和測量誤差變動。
[0036] 在本發(fā)明方法的一個實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)增加的HBV免疫復合物的量優(yōu)選地表 示受試者對干擾素治療敏感，而減少的HBV免疫復合物的量表示受試者對干擾素治療不敏 感。在這種情況下，參考量優(yōu)選地是這些量，所述量是在治療給定受試者群體或群組之前存 在于患有HBV的受試者中的平均量或均數(shù)量（average or mean amount)。本文中提及的 HBV免疫復合物量的減少或增加優(yōu)選地是統(tǒng)計顯著的減少或增加。
[0037] 參考量可以優(yōu)選地從已知對干擾素治療敏感的患有HBV的受試者或受試者組的 樣品導出。在這種情況下，確定與該參考量相比實質(zhì)上相同或增加的HBV免疫復合物的量 應當表示受試者對干擾素治療敏感。減少的量應當表示對干擾素治療不敏感的受試者。
[0038] 參考量還可以優(yōu)選地從已知對干擾素治療不敏感的患有HBV的受試者或受試者 組的樣品導出。在這種情況下，確定與該參考量相比實質(zhì)上相同或減少的HBV免疫復合物 的量應當表示受試者對干擾素治療不敏感。增加的量應當表示對干擾素治療敏感的受試 者。
[0039] 有利地，發(fā)現(xiàn)確定來自受試者的樣品中HBV免疫復合物的量允許鑒定將患有乙型 肝炎病毒（HBV)感染的受試者鑒定為對標準干擾素治療敏感。如本文在實施例中詳述的， 優(yōu)選地，增加的HBV免疫復合物的量表示受試者對干擾素治療敏感，而減少的HBV免疫復合 物的量表示受試者對干擾素治療不敏感。優(yōu)選地，這意味具有大量HBV免疫復合物的受試 者具有響應于標準干擾素治療的高概率，并且意味具有少量HBV免疫復合物的受試者具有 響應于標準干擾素治療的低概率。因此可以在療法啟動之前使用本發(fā)明的方法決定受試者 是否應當用標準干擾素療法治療或該受試者是否應當優(yōu)選地接受改良療法。還有利地，發(fā) 現(xiàn)知曉受試者的HBeAg狀態(tài)并且因此確定其HBeAg狀態(tài)與本發(fā)明的用于正確地鑒定對干擾 素治療敏感的受試者的方法無關(guān)。
[0040] 上文作出的定義在已作必要修正時適用于以下情況：
[0041] 本發(fā)明還構(gòu)思一種通過干擾素療法治療患有HBV感染的受試者的方法，所述方法 包括將受試者鑒定為對干擾素治療敏感，優(yōu)選地，通過本發(fā)明的前述方法鑒定，并且向被鑒 定為干擾素治療對敏感的受試者施用治療有效量的如本文中他處所述的干擾素治療。
[0042] 本發(fā)明還涉及一種用于在患有HBV感染的受試者中區(qū)分輕度HBV感染和重度HBV 感染的方法，所述方法包括步驟：
[0043] a)確定所述受試者的樣品中HBV免疫復合物的量，
[0044] b)將步驟a)中獲得的HBV免疫復合物的量與參考值比較；并且
[0045] c)基于步驟b)中比較的結(jié)果區(qū)分輕度HBV感染和嚴重HBV感染。
[0046] 在這種情況下，重度的HBV感染以如本文中他處所述的減少的HBV免疫復合物的 量為特征，而輕度的HBV感染以增加的HBV免疫復合物的量為特征。在這種情況下，參考量 優(yōu)選地是這些量，所述量是在治療給定受試者群體或群組之前存在于患有HBV的受試者中 的平均量或均數(shù)量。
[0047] "輕度的HBV感染"優(yōu)選地是一種可以通過如本文中他處所述的干擾素療法治療的 形式，而"重度"優(yōu)選地是不能通過干擾素療法治療的慢性HBV感染。
[0048] 本發(fā)明也涉及來自患有HBV感染的受試者的樣品中HBV免疫復合物的量或用于這 種樣品中HBV免疫復合物的檢測劑用于將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感 的用途。
[0049] 本文中他處詳細描述了可以用于確定樣品中存在的HBV復合物的合適檢測劑。
[0050] 另外，本發(fā)明還涉及一種用于將患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受試者鑒定為對 干擾素治療敏感的裝置，包括用于確定HBV免疫復合物的量的分析單元，和用于將所述量 與參考量比較以及用于將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的評價裝置。
