用于診斷和治療腎臟疾病的slit-robo信號的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供治療慢性腎臟疾病和蛋白尿的方法，以及診斷慢性腎臟疾病和監(jiān)測慢性腎臟疾病和蛋白尿進程中治療效果的方法，其是基于SLIT-ROBO信號通路在調(diào)節(jié)腎臟足細胞F-肌動蛋白細胞骨架和足突結(jié)構中意想不到的作用進行的。
【專利說明】用于診斷和治療腎臟疾病的SLIT-ROBO信號 相關申請的交叉引用
[0001] 根據(jù)美國法典第35部分第119(e)條，本申請要求美國臨時專利申請序列號 61/583379、申請日為2012年1月5日的專利申請的優(yōu)先權，其內(nèi)容通過引用整體并入這 里。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及慢性腎臟疾病和蛋白尿的治療方法，以及慢性腎臟疾病的診斷方法， 和在慢性腎臟疾病和蛋白尿進程中監(jiān)測治療效果的方法。 政府支持
[0003] 本發(fā)明獲得了美國國立衛(wèi)生研究院頒布的合同號DK078226號的政府支持。政府 對本發(fā)明具有一定的權利。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供治療慢性腎臟疾病和蛋白尿的新方法，以及診斷慢性腎臟疾病的新方 法和在慢性腎臟疾病和蛋白尿進程中監(jiān)測治療效果的新方法，這在部分上是基于發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)的SLIT-R0B0信號通路在調(diào)節(jié)腎臟足細胞F-肌動蛋白細胞骨架和足突結(jié)構中新的和意 想不到的作用。
[0005] 因此，在一些方面，本發(fā)明提供治療有需要的受治療者的慢性腎臟疾病的方法，該 方法包括將治療有效量的含有R0B02抑制劑的組合物給予患有或具有患慢性腎臟疾病風 險的受治療者。
[0006] 在一些方面，本發(fā)明還提供降低有需要受治療者的蛋白尿的方法，該方法包括將 治療有效量的含有R0B02抑制劑的組合物給予患有或具有患蛋白尿風險的受治療者。
[0007] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑 是特異性于R0B02的封閉抗體或其抗原結(jié)合段，特異性于R0B02的反義分子（antisense molecule)，特異性于R0B02的短干擾RNA(siRNA)，R0B02小分子抑制劑，R0B02抑制性多肽， 或R0B02的結(jié)構類似物。
[0008] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑封 閉或降低R0B02與SLIT、Nek、或兩者的結(jié)合。
[0009] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是 特異性的IglSLIT結(jié)合域，Igl和Ig2SLIT結(jié)合域，Nck胞內(nèi)結(jié)合域，或上述任意組合。
[0010] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制性多 肽是顯性失活R0B02融合蛋白，含有R0B02胞外域不含胞內(nèi)域的多肽，或含有R0B02胞內(nèi)域 不含胞外域的多肽。
[0011] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，患有或具有患慢 性腎臟疾病的受治療者患有糖尿病腎病和高血壓。
[0012] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，該方法進一步包 括將額外的治療劑給予受治療者。
[0013] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，該額外治療劑為 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACE)或血管緊張素II受體拮抗劑（ARB)。
[0014] 在一些方面，本發(fā)明還提供方法，該方法包括： a. 分析來自受治療者的生物測試樣本以確定R0B02多肽或編碼R0B02多肽的RNA的表 達水平； b. 確定生物測試樣本中R0B02多肽的表達水平或編碼R0B02多肽的RNA的表達水平是 否高于參考閾值水平；以及 c. 對需要處理或治療慢性腎臟疾病的受治療者進行診斷。
[0015] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，分析R0B02多肽 的表達水平采用特異性于R0B02多肽的抗體或其抗原結(jié)合段進行。
[0016] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，分析編碼R0B02 多肽的RNA的表達水平采用PCR或雜交分析進行。
[0017] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，生物測試樣本為 腎臟活組織切片、尿、血液、血清樣本或來自于尿樣的顆粒化細胞。
[0018] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02多肽的表 達水平或編碼R0B02多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高20%。
[0019] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02多肽的表 達水平或編碼R0B02多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高兩個標準差。
[0020] 在一些方面，本發(fā)明還提供分析方法，包括： a. 將從受治療者分離的生物測試樣本與檢測R0B02多肽或編碼R0B02多肽的RNA的試 劑接觸；以及 b. 測量R0B02多肽的水平或編碼R0B02多肽的RNA的水平； 其中，相對于正常生物樣本，所述R0B02多肽或所述編碼R0B02多肽的RNA的水平增強 的，鑒定受治療者患有慢性腎臟疾病和/或處于慢性腎臟疾病或蛋白尿的進程中。
[0021] 在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些【具體實施方式】中，檢測 R0B02多肽的表達水平采用特異性于R0B02多肽的抗體或其抗原結(jié)合段進行。
[0022] 在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些【具體實施方式】中，檢測編 碼R0B02多肽的RNA的表達水平采用PCR或雜交分析進行。
[0023] 在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些【具體實施方式】中，生物測 試樣本為腎臟活組織切片、尿、血液、血清樣本或來自于尿樣顆粒化細胞。
[0024] 在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的【具體實施方式】中，R0B02多肽 的表達水平或編碼R0B02多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高20%。
[0025] 在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的【具體實施方式】中，R0B02多肽 的表達水平或編碼R0B02多肽的RNA的表達水平至少比參考閾值水平高兩個標準差。
[0026] 在這些分析方法和這里描述的所有這些分析方法的一些【具體實施方式】中，受治療 者已經(jīng)被診斷為患有糖尿病或高血壓。
[0027] 在一些方面，本發(fā)明提供確定受治療者是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風 險，或確定受治療者是否患有慢性腎臟疾病的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括： a. 確定模塊，其配置用以確定受治療者生物樣本中R0B02多肽的表達水平或編碼 R0B02多肽的RNA的表達水平； b. 比較模塊，其配置用以接收通過確定模塊確定的所述R0B02多肽的表達水平或編碼 R0B02多肽的RNA的表達水平，并進行至少一次分析以確定R0B02多肽的表達水平或編碼 R0B02多肽的RNA的表達水平是否大于預先確定的參考水平，進而提供重新取回內(nèi)容；以及 c. 顯示模塊，其用于顯示基于來自所述比較模塊輸出數(shù)據(jù)的內(nèi)容，其中，該內(nèi)容包括 R0B02多肽或RNA的表達水平或比率大于預先確定的參考水平或比率的指示性信號，或 R0B02的水平或表達比率不大于參考水平或預先確定的比率的指示性信號。
[0028] 在這些系統(tǒng)和這里描述的所有這些系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，顯示在顯示模塊 上的內(nèi)容進一步包括推薦受治療者接收具體的治療方案的指示性信號。
[0029] 在一些方面，本發(fā)明提供確定受治療者是否具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風 險，或確定受治療者是否患有慢性腎臟疾病的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括： a. 確定模塊，其配置用以接收來自受治療者的至少一個測試樣本，病對至少一個測試 樣本進行至少一次分析以確定以下情況中的一種情況的存在或不存在： i. R0B02的表達比率大于預先確定比率，或 ii. R0B02的表達水平大于預先確定水平； b. 存儲設備，其設置用以儲存來自所述確定模塊輸出的數(shù)據(jù)；以及 c. 顯示模塊，其用于顯示基于來自所述確定模塊輸出數(shù)據(jù)的內(nèi)容，其中，該內(nèi)容包括 R0B02的表達比率大于預先確定比率或R0B02的水平大于預先確定水平的指示性信號，或 R0B02的表達比率不大于預先確定比率或不大于預先確定水平的指示性信號。
[0030] 在這些系統(tǒng)和這里描述的所有這些系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，在顯示模塊上顯 示的內(nèi)容進一步包括推薦受治療者接收具體治療方案的指示性信號。
[0031] 在一些方面，本發(fā)明還提供治療具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的人類受治療 者的方法，該方法包括給予處理或治療用以預防人類受治療者慢性腎臟疾病或蛋白尿的發(fā) 生，這些人類受治療者被確定為R0B02蛋白水平高于參考閾值水平。
[0032] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水 平至少比參考水平高20 %。
[0033] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水 平至少比參考水平高兩個標準差。
[0034] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，預防慢性腎臟疾 病或蛋白尿發(fā)生的處理或治療包括R0B02抑制劑。
[0035] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是 特異性于R0B02的封閉抗體或其抗原結(jié)合段，特異性于R0B02的反義分子，特異性于R0B02 的短干擾RNA(siRNA)，R0B02小分子抑制劑，R0B02抑制性多肽，或R0B02結(jié)構類似物。
[0036] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑封 閉或降低R0B02與SLIT、Nek、或兩者的結(jié)合。
[0037] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是 特異性于IglSLIT的結(jié)合域，Igl和Ig2SLIT結(jié)合域，Nck胞內(nèi)結(jié)合域，或上述任意組合。
[0038] 在這些方法和這里描述的所有這些方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制性多 肽是顯性失活R0B02融合蛋白，含有R0B02胞外域不含胞內(nèi)域的多肽，或含有R0B02胞內(nèi)域 不含胞外域的多肽。
[0039] 在一些方面，本發(fā)明還提供R0B02抑制劑在治療慢性腎臟疾病中的應用，和R0B02 抑制劑在治療蛋白尿中應用。
[0040] 在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是 特異性于R0B02的封閉抗體或其抗原結(jié)合段，特異性于R0B02的反義分子，特異性于R0B02 的短干擾RNA(siRNA)，R0B02小分子抑制劑，R0B02抑制性多肽，或R0B02結(jié)構類似物。
[0041] 在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑封 閉或降低R0B02與SLIT、Nek、或兩者的結(jié)合。
[0042] 在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是 特異性的IglSLIT結(jié)合域，Igl和Ig2SLIT結(jié)合域，Nck胞內(nèi)結(jié)合域，或上述任意組合。
[0043] 在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制性多 肽是顯性失活R0B02融合蛋白，含有R0B02胞外域不含胞內(nèi)域的多肽，或含有R0B02胞內(nèi)域 不含胞外域的多肽。
[0044] 在這些用途和這里描述的所有這些用途的一些【具體實施方式】中，慢性腎臟疾病和 蛋白尿由糖尿病腎病或高血壓引起的。
[0045] 在這些方面或這里描述的所有這些方面的一些【具體實施方式】中，R0B02是指人類 R0B02,其具有氨基酸序列SEQIDNO: 1，通過mRNA序列SEQIDNO: 2編碼。 定義
[0046] 為了方便起見，這里收集了說明書、實施例和所附權利要求書中使用的某些術語。 除非另有說明或上下文暗示，否則下述術語和短語包括下述提供的含義。除非另有明確說 明或從上下文可以明確看出，否則下述術語和短語不排除其所在領域已經(jīng)獲得的含義。提 供這些定義是為了幫助描述【具體實施方式】，并不是為了限制所要求保護的發(fā)明，因為發(fā)明 的范圍只由權利要求書限定。除另有定義外，這里使用的所有技術術語或科學術語具有與 其所在【技術領域】的技術人員通常理解相同的含義。
[0047] 這里使用的術語"包含（comprising) "或"包含（comprises) "用于涉及的組合物、 方法及其各自組分，這些組分是本發(fā)明必要的，然而還開放地含有非指明的成分，無論是否 必需。
[0048] 這里使用的術語"基本包含……"是指給定的【具體實施方式】所需要的那些成分。該 術語允許附加成分的存在，這些附加成分的存在對發(fā)明【具體實施方式】的基本的和新的或功 能性的特征不會有實質(zhì)性的影響。
[0049] 術語"由……組成（consistingof) "是指這里描述的組合物、方法及其各自組分， 其中不包括未記載在說明書【具體實施方式】中的任何組分。
[0050] 在說明書和所附權利要求書中，使用的單數(shù)形式"一（a) "、"一（an) "和"該（the) " 包括復數(shù)形式，除非上下文明確規(guī)定。因此，例如，"該方法"是指包括一種或多種方法，和 /或這里描述的該類型的多個步驟和/或在閱讀公開內(nèi)容等后對本領域技術人員是顯而易 見的方法。
[0051] 除了操作實施例中的或某處另有說明外，在此使用的表達材料成分的量或反應條 件的所有數(shù)字，在任何情況下應當理解為被術語"約"修飾。當術語"約"與百分比結(jié)合使 用時，可以指±10%，±5%，或±1%。
[0052] 除非在此另有定義，使用的與本申請相關的科學術語和技術術語具有的含義 是這些公開內(nèi)容所述【技術領域】的普通技術人員通常理解的含義。應當理解的是，發(fā)明 并不局限于在此描述的具體的方法、方案和試劑等等，而且這些可以改變。在此采用的 術語的目的僅是為了描述【具體實施方式】，而不是為了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍 只由權利要求書限定。免疫學和分子生物學中普通術語的定義可在下列文獻中找到： 默克研究實驗室2006年出版的《默克診療手冊（第18版）》（ISBN0-911910-18-2) (TheMerckManualofDiagnosisandTherapy, 18thEdition,publishedbyMerck ResearchLaboratories，2006(ISBN0-911910-18-2));RobertS.Porter等（編寫）、 布萊克韋爾科學有限公司1994年出版的《分子生物學百科全書》（ISBN0-632-02182-9) (RobertS.Porteretal. (eds.),TheEncyclopediaofMolecularBiology,published byBlackwellScienceLtd·， 1994(ISBN0-632-02182-9));和RobertA.Meyers(編 寫）、VCH出版公司1995年出版的《分子生物學與生物技術：綜合性案頭參考》（ISBN 1-56081-569-8)(RobertA.Meyers(ed. ),MolecularBiologyandBiotechnology:a ComprehensiveDeskReference,publishedbyVCHPublishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8));愛思唯爾 2006 年出版、WernerLuttmann編著的《免疫學》（Immunology byWernerLuttmann，publishedbyElsevier，2006)。分子生物學中普通術語的定義可 在下列文獻中找到：BenjaminLewin，瓊斯&巴特利特出版社2007年出版的《基因IX》 (ISBN-13:9780763740634)(BenjaminLewinjGenesIXjpublishedbyJones&Bartlett Publishing，2007 (ISBN-13:9780763740634));Kendrew等（編寫），布萊克韋爾科 學有限公司1994年出版的《分子生物學百科全書》（ISBN0-632-02182-9)(Kenctew etal. (eds. ),TheEncyclopediaofMolecularBiology,publishedbyBlackwell ScienceLtd.，1994(ISBN0-632-02182-9));和RobertA.Meyers(編寫），馬尼亞蒂 斯等，《分子克隆：實驗指南》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，美國（1982)(Robert A.Meyers(ed.),Maniatisetal. ,MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold SpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y. ,USA(1982))；Sambrook 等，《分子克?。簩嶒炛改希ǖ?版）》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，美國（1989) (Sambrooketal. ,MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ed.),ColdSpring HarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，USA(1989));Davis等，《分子生物 學的基本方法》，愛思唯爾科學出版公司，紐約，美國（1986)(Davisetal.,BasicMethods inMolecularBiology,ElsevierSciencePublishing,Inc. ,NewYork,USA(1986))； 或《酶學方法：分子克隆技術指南》第152卷，S.LBerger和A.R.Kimmerl編寫，學術出 版公司，圣地亞哥，美國（1987)(MethodsinEnzymology:GuidetoMolecularCloning TechniquesVol. 152,S.L.BergerandA.R.KimmerlEds. ,AcademicPressInc. ,San Diego,USA(1987));《現(xiàn)代分子生物學實驗技術（CPMB)》（FredM.Ausubel等主編，John Wiley和Sons出版公司）（CurrentProtocolsinMolecularBiology(CPMB)(Fred M.Ausubel，etal.ed·，JohnWileyandSons，Inc·))，《現(xiàn)代蛋白科學實驗技術（CPPS)》 (JohnE.Coligan等主編，JohnWiley和Sons出版公司）（CurrentProtocolsinProtein Science(CPPS)(JohnE.Coligan，et.al.，ed.，JohnWileyandSons，Inc.))，和《現(xiàn) 代免疫學實驗技術（CPI)》（(JohnE.Coligan等主編，JohnWiley和Sons出版公司）(CurrentProtocolsinImmunology(CPI)(JohnE.Coligan,et.al. ,ed.JohnWileyand Sons，Inc.))，在此通過整體引用將其全部并入本文。
[0053] 應當理解的是，下面的詳細描述和下述實施例只是示例性的，并不被認為限制本 發(fā)明的范圍。對本領域普通技術人員顯而易見的公開的【具體實施方式】的各種變化和改進， 可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)做出。進一步地，出于描述和公開的目的，在此通過引 用明確并入了所有專利、專利申請和經(jīng)鑒定的出版物，例如，這些出版物中描述的可能與本 發(fā)明結(jié)合使用。這些出版物被單獨提供，因為它們在本申請的申請日之前公開。在這方面， 沒有什么應該可解釋為對發(fā)明人無權憑借在先發(fā)明或任何其它原因而先于這些公開的承 認。關于日期的所有聲明或關于這些文件內(nèi)容的陳述是基于 申請人:可獲得的信息，不構成 關于日期和這些文件內(nèi)容正確性的任何承認。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0054] 圖1A-1R顯示了R0B02表達和定位于足細胞的基底細胞表面。在（圖1A-1Q):中 所有免疫染色于600X放大倍率下在小鼠E16. 5天進行（如圖5A-5M顯示的成年小鼠腎小 球免疫染色）。（圖1A-1C) :R0B02與足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin共定位。（圖1D-1F) R0B02與足細胞裂孔隔膜蛋白podocin共定位。（圖1G-1I) :R0B02與腎小球中銜接蛋白 Nck共定位。（圖1J-1L) :R0B02表達在與腎小球基底膜巢蛋白（nidogen)相鄰的基底足 細胞表面。（圖1M-10) :R0B02不與腎小球內(nèi)皮細胞蛋白標志物血小板內(nèi)皮細胞粘附分子 I(Pecaml)共定位。（圖1P):(圖1L)中框出的擴大區(qū)域表示R0B02主要表達在與腎小球 基底膜標記物巢蛋白（nidogen)相鄰的足細胞（P)的基底細胞表面（箭頭）。R0B02在足 細胞的頂端和側(cè)面的細胞表面（箭頭）弱表達。（圖IQ) :R0B02主要表達在足細胞（P)基 底細胞表面（箭頭），在頂端和側(cè)面的細胞表面（箭頭）弱表達。（圖IR):免疫膠體金電 子顯微鏡顯示在3周齡小鼠足細胞的足突（FP)中的金色部分（goldpartials)(箭頭）與 1?0802抗體共軛的位置。681:腎小球基底膜。放大倍率50,00(^。也參見于圖54-5皿。
[0055] 圖2A-2J顯示了R0B02與銜接蛋白Nck相互作用，且與腎臟蛋白形成復合物。（圖 2A):酵母雙雜交分析表明R0B02胞內(nèi)域（R0B02-I⑶）和Nckl之間有正的相互作用.LacZ 報告子（reporter)(X-gal) :+++，酵母轉(zhuǎn)暗；++，轉(zhuǎn)亮；-，在24小時內(nèi)呈白色。Leu報告子 (-Leu) :+，酵母長成；-，酵母未生長。CC，細胞質(zhì)保守區(qū)。數(shù)字表示全長蛋白中的殘基位置。 (圖2B):酵母雙雜交分析表明Nckl的前兩個SH3域?qū)τ谄渑cR0B02-ICD相互作用是必需 的。（圖2C):酵母雙雜交分析顯示了介導R0B02和Nckl相互作用的潛在結(jié)合域。該序列 是R0B02中Nckl的潛在結(jié)合域。富含脯氨酸的區(qū)域突出顯示。（圖2D) :R0B02和Nck的 共沉淀。從his-myc-R0B02轉(zhuǎn)染的細胞（在通道1和通道2用）中收集通道5的細胞溶解 物；從his-myc-R0B02-ΛNBD轉(zhuǎn)染細胞（在通道3和通道4用）中收集通道6的細胞溶解 物。（圖2Ε) :R0B02、Nck和N印hrin的共沉淀。（圖2F):與（圖2Ε)相似的共沉淀，除了 使用his-myc-Nephrin進行捕獲（pulldown)代替his-myc_R0B02。（圖 2G):腎臟內(nèi)源性 Robo2，Nck，和腎臟蛋白（N印hrin)的免疫共沉淀。（圖2H):與（圖2G)相似的分析，除了 用小鼠抗腎臟蛋白（Nephrin)抗體制備沉淀物。（I)Slit2促進了R0B02-Nck-Nephrin復合 物的形成。His-myc-R0B02,N印hrin，和Fyn在用Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液（通道1，3)或 對照條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液（通道2,4)刺激的HEK細胞中表達。（圖2J):(圖21)的強度量 化（intensityquantification)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM;n= 7，Student氏配對t_ 檢 驗，與對照組成相比，*P〈〇. 05, #P〈0. 01。另請參見圖6A-6F'。
[0056] 圖3A-3G顯示了Slit2-R0B02信號抑制N印hrin介導的肌動蛋白的聚合。（圖3A): ⑶16/7-NCD在Hek細胞中與R0B02共表達，其在Slit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液（Slit)或?qū)φ諚l 件培養(yǎng)液培養(yǎng)液（CTL)存在下用抗-CD16抗體和羅丹明結(jié)合的抗-IgG抗體處理。然后將 細胞固定并用FITC結(jié)合的鬼筆環(huán)肽染色以顯示F-肌動蛋白。比例尺，5μm。NCD:腎臟蛋 白（N印hrin)細胞質(zhì)域。（圖3B):與（圖3A)相似的分析，除了CD16/7-NCD被CD16/7-HA 替換和用作對照分析。（圖3C):每個組中，具有F-肌動蛋白尾巴的細胞占具有CD16/7簇 的總細胞的百分比被定量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，*P〈0.01，n= 5。（圖3D):Slit2條 件培養(yǎng)液培養(yǎng)液刺激（通道1和3)或?qū)φ諚l件培養(yǎng)液培養(yǎng)液（通道2和4)后，（圖3A) 中⑶16/7-NCD被抗-⑶16抗體免疫沉淀。注意通道1中減少的F-肌動蛋白。⑶16/7-HA 用作陰性對照。（圖3E):(圖3D)的強度量化。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM;Student氏配對 t-檢驗，與對照組相比，η= 4, *Ρ〈0·05。（圖3F):使用抗-N印hrin抗體對來自于R0B02 敲除的純合子（R0B02-/-)，雜合子（R0B02+/-)，和野生型（R0B02+/+)小鼠腎臟的N印hrin 的免疫沉淀。注意通道3中增加的F-肌動蛋白。（圖3G):(圖3F)的強度量化。數(shù)據(jù)表示 為平均值土SEM;AN0VA分析，與野生型和雜合子相比，η= 4，*P〈0. 05。另請參見圖7A-7C。