[0051] 如本文所用的術(shù)語"裝置"指一種工具系統(tǒng)，所述系統(tǒng)至少包括彼此有效關(guān)聯(lián)以允 許區(qū)分的前述工具。上文與本發(fā)明方法相關(guān)地公開了用于確定所述HBV免疫復合物的量 的優(yōu)選工具和用于實施比較的工具。怎樣以運行方式連接工具將取決于納入裝置中的工具 的類型。例如，在使用自動確定HBV免疫復合物的量的工具情況下，由所述自動運行工具獲 得的數(shù)據(jù)可以由例如計算機程序處理，以建立診斷（即鑒定對敏感干擾素治療的受試者）。 在這種情況下，優(yōu)選地，所述工具包含在單一裝置中。所述裝置可以因此包括用于測量樣品 中HBV免疫復合物的量的分析單元和用于處理所得數(shù)據(jù)以便診斷的評價裝置。備選地，在 工具如測試條（test stripe)用于確定HBV免疫復合物的量情況下，用于診斷的工具可以 包括對照條或?qū)φ毡?，所述對照紙條或?qū)φ毡韺y定的量劃至已知伴隨響應于標準干擾素 治療或伴隨不響應于干擾素治療的量。用于檢測的優(yōu)選工具與涉及本發(fā)明以上方法的實施 方案相聯(lián)系地公開。在這種情況下，工具是有效關(guān)聯(lián)的，在于該系統(tǒng)的用戶由手冊中給出的 說明和闡釋將確定該量的結(jié)果和其診斷值聯(lián)系到一起。該工具在這種實施方案中可以作為 獨立的裝置出現(xiàn)并且優(yōu)選地包裝在一起作為試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員將無需進行其他創(chuàng)造 性工作即可了解如何關(guān)聯(lián)該工具。優(yōu)選的設備是可以在不具備專業(yè)臨床醫(yī)生的特定知識的 情況下應用的那些，例如，僅需要加載樣品的測試條或電子裝置。結(jié)果可以作為參量診斷原 始數(shù)據(jù)的輸出，優(yōu)選地，作為絕對量或相對量給出。應當理解這些數(shù)據(jù)將需要由臨床醫(yī)生解 釋。但是，還構(gòu)思了專家系統(tǒng)裝置，其中輸出包含不需要專業(yè)臨床醫(yī)生解釋的處理過的診斷 原始數(shù)據(jù)。其他優(yōu)選的裝置包括上文根據(jù)本發(fā)明方法所提及的分析單元/裝置（例如，生 物傳感器、陣列、與特異性識別多肽的配體連接的固相支持物、等離子體表面共振裝置、NMR 波譜儀、質(zhì)譜儀等）或評價單元/裝置。
[0052] 本發(fā)明構(gòu)思一種試劑盒，其包含實施本發(fā)明方法的說明書、用于確定HBV免疫復 合物的量的檢測劑，和優(yōu)選地允許將患有HBV感染的受試者鑒定為對標準干擾素治療敏感 的參考量的標準。
[0053] 如本文所用，術(shù)語"試劑盒"指前述組分的綜合，所述組分優(yōu)選地分別或在單一容 器內(nèi)部提供。該容器還優(yōu)選地包括用于實施本發(fā)明方法的說明書。已經(jīng)在本說明書中給出 試劑盒的這類組分的例子以及它們的使用方法。試劑盒優(yōu)選地含有即用型制劑形式的前述 組分。優(yōu)選地，試劑盒可以額外地包括說明書，例如，相對于本發(fā)明方法提供的診斷，解讀任 何測定結(jié)果的用戶手冊。特別地，這類手冊可以包括將所確定HBV免疫復合物的量劃分至 診斷類型的信息。在本說明書中他處將找到詳細內(nèi)容。另外，這類用戶手冊可以提供關(guān)于 正確使用試劑盒組分以確定相應生物標記的量的說明。用戶手冊可以按紙質(zhì)形式或電子形 式提供，例如存儲在CD或CDR0M上。本發(fā)明還涉及所述試劑盒在本發(fā)明的任何方法中的用 途。
[0054] 將本說明書中援引的全部參考文獻在此就其完整公開內(nèi)容和本說明書中具體提 到的公開內(nèi)容而言均通過引用的方式并入。
[0055] 附圖
[0056] 圖1 :HBV免疫復合物檢測原理；抗HBsAg捕獲抗體（生物素aHBSl，生物素aHBS2) 與固體表面結(jié)合。將HBV免疫復合物（包含HBsAg和抗HBsAG IgG)捕獲至該表面并用單 克隆IgM檢測，所述單克隆IgM具有低親和力，但對與地高辛配基（Digoxigenin)綴合的人 IgG具有高親合力（抗〈聚集的人IgG>IgM-地高辛配基）。