[0057]圖4A-4W顯示了R0B02純合缺失（homozygousnull)、R0B02足細胞特異性敲除、 和R0B02和Nphsl雙基因敲除小鼠的足細胞結(jié)構表型。（圖4A和4B):新生兒腎臟的代表 圖像顯示野生型（圖4A)和R0B02純合缺失的小鼠（圖4B)中足細胞體（箭頭）和腎小囊 (箭頭）。（圖4C和圖4D):(圖4A和4B)的高倍率放大圖像顯示新生兒腎臟的足細胞足突 (箭頭）。比例尺，lym。（圖4E和4F):3周的腎臟在低倍放大鏡下的代表圖像顯示與年 齡匹配的對照（圖4E)相比，R0B02純合缺失小鼠（圖4F)的足細胞細胞體（箭頭）。（圖 4G和4H):(圖4E和4F)的更高倍率圖像顯示3周的R0B02純合缺失小鼠（圖4H)的無序 的較短的曲折的足突（箭頭），與年齡匹配的對照中有序的拉鏈般的足突（圖4G)進行對 t匕。比例尺：2μm。（圖41和4J):代表性的透射電子顯微鏡圖像（放大倍率5000倍）描 述一月齡R0B02足細胞特異性基因敲除小鼠和正常表型對照組（圖41)中的局灶節(jié)段性足 細胞足突消失（focalfootprocesseffacement)(圖4J中箭頭）。簡稱：gc:腎小球毛細 血管；us:腎小囊腔。（圖4K和4L):高倍的透射電子顯微鏡圖像（40000倍）顯示兩個月齡 R0B02足細胞特異性突變小鼠具有與對照組（圖4K)相比更廣泛的足細胞足突（圖4L中箭 頭）。簡稱：fp:足細胞足突；GBM:腎小球基底膜。（圖4M):-月齡R〇b〇2del5/fl°x、TgNphs2_&e+ 足細胞特異性敲除小鼠（R0B02K0)和野生型同窩小鼠對照（WT)的足細胞足突寬度的定量。 數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM，n= 333，*P〈0. 01。（圖4N):酶聯(lián)免疫吸附分析尿的斑點顯示在 Robo2del5/fl°x、NPHS2-Cre+(K0)成年小鼠中白蛋白/肌酐比值與對照組野生型（WT)相比升 高。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM，η= 20, *P〈0. 01。（圖40):蛋白印跡分析表明尿液中存在 白蛋白；將各孔中加入1μ1尿液，用〇. 2μg白蛋白作陽性對照。WT，三個野生型同窩小鼠； R0B02K0,三個獨立的Robo2del5/flox;Nphs2-Cre+小鼠。（圖4P和4Q):掃描電子顯微鏡 的代表圖像顯示破壞的趾狀突的足細胞足突，其類似于Nphsl-/-單純合新生小鼠腎臟的 雜亂的細胞突起（箭頭）。比例尺：lym。（圖4R和4S):來自于Nphsl-/-R〇b〇2-/-雙純 合新生小鼠的腎小球顯示恢復的趾狀突的足突（箭頭），表明通過敲除R0B02減少^phrin缺失表型。（圖4T和4U):來自于R0B02-/-單純合新生小鼠的腎小球顯示不規(guī)則的和更寬 廣的足突而形成廣泛趾狀突模式（箭頭）。（圖4V和4W):具有正常整齊趾狀突模式的足 突（箭頭）的新生野生型小鼠的腎小球。還參見圖8A-8Z和表1-4。
[0058] 圖5A-5M顯示R0B02在發(fā)育中和成熟的腎小球中的表達。（圖5A和5B):原位雜交 分析顯示R0B02轉(zhuǎn)錄物在E16. 5的正在發(fā)育的腎小球（箭頭）中表達。放大倍數(shù)：60X(圖 5A)和200X(圖5B)。（圖5C-5F):免疫組織化學（IHC)研究揭示R0B02在E14. 5到E17. 5 的正在發(fā)育的腎小球中表達。放大倍率：600X。（圖5G) :IHC顯示R0B02在5周齡的成年 小鼠腎小球中特異性表達（圖5G)。DAPI標記腎臟的細胞核。放大倍率：400X。（圖5H) :5 周齡腎臟的IHC共定位染色表明R0B02在具有足細胞標志物WTl的腎小球中共表達。放大 倍率：600X。（圖51和5K) :R0B02和WTl在E16.5的小鼠腎小球中共表達。（圖5L和5M): 5周齡腎臟的IHC共定位染色表明R0B02在具有腎小球系膜細胞標記物Pdgfrb(圖5L)和 內(nèi)皮細胞標記物Pecaml(圖5M)的腎小球中共表達。放大倍率：600X。
[0059] 圖6A-6F'顯示了R0B02與Nck相互作用，并形成含有N印hrin的復合物，其是 通過Slit2的刺激而增強。（圖6A) :R0B02和含有內(nèi)源性Nck的N印hrin的免疫共沉淀。 R0B02、Nephrin和Fyn在Hek細胞中表達，并通過Slit2刺激。內(nèi)源性Nck由抗-Nck抗 體免疫沉淀。以小鼠IgG作為對照。含有N印hrin的復合物的形成通過Slit2和Fyn表 達增強。（圖6B和6C) :Slit2通過免疫過氧化物酶染色而在新生小鼠腎小球中表達（圖 6B)，并且在腎小球中與足細胞標記物突觸極蛋白（Synaptopodin)共表達（圖6C)。放大 倍率：600X。（圖6D和圖6D'）：在Slit2存在下，CD16/7-NCD與R0B02在Hek細胞中共表 達，用抗-CD16抗體和羅丹明結(jié)合的抗-IgG抗體處理，然后固定并用抗-R0B02抗體染色。 ⑶16/7-NCD簇與R0B02共定位（圖6D)、但在對照的⑶16/7-HA簇（圖6D'）中觀察到未共 區(qū)域化的CD16/7-NCD簇。比例尺：5μm。NCD:N印hrin細胞質(zhì)區(qū)。（圖6E-6E'）：R0B02中 Nck結(jié)合域（NBD)的缺失損害了其在Slit2存在下與⑶16/7-NCD的共定位。⑶16/7-NCD簇 與R0B02共定位（圖6E)、但在R0B02-ANBD簇中觀察到未共區(qū)域化的CD16/7-NCD簇（圖 6E'）。比例尺：5μm。（圖 6F和 6F'）：Slit2 的刺激增強了CD16/7-NCD和R0B02 在Hek細 胞中的共定位。⑶16/7-NCD簇與R0B02在Slit2存在下共定位（圖6F)，但不在對照條件 培養(yǎng)液培養(yǎng)液共定位（圖6F'）。比例尺：5μm。
[0060] 圖7A-7C顯示在Robo2中Nck結(jié)合域（NBD)的缺失折中了Slit2-R0B02對N印hrin 誘導的肌動蛋白聚合的抑制。（圖7A) :CD16/7-NCD和R0B02在Hek細胞中共表達，與 抗-CD16抗體和羅丹明結(jié)合的抗-IgG抗體在SIit2條件培養(yǎng)液培養(yǎng)液（SIit2)或?qū)φ諚l件 培養(yǎng)液培養(yǎng)液（CTL)存在下聚集。然后將細胞固定，并用FITC結(jié)合的鬼筆環(huán)肽染色，以顯 示F-肌動蛋白纖維。⑶16/7-NCD和F-肌動蛋白纖維的簇通過共聚焦顯微鏡檢查得到的。 比例尺，5μm。NCD:N印hrin細胞質(zhì)區(qū)。（圖 7B) :CD16/7_NCD和R0B02-ΛNBD在Hek細胞 中共表達。比例尺，SymtjNBD:Nck結(jié)合域。（圖7C):在每組中，具有F-肌動蛋白尾巴的 細胞占具有CD16/7-NCD簇的總細胞的百分比被定量化。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM，AN0VA. 分析*p=I. 436xlCT5,**p= 6. 32xlCT5,η= 5。
[0061] 圖8A-8Z顯示在R0B02純合缺失、R0B02足細胞特異性敲除、R0B02和Nphsl雙敲除 小鼠中腎小球的表型，和R0B02-Nephrin信號的擬建模式。（圖8A-8F):透射電子顯微鏡分 析新生的（NB)Robo2del5/de15突變小鼠腎臟中腎小球的超微結(jié)構。（圖8A，8C，8E):在低倍率 (圖8A，2200X)，中倍率（圖8C，15500X)和高倍率（圖8E，52000X)下的新生雜合的R0B02 對照小鼠的腎小球超微結(jié)構。（圖8B，8D，8F):在低倍率（圖8B，2200X)，中倍率（圖8D， 15500X)和高倍率（圖8F，52000X)下新生雜合的R0B02(-/_)(即Robo2del5/de15)的突變小 鼠的腎小球超微結(jié)構。箭頭表示局灶節(jié)段性足細胞足突消失。簡稱：gc:腎小球毛細血管； us:腎小囊腔；GBM:腎小球基底膜。（圖8G-8N):在R0B02特異性敲除小鼠中異常的足細胞 足突模式。（圖8G-8J):來自于一月齡R〇b〇2del5/fl°x、Nphs2-Cre+足細胞特異性敲除小鼠和 年齡匹配的R〇b〇2fl°x/+對照小鼠的腎小球的代表的掃描電子顯微鏡圖像。在一月齡R0B02 足細胞特異性敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)趾狀突足細胞足突的輕度不規(guī)則（圖8K和8N)。當七個月大 時，Robo2足細胞特異性敲除小鼠發(fā)生明顯不規(guī)則的足突（圖8L和8N)。比例尺：10微米 (圖86,8札81(，81^放大倍率200(^)和2微米（圖81，81，81，81放大倍率1300(^)。（圖 80-8T) :Robo2足細胞特異性敲除小鼠的腎小球形態(tài)。（圖80-8R)希夫氏高碘酸（PAS)染色 顯示2月齡和6月齡Robo2足細胞特異性敲除小鼠的腎小球的系膜基質(zhì)擴張（圖8P，8R)， 對照為年齡匹配的小鼠（圖80,8Q)。（圖8S):腎小球的定量分析表明12月齡Robo2足細 胞特異性敲除小鼠（MU)的腎小球系膜基質(zhì)擴張，與年齡匹配的野生型（WT)對照相比。數(shù) 據(jù)表示為平均值±SEM，n= 5，*P〈0.01。（T):RObO2足細胞特異性敲除不影響足細胞的數(shù) 量。使用WT-I染色鑒定足細胞。計算4個一年齡R〇b〇2del5/fl°x、TgNphs2_&e+足細胞特異性敲除 小鼠（MU)中的每個腎小球橫截面的足細胞數(shù)量，對照為4個年齡匹配的野生型小鼠（WT)。 數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM，p= 0· 645,t-檢驗；突變體：n= 165腎小球；對照：η= 166腎 小球。（圖8U-8Y) :Robo2和Nphsl雙敲除小鼠中腎小球的表型。（圖8U) :Η&Ε染色顯示在 Nphsl+單純合新生小鼠中腎小球具有膨脹鮑曼腔（星號）的特性，放大倍率400倍。（圖 8V) :Robo2+單純合新生小鼠的腎小球顯示沒有鮑曼腔的膨脹，放大倍率400倍。（圖8W): 在R〇b〇2+、Nphsl+雙純合新生小鼠中顯示、正常沒有鮑曼腔膨脹（箭頭）的腎小球樣貌， 其表明Nphsl+腎小球表型的減輕，放大倍率400倍。（圖8X):作為對照的年齡匹配的野 生型新生小鼠的正常腎臟和腎小球的H&E染色，放大倍率400倍。（圖8Y):新生小鼠中具 有膨脹鮑曼腔的腎小球的定量分析表明R〇b〇2+、Nphsl+雙純合中具有膨脹表型鮑曼腔特 性的腎小球顯著減少，對照為R0B02-/-單個純合（R〇b〇2+/'Nphsl+)。數(shù)據(jù)表示為平均值 土SEM，*ρ〈0· 01。（圖8Z) :Slit2-Robo2信號對N印hrin的抑制效應以影響足細胞足突結(jié) 構的模型：在生理條件下（例如，在足突發(fā)育期間），Nephrin細胞內(nèi)磷酸化酪氨酸結(jié)構域 (YDxV-P)通過其與SH2結(jié)構域的相互作用結(jié)合Nek。反過來，Nck通過其SH3結(jié)構域與細胞 骨架調(diào)節(jié)器結(jié)合，以促進肌動蛋白聚合。Slit2與Robo2結(jié)合，用以增加Robo2胞內(nèi)域與Nck 的SH3結(jié)構域的相互作用，這可防止Nck結(jié)合至細胞骨架調(diào)節(jié)器，并導致對N印hrin誘導的 肌動蛋白聚合的抑制。在足細胞發(fā)育為正常足突結(jié)構期間可維持均衡的肌動蛋白聚合。在 沒有Slit2-Robo2信號（例如，當Robo2被敲除時）時，Robo2對N印hrin誘導聚合的抑制 作用消失。Nck的SH3結(jié)構域可與下游的細胞骨架調(diào)節(jié)器相互作用，以增加肌動蛋白聚合， 其可以解釋在R〇b〇2突變小鼠中足細胞足突結(jié)構的改變。簡稱：Ig:免疫球蛋白域；FN3 :纖 連蛋白3型結(jié)構域；SH2 :Src同源2結(jié)構域；SH3 :Src同源3結(jié)構域；CC0、CC1、CC2、CC3^ 胞質(zhì)保守區(qū)〇、1、2、3。

【具體實施方式】
[0062] 以前已經(jīng)證明Robo2是推進導向暗號Slit(repulsiveguidancecueSlit)的細 胞表面受體，并參與神經(jīng)系統(tǒng)的軸突導向和神經(jīng)元遷移。Nephrin是一種足細胞狹縫隔膜 蛋白，其在腎臟的腎小球過濾屏障中起作用。在此我們證明R〇b〇2在足細胞基面上表達， 例如小鼠足細胞，并與N印hrin共定位。生物化學研究表明，通過銜接蛋白Nck，Robo2與 Nephrin在腎臟中形成復合物。與Nephrin促進肌動蛋白聚合的作用形成對照，在此我們 顯示了Slit2-Robo2信號抑制Nephrin誘導的肌動蛋白聚合。例如，與Nephrin相關聯(lián)的 F-肌動蛋白的數(shù)量在Robo2敲除小鼠中增加，其形成改變的足細胞足突結(jié)構及微蛋白尿。 遺傳相互作用的研究進一步揭示R〇bo2缺失減輕N印hrin缺失小鼠的異常足細胞表型。在 此提供的結(jié)果顯示R〇b〇2信號作為N印hrin的負調(diào)節(jié)因子以影響足細胞足突結(jié)構。
[0063] 另外，已經(jīng)證明，患有膀胱輸尿管返流（VUR)的病人有染色體易位，其可破壞 R0B02基因，并產(chǎn)生可終止SLIT2-R0B02信號通路的顯性失活R0B02融合蛋白。通常地，VUR 是一種尿液從膀胱逆流至輸尿管和腎臟的疾病，VUR患者可出現(xiàn)反流性腎病，這個狀態(tài)伴有 嚴重蛋白尿。已經(jīng)顯示，由VUR患者產(chǎn)生的顯性失活R0B02融合蛋白封閉SLIT2-R0B02信 號通路，并保護患者免于反流性腎病和蛋白尿，從而確認并進一步支持發(fā)明人的結(jié)果，該結(jié) 果是在以SLIT2-R0B02信號通路為目標治療慢性腎臟疾病產(chǎn)生的治療價值的動物模型中 得到的。
[0064] 正常腎臟中，三層的腎小球毛細血管壁包含網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞、基底膜和足細胞其 限制了血漿蛋白的滲透性。足細胞是專門的上皮細胞，其延伸初級和次級突觸以覆蓋腎 小球基底膜的外表面。相鄰足細胞中富含肌動蛋白的趾狀突的次級突觸或足突，通過半 滲透狹縫隔膜橋連建立了過濾縫，從而形成蛋白滲透的最終屏障。鑒于足細胞狹縫隔膜 蛋白如Nephrin和其它的基因突變性與蛋白尿腎臟疾病的遺傳形式相關（特里格瓦松 (Tryggvason)等，2006)(Tryggvasonetal·，2006)，構成狹縫隔膜蛋白和與狹縫隔膜蛋 白相關的蛋白不只是簡單的結(jié)構屏障，這已經(jīng)是明顯的。這些蛋白形成一種均衡的信號網(wǎng) 絡，其通過與F-肌動蛋白細胞骨相互作用可影響足細胞足突結(jié)構和功能（福勒等，2007 ; 瓊斯Jones等，2006;維爾馬等，2006)(Fauletal·，2007;Jonesetal·，2006;Vermaet al.，2006)。
[0065]遷回（roundabout) (Robo)家族蛋白，Robol、Robo2、Robo3 和Robo4,是分泌性配 體Slit(secretedligandSlit)的細胞表面受體（迪克遜（Dickson)和Gilestro, 2006) (DicksonandGilestro, 2006)。最初發(fā)現(xiàn)，Slitl、Slit2 和Slit3 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程 中是作為軸突導向和神經(jīng)元遷移的推進導向暗號（關（Guan)和饒（Rao) ,2003)(Guanand Rao,2003)?？缒さ鞍識obo含有五個Ig基序，三個III型纖連蛋白（FNIII)，在其胞外域中 重復（迪克遜（Dickson)和Gilestro, 2006)(DicksonandGilestro, 2006)。雖然這兩種免 疫球蛋白（Ig)基序1和2與SIit相互作用，Robo的第一Igl基序是SIit的主要結(jié)合位點 (迪克遜（Dickson)和Gilestro,2006)(DicksonandGilestro, 2006)。Robo的胞內(nèi)域有 四個細胞質(zhì)保守（CC)序列，名為CC0，CC1，CC2和CC3(伯肖（Bashaw)等，2000 ;基德（Kidd) 等，1998 ;漠爾洛（Morlot)等，2007,艾倫（Zallen)等，1998)(Bashawetal·，2000;Kidd etal.，1998;Morlotetal.，2007;Zallenet&1.，1998)。0〇)和CCl含有酪氨酸，而CC2 和CC3是富含脯氨酸的延伸。Slit-Robo信號的推進活性抑制肌動蛋白的聚合（關（Guan) 和饒（Rao) ,2003)(GuanandRao, 2003)或者誘導的F-肌動蛋白解聚（派拍（Piper)等， 2006)(Piperetal. , 2006)〇
[0066] Slit-Robo信號在早期腎臟感應和輸尿管萌芽生長過程中也起著至關重要的作 用。缺少Slit2或Robo2的小鼠突變體生長出多余的輸尿管芽，從而產(chǎn)生廣譜的尿路表 型，包括雙腎、輸尿管膀胱畸形連接和腎積水（Grieshammer等，2004;陸（Lu)等，2007) (Grieshammeretal·，2004;Luetal. 2007)。人類R0B02的破壞引起腎臟和尿路的先天 異常（CAKUT)，膀胱輸尿管返流（VUR)患者已經(jīng)確定有Robo2點突變（陸（Lu)等，2007)(Lu etal.，2007)。我們最近的研究表明，Robo2對正常輸尿管口的形成和是維持有效的抗返 流機制身至關重要的（王（Wang)等人，2011)(Wangetal.，2011)。
[0067] 在此我們證明，Robo2是在腎臟中腎小球足細胞基底表面表達的新型足細胞蛋白， 并與Nephrin和podocin共定位。Robo2直接與銜接蛋白NckSH3域相互作用，并與Nephrin 形成復合物。鑒于R〇b〇2敲除小鼠長出的改變的足細胞足突，Robo2的缺失減輕了Wphrin 缺失小鼠的足突結(jié)構的畸形。在此描述的這些結(jié)果表明，R〇b〇2信號作為Nephrin信號的 負調(diào)節(jié)器以影響足細胞足突結(jié)構。另外，如本文所證明的，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，患者產(chǎn)生的顯性失活 R0B02融合蛋白封閉Slit2-R〇b〇2信號通路，保護患者免于返流性腎病和蛋白尿，從而確認 并進一步支持發(fā)明人的結(jié)果，該結(jié)果在以SLIT2-R0B02信號通路為目標治療慢性腎臟疾病 產(chǎn)生的治療價值的動物模型中得到的。
[0068] 因此，在一些方面，在此提供治療有需要的受治療者慢性腎臟疾病的方法，這樣的 方法包括將治療有效量的含有S1U2-R0B02信號通路抑制劑的組合物給予患有或具有患 慢性腎臟疾病風險的受治療者。
[0069] 在一些方面，在此還提供降低有需要受治療者蛋白尿的方法，該方法包括將治療 有效量的含有S1U2-R0B02信號通路抑制劑的組合物給予患有或具有患蛋白尿風險的受 治療者。
[0070] 在另一些方面，在此還提供預防或促進預防治療有需要的受治療者的腎臟疾病的 方法，該方法包括將治療有效量的含有S1U2-R0B02信號通路抑制劑的組合物給予受治療 者，以預防或促進預防治療受治療者的腎臟疾病。
[0071] 在一些方面，在此還提供在有需要受治療者中減輕腎臟疾病影響、降低腎臟疾病 嚴重性、降低腎臟疾病發(fā)展的可能性和/或減慢腎臟疾病進程的方法。
[0072] 如在此所用，"R0B02"是指具有如下氨基酸序列的多肽：MARRHERVTRRMWTWAPGLLM MTVVFWGHQGNGQGQGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHR MLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRG HPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVV LEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTVRAP PQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTCDLTITNIQRSDAGYYI CQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATCDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATI QEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQP GTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPP AQGVDHRQVQKEL⑶VLVRLHNPWLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSA VLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSffDPPPPDHQNGIIQ EYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSIT EQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSIffLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPffLA DSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQ ILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPP PVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATL TPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTffHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALE IPRPLRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFSTDSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHR REGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTGEL(智 人迂回家族同族體2亞型R0B02a;SEQIDN0:1)，例如通過NP-001122401.I描述的和通 過NM-001128929.2(SEQIDN0:2)編碼；或MSLLMFTQLLLCGFLYVRVDGSRLRQEDFPPRIVEHPSD VIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYL GEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYffKKDKVRIDDKEERISIRGGKLMISNT RKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRY DIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFff QKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTCDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGP ANQTLAVDGTALLKCKATCDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSA VLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTT LYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVT WTVDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTT EEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQ YRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIGGACWVILMGFSIffLYWRRKK RKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDK TATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQ NKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQG LEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPP QPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFST DSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTE VLRAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTGEL(智人同族體2亞型R0B02b;SEQIDN0:3)，例如通過 NP_002933.I描述和通過NM_002942. 4(SEQIDN0:4)編碼的，以及與任何自然發(fā)生的等位 基因，接合變體及其處理后的形式一起。代表性地，R0B02是指人類R0B02。R0B02基因在 黑猩猩、獼猴、狗、奶牛、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、果蠅、蚊子和線蟲中是保守的。R0B02特定的 殘基被稱為，例如"R0B02 (30) "。
[0073]R0B02的特定結(jié)構域也可以通過這些術語被提及。包含5個免疫球蛋白基序和3 個III型纖連蛋白（FNIII)重復序列的N-端或"R0B02的胞外域"，例如，可被稱為SEQID NO:1 的R0B02 (46-848)或SEQIDNO:3 的R0B02 (30-832)。與Slit2 相互作用的免疫球 蛋白（Ig)基序1和2,或"IgSLIT結(jié)合域"可被稱為SEQIDNO:1分別的R0B02(46-145) 和R0B02(151-237)，和SEQIDN0:3 分別的R0B02(30-129)和Robo2(135-221)。同樣地， 在此描述的包括"Nek胞內(nèi)結(jié)合域"的"胞內(nèi)域"，其包括4個細胞內(nèi)富含脯氨酸基序，可被 稱為SEQIDNO:3 的R0B02(881-1378)。
[0074] 在此使用的術語"R0B02抑制劑"、"R0B02拮抗劑"、"R0B02抑制劑藥劑"和"R0B02 拮抗劑藥劑"是指具有顯著封閉、抑制、降低或妨礙R0B02 (哺乳動物，如人類R0B02)的體 夕卜、原位和/或體內(nèi)生物活性的分子或藥劑，所述生物活性包括由R0B02信號介導的下游 通路的活性，例如R0B02與銜接蛋白Nck的相互作用和/或與Nephrin形成的復合物，介 導的Nephrin介導的肌動蛋白聚合的抑制的SLIT2-R0B0-2,和/或誘導R0B02的細胞應 答。在此使用的關于R0B02抑制劑的術語"藥劑"，意思是任何化合物或物質(zhì)，例如但不限 于，小分子、核酸、多肽、肽、藥物、離子等。"藥劑"可為任何化學的、實體、或部分，包括但不 限于，合成的和自然產(chǎn)生的蛋白實體和非蛋白實體。在此描述的方面的一些【具體實施方式】 中，藥劑為核酸、核酸類似物、蛋白質(zhì)、抗體、肽、適體、核酸低聚物、氨基酸或碳水化合物，以 及包括但不限于，蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酶、脫氧核酶（DNAzymes)、糖蛋白、反義RNA、小干擾 RNA(siRNAs)、脂蛋白、適體以及上述的變型和組合?？梢灾?，在此描述的用于治療組合物 和方法的化合物具有期望的活性和/或性質(zhì)，或采用本領域普通技術人員知道的篩選方法 可以從各種化合物的化合物可庫中進行選擇。