[0057] 圖2:研究設計的示意圖。
[0058] 圖3 :HBV免疫復合物的量與不根據(jù)HBeAg狀態(tài)區(qū)分的群組中針對標準治療的反 應;A)和B):在第0周（即在啟動治療之前，A)和在治療第12周⑶HBsAg在來自響應于 (R)或不響應于（NR)標準治療的患者的血清樣品中的濃度。反應個體和非反應個體之間的 差異不是統(tǒng)計顯著的。C)和D) :在第0周（C)和在治療第12周（D) HBsAg/抗HBsAG IgG 復合物在來自響應于（R)或不響應于（NR)標準治療的患者的血清樣品中的濃度。在第0 周（p = 0. 0093)和在第12周（P = 0. 0179)，反應個體和非反應個體之間的差異是統(tǒng)計顯 著的。
[0059] 圖4 :圖3中獲得的數(shù)據(jù)的R0C曲線。 實施例
[0060] 以下實施例應當僅說明本發(fā)明。它們應當不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0061] 實施例1
[0062] 產(chǎn)生具有類風濕性因子樣特異性的單克隆小鼠 IgM抗體
[0063] 免疫原：H_IgG聚合物：
[0064] 將10mg人IgGl (Sigma公司）溶解于0· 6ml 25mM碳酸氫鹽緩沖液pH 9. 5中。在添 加3. 5μ 1 12. 5%戊二醛溶液后，將它在室溫溫育2小時。隨后，將它在冰浴中冷卻，用50mM 三乙醇胺溶液pH 8. 0調(diào)節(jié)至pH 8. 3并且添加0. 15ml新鮮制備的硼氫化鈉溶液（8mg硼氫 化物/ml水）。在0°C 2. 5小時后，將制備物在4°C針對10mM磷酸鉀緩沖液/0. 2M NaCl， pH 7. 5透析16小時。將含有IgG聚合物的透析液以等分試樣貯存在80°C或用于免疫和用 于雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液中的特異性檢驗。從人IgG3 (Sigma Company)開始，以相似方 式產(chǎn)生H-IgG3聚合物。
[0065] 小鼠的免疫：
[0066] 將12周齡雌性BALB/c小鼠用100 μ g Η-IgGl或IgG3聚合物連同佐劑CFA(弗氏 完全佐劑）一起腹膜內(nèi)首次免疫。在8日后，用CFA中100 μ g相應的IgG聚合物實施進一 步免疫。在初始免疫后13日，在沒有佐劑的情況下腹膜內(nèi)施用200 μ g相應的聚合物，在初 始免疫后14日和15日，在每種情況下腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)施用100 μ g。在16日后實施融合。 [0067] 雜交瘤克隆的產(chǎn)生：
[0068] 融合和克隆：
[0069] 遵循 Galfr6, G. , Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46 中的方法，使免疫小 鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。免疫小鼠的大約lxl〇8個脾細胞與2xl07個骨髓瘤細胞 (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580)混合并離心（以 300g 和 4°C持續(xù) 10 分鐘）。
[0070] 隨后將細胞用不含胎牛血清（FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌1次并在50ml錐形 管中以400g再次離心。添加 lml PEG(聚乙二醇）（分子量4000, MERCK, Darmstadt)并通 過抽吸混合。在37°C于水浴中1分鐘后，逐滴添加不含F(xiàn)CS的5ml RPMI 1640,混合，用培養(yǎng) 基（RPMI1640+10% FCS)補充直至50ml并隨后離心。使沉降的細胞懸于含有10% FCS的 RPMI 1640培養(yǎng)基中并且接種在次黃嘌呤-偶氮絲氨酸選擇培養(yǎng)基中（RPMI1640+10% FCS 中的100mmol/l次黃噪呤，1 μ g/ml偶氮絲氨酸）。添加白介素6(100U/mL)至培養(yǎng)基作為 生長因子。在約10日后，對原代培養(yǎng)物測試特異性抗體合成。在96孔細胞培養(yǎng)平板中借 助熒光激活的細胞分選儀克隆了顯示與聚集的人IgGl的陽性反應，但與單體IgG無交叉反 應的原代培養(yǎng)物。添加白介素6 (100U/mL)至培養(yǎng)基作為生長添加物。