[0075] 在此描述的各種方面和【具體實施方式】預期使用的示例性R0B02抑制劑包括，但不 限于，與R0B02特異性結(jié)合的抗R0B02抗體或其抗原結(jié)合片段；定向編碼R0B02的核酸的反 義分子（例如，R0B02a或R0B02b或兩者）；定向編碼R0B02的核酸的短干擾RNA("siRNA"） (例如，R0B02a或R0B02b或兩者）；結(jié)合到R0B02并且抑制/降低/封閉R0B02介導信號的 RNA或DNA適體；R0B02結(jié)構類似物；和可溶性R0B02蛋白質(zhì)，抑制多肽，如顯性失活的多肽， 或其融合多肽。在此描述的這些方面和所有這些方面的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制 劑（例如抗體或其抗原結(jié)合片段）與R0B02結(jié)合（物理上與其相互作用），以下游的R0B02 信號為目標，和/或抑制（減少）R0B02合成、產(chǎn)生或釋放。在此描述的這些方面和所有這 些方面的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑結(jié)合和抑制其與SLIT蛋白配體，如SLIT2的 結(jié)合。在此描述的這些方面和所有這些方面的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑特異性 地減少或消除一種或多種R0B02亞型的表達（例如轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)化）。
[0076] 在此使用的R0B02抑制劑或拮抗劑能夠降低在細胞（例如足細胞）中R0B02的活 性和/或表達至少5 %，至少10 %，至少15 %，至少20 %，至少25 %，至少30 %，至少35 %， 至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至 少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %，至少99 %，或更多，與沒有R0B02抑制 劑存在的活性或表達水平相比。
[0077] 因此，在在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，Robo2抑制劑抑制 Robo2介導的信號傳導。在在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，Robo2抑制劑 以與銜接蛋白Nck相互作用的Robo2為目標和/或與NephriruNephrin介導肌動蛋白聚合 的SLIT2-R〇b〇-2介導的抑制劑、和/或?qū)obo2細胞反應的誘導的絡合生成。
[0078] 在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑的結(jié)合位點，例 如抗體或其抗原結(jié)合片段，是針對R0B02配體的相互作用位點，例如SLIT2配體相互作用 位點。在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑的結(jié)合位點，例如 抗體或其抗原結(jié)合片段，是針對R0B02適配體結(jié)合位點，例如Nck相互作用位點或包括四 個R0B02的細胞內(nèi)富含脯氨酸基序的NCK胞內(nèi)結(jié)合域。在此描述的組合物和方法的一些

【具體實施方式】中，R0B02抑制劑的結(jié)合位點是針對配體相互作用位點附近的一個位點目 標，以便于為受體（例如R0B02)和其配體（例如SLIT2)的相互作用提供空間障礙。通過 與R0B02配體相互作用位點結(jié)合，在此描述的R0B02抑制劑可減少或抑制R0B02的活性或 表達，以及下游R0B02信號結(jié)果（例如R0B02與銜接蛋白Nck相互作用和/或與N^hrin 形成復合物，介導N印hrin介導的肌動蛋白聚合的SLIT2-R0B0-2的抑制，和/或?qū)0B02 細胞應答的誘導）。例如，在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制 劑的結(jié)合位點封閉或靶向于R0B02上至少Igl，并優(yōu)選Igl和Ig2位點，S卩，例如各自SEQ IDN0:1 的B02(46-145)和R0B02(151-237)，以及各自SEQIDN0:3 的R0B02(30-129)和 R0B02 (135-221)。在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑的結(jié)合位 點封閉或靶向于含有Nck胞內(nèi)結(jié)合域的R0B02胞內(nèi)域，即SEQIDNO: 3的R0B02 (818-1378)。 在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑的結(jié)合位點封閉或靶向于 含有四個R0B02的細胞內(nèi)富含脯氨酸基序的R0B02Nck胞內(nèi)結(jié)合域。這可由本領域已知的 多種方式完成，例如抗體和其抗原結(jié)合片段，抑制劑RNA，等，以及如在此描述的。
[0079] 因此，在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是抗體或 其抗原結(jié)合片段，其與R0B02選擇性結(jié)合或與其物理上相互作用。在此描述的組合物和方 法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑是抗體或其抗原結(jié)合片段，其與R0B02結(jié)合并抑制 和/或封閉和/或阻止與Nck的相互作用和/或與Nephrin復合物的生成。在此描述的 組合物和方法的一些【具體實施方式】中，抗體或其抗原結(jié)合片段與R0B02的IgSLIT結(jié)合域 結(jié)合。在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，抗體或其抗原結(jié)合片段與R0B02 的IgISLIT結(jié)合域結(jié)合，或同時與R0B02的Ig1和Ig2SLIT結(jié)合域結(jié)合，S卩，各自SEQID N0:1 的R0B02(46-145)和R0B02(151-237)，以及各自SEQIDN0:3 的R0B02(30-129)和 R0B02 (135-221)。在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，抗體或其抗原結(jié)合片 段結(jié)合到或封閉R0B02的胞內(nèi)域，S卩，SEQIDNO: 3的R0B02 (818-1378)。在此描述的組合 物和方法的一些【具體實施方式】中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到或封閉含有四個R0B02的 細胞內(nèi)富含脯氨酸基序的Nck胞內(nèi)結(jié)合域。
[0080] 適用于在此描述的組合物和實施在此描述的方法的R0B02的特異性的抗體或選 擇性結(jié)合R0B02的抗體，優(yōu)選為單克隆的，且可包括但不限于，人類抗體，人源化抗體或嵌 合抗體，含有單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab'）片段，由Fab表達庫產(chǎn)生的片段，和/或上述任意 的結(jié)合片段。抗體也可指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有抗原 的分子或靶向結(jié)合位點或"抗原結(jié)合片段"的分子。這里描述的免疫球蛋白分子可為本領 域技術人員理解的免疫球蛋白分子的任意類型（IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類（IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。
[0081] 因此，在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，在此描述的R0B02抑制 劑為單克隆抗R0B02抗體或抗原結(jié)合片段。
[0082] 在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，在此描述的R0B02抑制劑是 R0B02抗體片段或抗原結(jié)合片段。在此所用的術語"抗體片段"、"抗體結(jié)合片段"和"抗體 衍生物"是指僅含有完整抗體的部分的蛋白質(zhì)片段，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合點，并且 因此保留了與抗原結(jié)合的能力。該術語抗體片段包括的抗體片段或抗原結(jié)合片段的實例包 括：⑴Fab片段，具有VpCpVh和ChI結(jié)構域；（ii)Fab'片段，其是一種Fab片段，在ChI結(jié) 構域的C-端具有一個或多個半胱氨酸殘基；（iii)Fd片段，具有VH、CH1域；（iv)Fd'片段，具 有Vh和ChI結(jié)構域，以及在ChI結(jié)構域的C-端具有一個或多個半胱氨酸殘基；(V)Fv片段， 具有單臂抗體'和￥11結(jié)構域；（vi)dAb片段（沃德等，自然雜志，1989(341) :544-546)(Ward etal.，Nature341, 544-546 (1989)),由Vh 或Vl 結(jié)構域組成；（vii)分離的Q)R區(qū)；（viii) F(ab'）2片段，其為二價片段，包含兩個通過二硫橋鍵在鉸鏈區(qū)連接的Fab'片段，（ix)單鏈 抗體分子（如單鏈Fv、scFv)(伯德等，科學雜志，1998, 242 :423-426,和休斯頓等，美國國 家科學院院刊（美國），1988,85 :5879-5883)(Birdetal·，Science242:423-426(1988); andHustonetal. ,PNAS(USA) 85:5879-5883 (1988)) ;(X)具有兩個抗原結(jié)合點的"雙體"， 在相同多肽鏈中包括與輕鏈可變區(qū)（')相連的重鏈可變區(qū)（Vh)(見，例如，EP404097 ;W0 93/11161 ;霍林格等，美國國家科學協(xié)會公報，美國，1993,90 :6444-6448)(EP404,097 ; WO93/11161；andHollingeretal. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448(1993))； (xi) "線性抗體"，包括一對串聯(lián)的Fd片段（Vh-ChI-Vh-ChI),其與互補的輕鏈多肽形成一對 抗原結(jié)合域（薩帕塔等。蛋白質(zhì)工程，1995,8(10) :1057-1062 ;美國專利5641870)(Zapata etal.ProteinEng. 8 (10) :1057-1062 (1995);andU.S.Pat.No. 5, 641，870);以及前述任 意的修飾版本（通過聚二醇（聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇）或其它適當聚合物的共價結(jié) 合的修飾）。
[0083] 在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑或拮抗劑為 R0B02拮抗劑抗體或其抗原結(jié)合片段的嵌合抗體衍生物。
[0084] 在此所述的R0B02抑制劑或拮抗劑抗體及其抗原結(jié)合片段，在一些【具體實施方式】 中，也可為人源化抗體衍生物。
[0085] 在一些【具體實施方式】中，在此所述的R0B02抑制劑或拮抗劑抗體及其抗原結(jié)合片 段，包括修飾的衍生物，如被任意類型的分子通過的共價連接與抗體結(jié)合，條件是共價結(jié)合 不會阻止抗體與目標抗原的結(jié)合，如R0B02。
[0086] 在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，使用完整的人類抗體，其對人 類患者的治療處理是尤為令人滿意的。
[0087] 在此描述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑包括至少一種通 過靶向于編碼R0B02的核酸能夠封閉或減少特定功能R0B02的表達的反義分子，例如SEQ IDN0:2或SEQIDN0:4,或兩者，或其相關的結(jié)構域。在此所述的組合物和方法的一些具 體實施方式中，所述至少一種反義分子靶向于編碼R0B02的IgSLIT結(jié)合域的核酸。在此 所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述至少一種反義分子靶向于編碼R0B02的 IglSLIT結(jié)合域或R0B02的Igl和Ig2SLIT結(jié)合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一 些【具體實施方式】中，所述至少一種反義分子靶向于編碼R0B02胞內(nèi)域的核酸。在此所述的 組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述至少一種反義分子靶向于編碼包含四個R0B02 的細胞內(nèi)富含脯氨酸基序的Nck胞內(nèi)結(jié)合域的核酸。反義寡核苷酸的制備方法為本領域 普通技術人員已知的，所述的反義寡核苷酸不與其它多核苷酸交叉反應即可特異性地與 R0B02mRNA結(jié)合。祀向位點的示例包括但不限于,起始密碼子；5'調(diào)節(jié)區(qū),包括啟動子或增 強子編碼序列，包括任意保守的共識區(qū)；和3'非翻譯區(qū)。在此所述的這些方面和這些所有 方面的【具體實施方式】中，所述反義寡核苷酸的長度約為10至約100個核苷酸，約15至約50 個核苷酸長度，約18至約25個核苷酸長度或更多。在某些【具體實施方式】中，反義寡核苷酸 進一步包括化學修飾以提高抗核酸酶等諸如此類，例如，本領域普通技術人員已知的硫代 磷酸酯鍵和2' -O-糖基修飾。
[0088] 在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制劑包括至少一 種小干擾RNA(siRNA)分子，該小干擾RNA能夠封閉或減少功能性R0B02表達的其是通過靶 向于編碼R0B02的核酸或靶向于R0B02的兩種亞型如SEQIDNO: 2或SEQIDNO:4或其相 關域的核酸實現(xiàn)的。在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述至少一種siRNA 分子靶向于編碼R0B02的IgSLIT結(jié)合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實 施方式中，所述至少一種siRNA分子靶向于編碼R0B02的IglSLIT結(jié)合域或R0B02的Igl 和Ig2SLIT結(jié)合域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述至少一 種siRNA分子靶向于編碼R0B02胞內(nèi)域的核酸。在此所述的組合物和方法的一些具體實施 方式中，所述至少一種siRNA分子靶向于編碼包含四個R0B02的細胞內(nèi)富含脯氨酸基序的 Nck胞內(nèi)結(jié)合域的核酸。制備siRNA分子是常規(guī)的，不與其它多核苷酸交叉反應可特異性地 靶向于R0B02mRNA。用于在此所述的組合物和方法的siRNA分子可由本領域已知方法制成， 例如采用典型的固相合成寡核苷酸，并且與化學修飾結(jié)合用以提高siRNA藥劑的半衰期和 /或功效，和/或產(chǎn)生更多的強的遞送制劑。做為選擇地，siRNA分子通過編碼細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 siRNA的表達盒的載體進行遞送。
[0089] 在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制劑為RNA或DNA 適體，其與一種或多種R0B02亞型結(jié)合。在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中， R0B02抑制劑或拮抗劑為RNA或DNA適體，其與R0B02結(jié)合或與其進行物理上的相互作用， 并且封閉R0B02與配體分子或銜接分子之間的相互作用，諸如分別為SLIT2或Nek。在此所 述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑或拮抗劑為RNA或DNA適體，其與 R0B02結(jié)合或與其物理上相互作用，并且降低、阻止或封閉下游的R0B02信號，例如N^hrin 介導肌動蛋白聚合的抑制介導的SLIT2-R0B0-2,和/或誘導對R0B02的細胞應答。在此所述 的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述為RNA或DNA適體與R0B02的IgSLIT結(jié)合域 進行結(jié)合或與其進行物理上相互作用。在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中， 所述RNA或DNA適體與R0B02的IglSLIT結(jié)合域或與R0B02的Igl和Ig2SLIT結(jié)合域結(jié)合或 與其物理上相互作用，即SEQIDNO: 1各自的R0B02 (46-145)和R0B02 (151-237)，以及SEQ IDNO: 3各自的R0B02 (30-129)和R0B02 (135-221)。在此所述的組合物和方法的一些具體 實施方式中，所述RNA或DNA適體與R0B02胞內(nèi)域例如SEQIDN0:3的R0B02(881-1378)結(jié) 合或與其物理上相互作用。在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述RNA或 DNA適體與Nck胞內(nèi)結(jié)合域結(jié)合或與其物理上相互作用或封閉Nck胞內(nèi)結(jié)合域，所述Nck胞 內(nèi)結(jié)合域含有四個R0B02細胞內(nèi)富含脯氨酸基序。
[0090] 在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制劑為靶向于 R0B02或與其結(jié)合的小分子化合物或藥劑，包括但不限于，小肽或肽類分子，可溶性肽，以及 合成的非肽基有機化合物或合成的非肽基無機化合物。這里使用的術語"小分子"是指以一 種化學的藥劑，可包括但不限于，肽、擬肽物、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類 似物、適體、核苷酸、核苷酸類似物、分子量小于約10000g/m〇l的有機或無機化合物（例如， 包括雜有機化合物（heterorganiccompoundd)和有機金屬化合物）、分子量小于約5000g/ mol的有機或無機化合物、分子量小于約1000g/mol的有機或無機化合物、分子量小于約 500g/mol的有機或無機化合物、以及這些化合物的鹽、酯和其它藥學上可接受的形式。小分 子結(jié)合位點的示例包括但不限于，與SLIT2或適體Nck結(jié)合的R0B02的部分，S卩，R0B02的IgSLIT結(jié)合域或R0B02的Igl和Ig2SLIT結(jié)合域，R0B02胞內(nèi)域或含有四個R0B02細胞內(nèi) 富含脯氨酸基序的Nck胞內(nèi)結(jié)合域。
[0091] 在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制劑或拮抗劑含 有與R0B02結(jié)合或抑制R0B02生物活性的小分子。
[0092] 在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制劑或拮抗劑含 有至少一種R0B02結(jié)構類似物，諸如顯性失活R0B02多肽。這里使用的術語R0B02結(jié)構類 似物是指具有與R0B02的部分的三維結(jié)構相似的化合物，并且其與SLIT2和/或Nck在生 理條件下在體內(nèi)或體外結(jié)合，其中，結(jié)合至少部分地抑制R0B02生物活性，例如Nephrin介 導肌動蛋白聚合的抑制介導的SLIT2-R0B02,和/或誘導R0B02細胞應答。例如，可通過 SLIT2-R0B02結(jié)合的分子模型設計和合成合適的R0B02結(jié)構類似物。R0B02結(jié)構類似物可 為單體、二聚體或以相同或不同結(jié)構任意希望組合的高階多聚體以獲得改進的親和力和生 物效應。
[0093] 在此所述的組合物和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制劑或拮抗劑含 有至少一種可溶性R0B02受體或其融合多肽，例如，R0B02抑制性多肽。在一些這樣的具體 實施方式中，所述R0B02抑制性多肽為顯性失活的R0B0R2融合蛋白質(zhì)。在此所述的組合物 和方法的一些【具體實施方式】中，所述R0B02抑制性多肽含有R0B02胞外域，例如R0B02的 IglSLIT結(jié)合域或R0B02的Igl和Ig2SLIT結(jié)合域，沒有R0B02胞內(nèi)域。
[0094] 在此所述的組合物和方法中使用的R0B02抑制劑或拮抗劑可采用本領域已知的 方法識別或表征，例如，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合分析，生化篩選分析，免疫分析和基于細胞的 分析，這些是本領域眾所周知的，包括但不限于實施例中描述的那些。
[0095] 例如，為了鑒定抑制R0B02與其配體如SLIT2相互作用的分子，可使用結(jié)合分析。 例如，通過共價連接或非共價連接，將R0B02或SLIT固定在微量滴定板上。該分析通過將 可被檢測標簽標記的非固定化組分（配體或受體）加入固定化組分中，在存在或不存在檢 測試劑的情況下。當反應完全時，移出未反應的組分并檢測結(jié)合復合物。例如，如果結(jié)合復 合物的形成被存在的檢測試劑抑制，那么可認為檢測試劑是抑制R0B02與SLIT之間結(jié)合的 候選的拮抗劑?；诩毎姆治龌蚧谀さ姆治鲆部捎糜阼b定R0B02抑制劑。在其它具體 實施方式中，通過檢測和/或測量R0B02基因的表達水平，可檢測出抑制R0B02基因表達的 R0B02抑制劑分子。可通過多種方法檢測和/測量R0B02基因表達，例如實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈反應（RT-PCR)，酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)，RNA印跡分析（Northernblotting)或流式 細胞術以及本領域普通技術人員已知的方法。
[0096] 這些被鑒定的R0B02抑制劑可采用慢性腎臟疾病的體內(nèi)動物模型進一步測試，例 如腎小球和間質(zhì)損傷模型（例如，狼瘡性腎炎的動物模型，包括新西蘭黑鼠（NZB)，（NZBX NZW)第一代雜交體（稱為NZB/W)，及其同類系衍生物，MRL/lpr和BXSB菌株），衰老動物模 型（例如，老年雄性遠交群大鼠和老年C57BL/6小鼠）；自發(fā)性高血壓大鼠（SHR)Buffalo/ mna大鼠，其是人類原發(fā)性腎病綜合征的模型；MunichWistarFromter(MWF)大鼠，其 為與先天性腎單元數(shù)目缺陷有關的遺傳模型，腎單元數(shù)目缺陷可使成人有發(fā)展為高血壓 和鹽敏感的傾向；原發(fā)性足細胞特異性遺傳性FSGS模型；HIV相關腎病轉(zhuǎn)基因小鼠模型； Alport綜合征動物模型，其包括IV型膠原（C0L4A3、C0L4A4和C0L4A5)的α3、α4或α5 鏈的突變體；免疫誘導模型，例如Thy-I腎炎模型，其為系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN)的 大鼠實驗模型，抗腎小球基底膜（GBM)模型；和非免疫誘導模型。
[0097] 關于R0B02抑制劑，在此使用的"選擇性結(jié)合"或"特異性結(jié)合"或"特異性于"是 指在此描述的R0B02抑制劑的能力，例如，R0B02拮抗劑抗體或其R0B02抗原結(jié)合片段，與 靶標如R0B02結(jié)合的Kd為KT5M(IOOOOnM)或更小，例如KT6M或更小，KT7M或更小，KT8M或 更小，KT9M或更小，KTkiM或更小，HT11M或更小，或KT12M或更小。例如，如果在此描述的 R0B02抑制劑/拮抗劑與R0B02結(jié)合的Kd為KT5M或更低，而不與相關分子如ROBO家族的 其它成員結(jié)合，則可以說該藥劑是可特異性結(jié)合R0B02。例如，特異性結(jié)合可受親和力和親 合性（affinityand的影響，例如R0B02抑制劑/拮抗劑抗體或其抗原結(jié)合片段和多肽試劑 的濃度。本領域普通技術人員可確定適當?shù)臈l件，在該條件下，在此描述的多肽試劑采用適 當?shù)姆椒ㄟx擇性地與靶標結(jié)合，例如在細胞結(jié)合分析中多肽試劑的滴定。
[0098] 關于通過抑制R0B02活性治療慢性腎臟疾病的方法，術語"慢性腎臟疾病"或CKD 是指腎臟疾病，其由于腎單位逐步缺失以及隨后的腎功能缺失，隨時間緩慢和逐步惡化的。 在開始階段可能沒有癥狀。功能喪失通常需要幾個月或幾年才會發(fā)生。可能是太緩慢以至 于直到腎功能不足正常的十分之一時癥狀才會出現(xiàn)。慢性腎臟疾病的最終階段稱為終末期 腎?。‥SRD)。在這個階段，腎臟不再能夠清除體內(nèi)足夠的廢物和多余的液體。患者需要透析 或腎臟移植。可引起糖尿病腎病的糖尿病和高血壓是慢性腎臟疾病的兩種最常見原因，并 占大多數(shù)。其它可損害腎臟并引起慢性腎臟疾病的疾病和狀態(tài)包括：自身免疫性紊亂（如 系統(tǒng)性紅斑狼瘡和硬皮?。?，腎臟先天缺陷（如多囊性腎?。承┯卸净瘜W物質(zhì)，腎小球性 腎炎，損傷或創(chuàng)傷，腎結(jié)石和感染，通向腎臟或腎臟中的動脈相關問題，一些止痛藥或其它 藥物（如抗癌藥物），返流性腎?。ㄆ渲心蛞耗媪髦聊I臟而損害腎臟），等等。在此使用的 "蛋白尿"是指尿液中存在過量的血清蛋白。在一些【具體實施方式】中，蛋白尿是腎臟疾病的 象征，但其本身并不是決定性的。
[0099] 因此，在在此所述的這些方面和所有這些方面的一些【具體實施方式】中，患有或具 有患慢性腎臟疾病風險的受治療者患有糖尿病腎病。
[0100] 在慢性腎臟疾病和蛋白尿的治療方法方面，在此描述的"減少"或"抑制"意思是對 于慢性腎臟疾病給定的參數(shù)或癥狀整體上降低的能力，所述"減少"或"抑制"是指優(yōu)選可整 體下降20 %或更多，30 %或更多，40 %或更多，45 %或更多，更優(yōu)選地50 %或更多，55 %或 更多，60%或更多，65%或更多，70%或更多，最優(yōu)選75%或更多，80%或更多，85%或更多， 90%或更多，或95%或更多。例如，減少或抑制可以是指被治療的疾病的癥狀，例如高血壓、 尿中的蛋白等。
[0101] 高血壓幾乎一直存在于慢性腎臟疾病的各個階段。神經(jīng)系統(tǒng)檢查可顯示神經(jīng)損傷 的跡象。在用聽診器聽的時候，醫(yī)療服務人員可能會聽到不正常的心臟或肺部聲音。慢性 腎臟疾病的早期癥狀也有其它疾病的癥狀。這些癥狀在病癥更進一步發(fā)展之前可能是腎臟 疾病的唯一跡象。慢性腎臟疾病的癥狀可包括：食欲不振，一般不適和疲勞，頭痛，癢（瘙 癢）和皮膚干燥，惡心，不嘗試減肥而體重減少，等等。特別是當腎功能惡化時，可發(fā)展的其 它癥狀包括：皮膚異常暗或亮；骨痛；腦和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；昏睡和困惑；集中或思考的問題； 手腳或其它部分麻木；肌肉抽搐或痙攣；口臭；易瘀傷，出血或便血；煩渴；經(jīng)常打嗝；性欲 低下和陽痿；月經(jīng)周期停止（閉經(jīng)）；氣息不足；睡眠問題，如失眠，不寧腿綜合征和阻塞性 睡眠呼吸暫停；手腳浮腫（水腫）；嘔吐，特別是在上午。