[0071] 以這種方式獲得以下雜交瘤克?。?br> [0072] 表 1 :
[0073]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于將患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的方 法，所述方法包括步驟： a) 確定所述受試者的樣品中HBV免疫復合物的量， b) 將步驟a)中獲得的HBV免疫復合物的量與參考量比較，并且 c) 基于步驟b)中比較的結(jié)果，將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感， 其中受試者的HBV e抗原狀態(tài)是未知的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HBV感染是慢性HBV感染。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的方法，其中干擾素治療包括用PEG-干擾素和病 毒DNA聚合酶抑制劑治療。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述tog-干擾素治療是PEGasys?和所述病毒 dna聚合酶抑制劑是Adefovir?。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中HBV免疫復合物包含乙型肝炎可溶 性抗原（HBsAg)和抗 HBsAG IgG。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中增加的HBV免疫復合物的量表示受 試者對干擾素治療敏感，減少的HBV免疫復合物的量表示受試者對干擾素治療不敏感。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中樣品是血清樣品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中用抗免疫球蛋白抗體檢測HBV免疫 復合物的量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中i)HBV免疫復合物包含抗HBsAG IgG、抗HBeAg IgG或抗HBcAg IgG，其中ii)用抗（聚集的人IgG)IgM檢測HBV免疫復合物 的量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)確 定HBV免疫復合物的量。
11. 來自患有HBV感染的受試者的樣品中HBV免疫復合物的量或用于這種樣品中的 HBV免疫復合物的檢測劑用于將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的用途。
12. -種用于將患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的裝 置，包括用于確定HBV免疫復合物的量的分析單元，和用于將所述量與參考量比較以及用 于將患有HBV感染的受試者鑒定為對干擾素治療敏感的評價裝置。
13. -種試劑盒，其包含實施本發(fā)明方法的說明書、用于確定HBV免疫復合物的量的檢 測劑，和優(yōu)選地允許將患有HBV感染的受試者鑒定為對標準干擾素治療敏感的參考量的標 準。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，或根據(jù)權(quán)利要求13所 述的試劑盒，其中受試者的HBV e抗原狀態(tài)是未知的。
【文檔編號】G01N33/68GK104126124SQ201380010278
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月20日
【發(fā)明者】U·克勞斯, B·希普, V·P·格魯納特, B·烏普邁爾, U·洛帕汀, A·德涅特, H·里辛克, H·扎伊捷爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 阿姆斯特丹大學學術(shù)醫(yī)學中心