[0102] 因此，在此所述方法的一些【具體實施方式】中，有效量的含有在此描述的R0B02抑 制劑的組合物給予受治療者以減輕慢性腎臟疾病的癥狀。在此所用的"減輕慢性腎臟疾 病的癥狀"為改善與慢性腎臟疾病相關的任何狀態(tài)或癥狀。可選地，減輕慢性腎臟疾病可 包括，減少受治療者的一種或多種慢性腎臟疾病癥狀，相對于未處理的患有慢性腎臟疾病 的對照或相對于受治療者治療前。與相當?shù)奈刺幚韺φ障啾?，或與用R0B02抑制劑處理前 的受治療者相比，這些減少或預防程度為至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少 25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少 65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或更多，通過任何 標準技術測量。理想的是，采用本領域已知的任意標準方法檢測，慢性腎臟疾病顯著降低或 檢測不到，這種情況下認為慢性腎臟疾病得到了治療。正在接受治療慢性腎臟疾病的患者 是醫(yī)師已經(jīng)診斷為具有這種狀態(tài)的人。本領域普通技術人員已知的任何合適的方法均可用 于診斷。例如，診斷和監(jiān)控包括檢測尿液、血液或血清樣本中特異性蛋白質(zhì)或分子的水平， 例如白蛋白，鈣，膽固醇，全血計數(shù)（CBC)，電解質(zhì)，鎂，磷，鉀，鈉，或上述任意組合；例如檢 測分析肌酐清除率，肌酐水平，BUN(血尿素氮）；通過使用特異性的技術或程序，例如腹部 CT掃描、腹部MRI、腹部超音波、腎臟活組織切片、腎臟掃描、腎臟超音波；通過分析或測試 紅細胞生成素、甲狀旁腺素（PTH)的結(jié)果變化的檢測；骨密度檢測或維生素D;或其它這些 檢測方法和分析的任意組合。
[0103] 關于在此所述任一方法使用的術語"受治療者"和"個體"在此中可交換使用，并 且是指動物，如人類，是在此所述R0B02抑制劑的接受者。為了治療對特定動物如人類受治 療者特定的病態(tài)，術語"受治療者"是指特定的動物。術語"非人類動物"和"非人類哺乳動 物"在此中可交換使用，包括哺乳動物如大鼠、小鼠、兔子、羊、貓、狗、牛、豬和非人靈長類動 物。術語"受治療者"也包括任何脊椎動物，包括但不限于，哺乳動物、爬行動物、兩棲類動 物和魚。然而，有利的是，受治療者是哺乳動物如人類，或其它哺乳動物例如家養(yǎng)的哺乳動 物，如狗、貓、馬等等。
[0104] 在此描述的這些方法和所有這些方法的一些【具體實施方式】中，該方法進一步 包括，除R0B02抑制劑外，給予受治療者額外的治療劑。這種額外的治療劑可與R0B02 抑制劑共同給藥。如在此使用的短語"共同給藥（co-administering)"或"共同給予 (co-administer) "是將在此所述的R0B02抑制劑和另一種化合物如治療劑單獨地、同時地 和/或經(jīng)過一段由有資格的護理人員確定的時間連續(xù)地給藥。
[0105] 在一些這樣的【具體實施方式】中，額外的治療劑為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE)抑制 齊?，血管緊張素Π受體拮抗劑（ARB)或鹽皮質(zhì)激素受體（MR)拮抗劑。
[0106] 在此所述的與R0B02抑制劑使用的ACE抑制劑包括但不限于，貝那普利 (benazepril)(在美國以Lotensin? 銷售），卡托普利（captopril)(在美國以Capoten? 銷售），依那普利（enalapril) /依那普利拉（enalaprilat)(在美國以口服和注射 的Vasotec?銷售），福辛普利（fosinopril)(在美國以Monopril?銷售），賴諾普利 (Iisinopril)(在美國以Zestril?或Prinivil?銷售），莫西普利（moexipril)(在美國以 11]1；^38〇1￥銷售），培哚普利&61'；[11(1(^1'；[1)(在美國以406011 1￥銷售），喹那普利（911；[仙口1'；[1) (在美國以Accupril?銷售），雷米普利（ramipril)(在美國以Altace?銷售）和群多普利 (trandolapril)(在美國以Mavik?銷售）。與在此所述的R0B02抑制劑使用的ARB類包 括：坎地沙坦（candesartan)(在美國以ATACAND?銷售），厄貝沙坦（irbesartan)(在美國 以AVAPR0?銷售），奧美沙坦（olmesartan)(在美國以BENICAR?銷售），洛沙坦（Iosartan) (在美國以C0ZAAR?銷售），纈沙坦（valsartan)(在美國以DI0VAN?銷售），替米沙坦 (telmisartan)(在美國以MICARDIS?銷售），依普沙坦（印rosartan)(在美國以TEVETENtm 銷售）。
[0107] 在此所述這些方法和所有這些方法的一些【具體實施方式】中，該方法進一步包 括，除R0B02抑制劑外，給予受治療者有效量的利尿劑。利尿劑包括但不限于：托拉塞 米（torsemide)(在美國以DEMADEX?銷售），呋塞米（furosemide)(在美國以LASIX?銷 售），布美他尼（bumetanide)(在美國以BUMEX?銷售），依他尼酸（ethacrynicacid) (在美國以EDECRIN?銷售），托拉塞米（torsemide)(在美國以DEMADEX?銷售），阿米 洛利（amiIoride)(在美國以MIDAM0R?銷售），乙酰唑胺（acetazolamide)(在美國以 DIAM0X?銷售），帕馬溴（pamabrom)(在美國以AQUA-BAN?銷售），甘露醇（mannitol)(在 美國以ARID0L?或0SMITR0L?銷售），氨苯蝶啶（traimterene)(在美國以DYRENIUM?銷 售），螺內(nèi)酯（spironolactone)(在美國以ALDACT0NE?銷售），阿米洛利（amiIoride) (在美國以MIDAM0R?銷售），吲達帕胺（indapamide)(在美國L0Z0L?銷售），氫氯噻嗪 (hydrochlorothiazide)(在美國以HYDR0DIURIL? 銷售），美托拉宗（metolazone)(在美國 以ZAR0X0LYN? 或MYKR0X?銷售），甲氯噻嗪（methylclothiazide)(在美國以AQUATENSEN? 或ENDURONtm銷售），氫氯噻嗪（hydrocholorthiazide)(在美國以AQUAZIDEHtm或ESIDRIXtm 或MICR0ZIDE?銷售），氯噻嗪（chlorothiazide)(在美國以DIURILtm銷售），芐氟噻嗪 (bendrofIumethiazide)(在美國以NATURETIN? 銷售），泊利噻嗪（polythiazide)(在美國 以RENESE?銷售），氫氟甲噻嗪（hydroflumethiazide)(在美國以SALUR0N?銷售），氯噻酮 (chlorthalidone)(在美國以THALIT0NE?銷售）。為了獲得完整的列表，還參見例如《醫(yī)生 案頭參考》（Physician，sDeskReference)，2012 編著，PDR，Network，（2011)。
[0108] 如在此所用，關于在此所述包括R0B0-2抑制劑或其聯(lián)合治療的任意組合 物和方法，術語"治療（treat) "、"療法（treatment) "、"治療（treating) "或"改善 (amelioration) "是指治療方法，其中，目的是逆轉(zhuǎn)、減輕、改善、抑制、減慢或停止與疾病或 失調(diào)有關的狀態(tài)的進程或嚴重程度。術語"治療（treating)"包括減少或緩解與慢性腎臟 疾病有關的狀態(tài)、疾病或失調(diào)的至少一種不利的效果或癥狀，例如，但不限于，糖尿病腎病。 如果一種或多種臨床癥狀減少，治療通常是"有效的"?？蛇x地，如果疾病的進程被縮減或停 止，則治療是"有效的"。也就是說，"治療（treatment)"不只包括癥狀或標記的改善，也包 括中斷在預期沒有治療的情況下發(fā)生的至少緩慢進程或癥狀惡化。有益的或期望的臨床結(jié) 果包括，但不限于，一種或多種癥狀緩和，疾病程度減小，疾病狀態(tài)穩(wěn)定（即不惡化），疾病 進程的推遲或減慢，疾病狀態(tài)的改善或減輕，以及緩解（無論是部分或全部），無論是可檢 測的或不可檢測的。術語疾病的"治療（treatment)"還包括提供疾病的癥狀或副作用安慰 (包括緩和治療）。
[0109] 在此使用的術語"有效量"是指減輕至少一種或多種需要治療的疾病或失調(diào)的癥 狀所需要的在此所述R0B0-2抑制劑的量，并與為了提供期望的效果使用的足夠量的藥理 成分相關。因此，術語"治療有效量"是指在此描述的R0B0-2抑制劑的量，采用在此公開的 方法，當給予典型的受治療者時足以提供特殊效果。在此所用的有效量也包括足以推遲疾 病癥狀發(fā)展、改變疾病癥狀進程（例如，但不限于，減慢疾病癥狀進程）或逆轉(zhuǎn)疾病癥狀的 量。因此，不可能指定精確的"有效量"。然而，對于任何給定的情況，適當?shù)?有效量"可由 本領域普通技術人員僅僅通過常規(guī)實驗確定。
[0110] 有效量、毒性和治療效果可通過標準制藥程序在細胞培養(yǎng)和試驗用動物中確定， 例如，確定LD50(半數(shù)致死量）和ED50(半數(shù)有效量）。這些劑量可根據(jù)所采用的劑型和所 用給藥途徑而變化。毒性效應和治療效果的劑量比為治療指數(shù)，其可以用LD50/ED50的比 值表達。呈現(xiàn)大的治療指數(shù)的組合物和方法是優(yōu)選的。治療有效劑量最初可根據(jù)細胞培養(yǎng) 試驗分析估算。另外，劑量可以在動物模型中配制，以獲得包括在細胞培養(yǎng)或適當?shù)膭游锬?型中確定的IC50(即，獲得測量功能或活性的半數(shù)最大抑制的在此描述的R0B0-2抑制劑 的濃度）的循環(huán)血漿濃度范圍。例如，血漿中的水平可通過高效液相色譜法測量。任何具 體劑量的效果可以通過由合適的生物試驗監(jiān)控到。必要時，劑量可由醫(yī)師為適應治療的觀 察效果進行調(diào)整而確定。根據(jù)慢性腎臟疾病的類型和嚴重程度，在此描述的約1μg/kg至 100mg/kg(例如0.l-20mg/kg)的R0B0-2抑制劑的量是給予受治療者的最初候選劑量范圍， 例如，無論是一個或多個分開給藥或是連續(xù)輸注。 給藥模式
[0111] 在此所述R0B02抑制劑或其聯(lián)合治療可通過任意合適途徑給予受治療者，使受治 療者得到有效治療。如在此所用的術語"給予（administering)"和"采用（introducing)" 可交換使用，并且是指將R0B02抑制劑配置給受治療者，其通過可使這些藥劑至少部分定 位在期望位點的方法或途徑進行配置，以產(chǎn)生期望效果。
[0112] 在一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑通過任意給藥模式給予給患有慢性腎臟疾 病的受治療者，所述給藥模式可全身性遞送藥劑或?qū)⑺巹┻f送至所需表面或目標，并包括 但不限于，注射給藥、輸注給藥、滴注給藥和吸入給藥。為了保護多肽藥劑不在腸道中失活， 也可以考慮口服給藥形式。"注射"包括但不限于，靜脈內(nèi)注射、肌肉注射、動脈內(nèi)注射、鞘內(nèi) 注射、室內(nèi)注射、囊內(nèi)注射、眶內(nèi)注射、心內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)氣管注射、皮下 注射、表皮下注射、關節(jié)內(nèi)注射、子囊注射、蛛網(wǎng)膜下腔注射、椎管內(nèi)注射、內(nèi)腦脊髓注射以 及胸骨內(nèi)注射和灌輸。在一些【具體實施方式】中，用于在此所述方法的R0B02抑制劑是通過 靜脈灌輸或注射給藥的。
[0113] 在此所用短語"腸胃外給藥"和"非腸道給藥"是指與腸內(nèi)或局部給藥不同的給 藥模式，通常通過注射給藥。在此所用短語"全身用藥"、"全身給藥"、"全身地給予"和"外 周給藥"是指R0B0-2抑制劑的給藥而不是直接給予靶點、組織或器官，例如腫瘤部位，而是 R0B0-2抑制劑可進入受治療者的循環(huán)系統(tǒng)，并因此經(jīng)歷代謝和其它相似過程。
[0114] 對于在此所述方法的臨床使用，在此R0B0-2抑制劑的給藥包括配制成藥物組合 物或用于腸胃外給藥的藥物制劑，例如靜脈內(nèi)的，粘膜的如鼻內(nèi)的，眼睛的或其它給藥模 式。在一些【具體實施方式】中，在此描述的R0B0-2抑制劑可以連同任何藥學上可接受的載體 化合物、材料或組合物給藥，其可使受治療者得到有效治療。因此，在此所述方法使用的藥 物制劑可包含在此描述的R0B0-2抑制劑，與一種或多種藥學上可接受的成分的組合。
[0115] 短語"藥學上可接受的"是指那些化合物、材料、組合物和/或劑型，它們在合理的 醫(yī)學判斷范圍內(nèi)，適用于與人類或動物的組織接觸而沒有過多的毒性、刺激性、過敏反應或 其它問題或并發(fā)癥，具有相當?shù)牡睦?風險比。在此所用短語"藥學上可接受的載體"意 為藥學上可接受的材料、組合物或載體，如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑、媒介、封 裝材料、制造助料（如潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅或硬脂酸）或溶劑封裝材料，它 們參與維持R0B0-2抑制劑的穩(wěn)定性、溶解性或活性。每種載體必須是"可接受的"的意思 是與制劑中的其它成分相容并不會傷害病人?？勺鳛樗帉W上可接受的載體的材料的一些示 例包括：（1)糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；（2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纖維素及 其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素和醋酸纖維素；(4)黃 蓍膠粉末（powderedtragacanth) ; (5)麥芽糖；（6)明膠；（7)賦形劑，如可可油和栓狀錯 (suppositorywaxes) ; (8)油類,如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆 油；（9)二醇類，如丙二醇；（10)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇（PEG) ; (11)酯 類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；（12)瓊脂；（13)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；（14)海藻 酸；（15)無熱原水；（16)等滲鹽水；（17)林格氏溶液；（19)pH緩沖溶液；(20)多元酯、聚碳 酸酯和/或聚酸酐；(21)膨脹劑，如多肽和氨基酸；（22)血清成分，如血清白蛋白，高密度 脂蛋白（HDL)和低密度脂蛋白（LDL) ; (23)C2-C12的醇，如乙醇；以及（24)藥物制劑中使用 的其它無毒相容物質(zhì)。脫模劑、被膜劑、防腐劑和抗氧化劑也可用于該制劑。如"賦形劑"、 "載體"、"藥學上可接受的載體"或類似的術語在此中可交換使用。
[0116] 在此描述的R0B0-2抑制劑可專門制成用于以固體、液體或凝膠形式的化合物給 予受治療者，包括以下適用的形式：（1)腸胃外給藥，例如通過皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜 外注射如無菌溶液或懸浮液，或緩釋制劑；（2)局部給藥，如乳膏、油膏或控釋貼劑或應用 于皮膚的噴霧；（3)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，如陰道藥栓、乳膏或泡沫；（4)通過眼睛；（5)透皮； (6)粘膜；以及（7)鼻。此外，R0B0-2抑制劑可通過藥物遞送系統(tǒng)植入或注射給受治療者。 例如，可參見厄克特（Urquhart)等，《藥理學與毒理學年度回顧》（Ann.Rev.Pharmacol. Toxicol.) 24 :1984 :199-236 ;路易斯編輯，《農(nóng)藥和醫(yī)藥的控釋》（普雷納姆出版社，紐約， 1981);美國專利申請NO. 3773919,和美國專利申請NO. 353270960。
[0117] 可用于在此描述的方法的、包括在此描述的R0B0-2抑制劑的該組合物的制劑和 給藥模式的進一步的【具體實施方式】，描述如下。
[0118] 腸胃外劑型。R0B0-2抑制劑的腸胃外劑型也可通過多種涂徑給予患有慢件腎臟疾 病的受治療者，包括但不限于，皮下、靜脈內(nèi)（包括彈丸注射）、肌肉內(nèi)和動脈內(nèi)。由于腸胃 外劑型給藥一般繞過了受治療者對污染物的天然防御屏障，所以腸胃外劑型優(yōu)選無菌或能 夠在給藥于受治療者前滅菌。腸胃外劑型的示例包括但不限于，隨時可以注射的溶液，隨時 可以溶解或懸浮在藥學上可接受的載體中用于注射的干燥產(chǎn)品，隨時可以注射的懸浮液， 控釋腸胃外劑型以及乳劑。
[0119] 可用于提供公開的腸胃外劑型的合適的載體是本領域技術人員眾所周知的。示例 包括但不限于，無菌水；USP注射用水；鹽水；葡萄糖溶液；水性載體例如但不限于氯化鈉注 射液，林格注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化鈉注射液和乳酸鈉林格注射液；水混溶載 體，例如但不限于，乙醇，聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水溶性載體，例如但不限于，玉米油， 棉籽油，花生油，芝麻油，油酸乙酯，肉豆蘧酸異丙酯和苯甲酸芐酯。
[0120] 在一些【具體實施方式】中，含有有效量R0B0-2抑制劑的組合物可適合于口服給 藥，如離散劑型，例如，但不限于，片劑（包括但不限于刻痕片劑或包衣片劑），丸劑，囊片， 膠囊，咀嚼片，粉末包，扁囊劑，錠劑，糯米紙囊劑，噴霧劑，或液體例如但不限于，以水液 體、非水液體、水包油乳劑或油包水乳劑形式的糖漿劑、酏劑、溶液或懸浮液。這些組合物 含有預定量的所公開的化合物的藥學上可接受鹽，并可通過本領域技術人員公知的制造 方法制成。一般可參考，雷明頓制藥科學，第18版，麥出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州， 1990 (Remington'sPharmaceuticalSciences, 18thed. ,MackPublishing,Easton,Pa. (1990))。
[0121] 由于其易于給藥，使用固體藥物賦形劑的片劑和膠囊劑代表最有利的固體口服單 位制劑。如果需要，可通過標準的水或非水化技術將片劑包衣。這種劑型可通過任意制藥 方法制成。一般而言，藥物組合物和劑型這樣制得：將活性成分與液體載體、良好分散的固 體載體或兩者均勻地并充分地混合，然后如果需要的話，將產(chǎn)品成型為所需形式。在一些具 體實施方式中，口服劑型不適用于抗生素藥劑。
[0122] 含有有效量R0B02抑制劑的組合物的典型的口服劑型可根據(jù)傳統(tǒng)制藥復合技術 制成，將緊密混合物（intimateadmixture)中R0B02抑制劑的藥學上可接受的鹽與至少一 種賦形劑結(jié)合制成。賦形劑可根據(jù)給藥所需組合物的形式而采取各種各樣的形式。例如， 適用于口服液體或氣霧劑劑型的賦形劑包括，但不限于，水、二醇類、油類、醇類、調(diào)味劑、防 腐劑和著色劑。適用于固體口服劑型（例如散劑、片劑、膠囊劑和囊片）的賦形劑的示例包 括，但不限于，淀粉、糖、微晶纖維素、高嶺土、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑。
[0123] 適用于在此所述的藥物制劑的粘合劑包括，但不限于，玉米淀粉、土豆淀粉或其它 淀粉，明膠，天然或合成的樹膠例如阿拉伯樹膠，藻酸鈉，海藻酸，其它藻酸鹽，黃蓍膠粉末， 瓜爾膠，纖維素及其衍生物（如乙基纖維素、醋酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素 鈉），聚乙烯吡咯烷酮，甲基纖維素，預糊化淀粉，羥丙基甲基纖維素（如編號2208、2906、 2910)，微晶纖維素，以及上述混合物。
[0124] 適用于在此所述的藥物制劑的填充劑包括，但不限于，滑石，碳酸鈣（例如顆?；?粉末），微晶纖維素，粉末纖維素，葡萄糖結(jié)合劑，高嶺土，甘露醇，硅酸，山梨醇，淀粉，預糊 化淀粉，以及上述混合物。在此所述藥物組合物中的粘合劑或填充劑通常占藥物組合物重 量的約50%至約99%。
[0125] 用在在此的口服藥物制劑中的崩解劑是當片劑暴露于含水環(huán)境時，使其碎裂。既 不是太少也不是太多以致破壞性地改變活性成分釋放的有效量的崩解劑可用于形成在此 描述的R0B02抑制劑的固體口服劑型。所用崩解劑的量根據(jù)制劑的類型而不同，其是易被 本領域普通技術人員辨別?？捎糜谛纬煽诜幬镏苿┑谋澜鈩┌?，但不限于，瓊脂、海藻 酸、碳酸鈣、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、波拉克林鉀、羧基乙酸淀粉鈉、土 豆或木薯淀粉、其它淀粉、預糊化淀粉、黏土、其它藻膠、其它纖維素、樹膠，以及上述混合 物。
[0126] 可以用于形成在此描述的R0B02抑制劑的藥物制劑的潤滑劑包括，但不限于，硬 脂酸鈣，硬脂酸鎂，礦物油，輕礦物油，甘油，山梨醇，甘露醇，聚乙二醇，其它二醇，硬脂酸， 月桂基硫酸鈉，滑石，氫化植物油（如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大 豆油），硬脂酸鋅，油酸乙酯，月桂酸乙酯，瓊脂，以及上述混合物。其他的潤滑劑，包括，例 如，syloid硅膠（AEM)SILe 200,由馬里蘭州巴爾的摩的W.R.GraceCo.生產(chǎn)），合成二 氧化娃的凝聚型氣溶膠（由德克薩斯州普萊諾的DegussaCo.銷售），CAB-O-SI L :( - 種由馬薩諸塞州波士頓的CabotCo.銷售的熱解二氧化硅產(chǎn)品），以及上述混合物。如果使 用的話，潤滑劑通常以小于其所摻入的藥物組合物或劑型重量的約1 %的量使用。
[0127] 在其它【具體實施方式】提供了不含乳糖的藥物制劑和劑型，其中，這些組合物優(yōu)選 含有少量，如果有的話，乳糖或其它單糖或二糖。如在此所用的術語"不含乳糖"是指乳糖 的存在量，如果有的話，不足以實質(zhì)上增加活性成分的降解速率。在此公開的不含乳糖的組 合物可包含本領域公知的賦形劑，以及被引入在此作為參考的USP(XXI)/NF(XVI)所列舉 的賦形劑。
[0128] 在一些【具體實施方式】中，R0B02抑制劑的口服制劑進一步涵蓋含有以在此的 R0B02抑制劑為活性成分的無水藥物組合物和劑型，因為水可以促進某些化合物降解。 例如，為了確定制劑隨時間變化的性質(zhì)，如保質(zhì)期或穩(wěn)定性，加入水（例如5 % )作為一 種模擬長期貯存的方式在制藥領域是被廣泛接受的。參見例如延斯T.卡斯滕森（Jens Τ·Carstensen)，《藥物穩(wěn)定性：原則和實踐》（DrugStability:Principles&Practice): 379-380 (第二版，馬塞爾德克爾出版社（MarcelDekker)，紐約州紐約，1995) (2nd ed.,MarcelDekker，ΝΥ,Ν.Υ. :1995)。在此描述的無水藥物組合物和劑型可采用無水或低 水分材料在低水分或低濕度條件下制成。如果預計在生產(chǎn)、包裝和/或儲存期間會與水分 和/或濕氣發(fā)生大量接觸，那么包含乳糖和至少一種含有伯胺或仲胺的活性成分的藥物組 合物和劑型優(yōu)選是無水的。無水組合物優(yōu)選用已知可防止暴露于水的材料來包裝，因此可 將它們裝在合適的制劑盒中。合適的包裝的例子包括但不限于密封的薄膜、塑料、帶有干燥 劑或沒有干燥劑的單位劑量容器（如藥瓶）、水泡包裝和窄條包裝。
[0129] 氣溶膠劑型。R0B0-2抑制劑可與合適的推進劑一起裝在加壓氣溶膠容器中，推進 劑例如碳氫化合物推進劑，如丙烷、丁烷或異丁烷與常規(guī)助劑。R0B0-2抑制劑也可在非加壓 形式下如噴霧器或霧化器中給藥。R0B0-2抑制劑也可以干粉形式直接給予呼吸道，例如，通 過使用吸入器。
[0130] 通過舉例說明的方式，合適的粉末組合物包括R0B0-2抑制劑與乳糖或其它適于 支氣管給藥的惰性粉末充分混合的粉末制劑。粉末組合物可通過氣溶膠分配器給藥或裝在 易碎膠囊中，受治療者可以插入裝置，該裝置可刺穿膠囊并將粉末源源不斷吹出以適于吸 入。該組合物可能包括推進劑、表面活性劑和共溶劑，并裝入傳統(tǒng)氣溶膠容器中，其上有適 當?shù)挠嬃块y關閉。
[0131]遞送至呼吸道的氣溶膠是本領域已知的。參見例如阿杰伊，A.和格連J.，《藥學 與臨床研究》，1:565-569 (1990) (Adjei,A.andGarren,J.Pharm.Res.，1:565-569 (1990)); 扎嫩Ρ·和拉姆，J.-W·J.，《國際藥學雜志》，114:111-115(1995)(2&1^11，？.&11(11^臟，工-評· J.Int.J.Pharm.，114:111-115(1995));貢達I.，"用于遞送治療劑和診斷劑至呼吸道 的氣溶膠"在治療性藥物載體系統(tǒng)中的關鍵回顧，6:273-313 (Gonda，I·"AerosoIsfor deliveryoftherapeuticanddiagnosticagentstotherespiratorytract，〃in CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,6:273-313(1990))； 安德森等，《美國呼吸疾病評論》，140 :1317-1324 (1989)(Andersonetal.，Am.Rev. RespinDis.，140:1317-1324 (1989))并具有肽和蛋白質(zhì)全身遞送潛能（巴頓和普 拉茨，《高等藥物輸送評論》，8:179-196 (1992))(PattonandPlatz，AdvancedDrug DeliveryReviews, 8:179-196(1992));Timsina等，《國際藥學雜志》，101:1-13(1995)(Timsinaet.al.，Int.J.Pharm.，101:1-13 (1995));以及坦西I.P·，《噴霧技術市 場》，4:26-29 (1994) (Tansey，I.P·，SprayTechnol.Market, 4:26-29 (1994));弗倫奇 D.L.，愛德華D.A.和尼文R.W.，《氣溶膠科學與技術》，27:769-783(1996)$代11(*，0· L·，Edwards,D.A.andNiven,R.W·，AerosolSci. ,27:769-783 (1996));維薩J·，《粉體 工程》，58:1-10 (1989) (Visser，J·，PowderTechnology58:1-10(1989));路德S.和 R.H.穆勒，《控釋雜志》，22:163-172 (1992) (Rudt，S.andR.H.Muller,J.Controlled Release, 22:263-272(1992));塔巴達Υ·和Y.Ikada，《生物醫(yī)學材料研究雜志》， 22:837-858(1988)(Tabata,Y,andY.Ikada,Biomed.Mater.Res. , 22:837-858(1988))； 沃爾D.A.，《給藥雜志》，2:101-120,1995 (Wall,D.A.,DrugDelivery, 2:101-201995)); 巴頓和普拉茨，《先進藥物輸送評論》，8:179-196(1992)(?&?〇11，1 &11(1?1&七2，1^，八(^· DrugDel.Rev. ,8:179-196(1992));布里翁P.，《先進藥物輸送評論》，5:107-132(1990) (Bryon，P·，Adv.Drug.Del.Rev. ,5:107-132 (1990));巴頓J.S.,等，《控釋雜志》， 28:1579-1585 (1994)(Patton,J.S. ,etal. ,ControlledRelease,28:1579-85(1994))； 達蒙Β·和貝恩斯W.，《生物自然技術》（1996) (Damms,B·andBains,W.,Nature Biotechnology(1996));尼文R.W.等，《藥學與臨床研究》，12 (9) : 1343-1349 (1995) (Niven，R.W.，etal.，Pharm.Res.，12(9) ;1343-1349(1995));以及小林S.等，《藥學與臨 床研究》，13 (I) :80-83 (1996) (Kobayashi，S.，etal.，Pharm.Res.，13 (1) : 80-83 (1996))， 在此通過引入將其整體作為參考并入本文。
[0132] 在此所述R0B0-2抑制劑制劑進一步涵蓋包括以公開的化合物作為活性成分的無 水藥物組合物和劑型，因為水可以促進某些化合物降解。例如，為了確定制劑隨時間變化的 性質(zhì)，如保質(zhì)期或穩(wěn)定性，加入水（例如5%)作為一種模擬長期貯存的方式在制藥領域是 被廣泛接受的。參見例如延斯T.卡斯滕森（JensT.Carstensen)，《藥物穩(wěn)定性：原則和實 踐》（DrugStability:Principles&Practice) :379-380 頁（第二版，馬塞爾德克爾出版社 (MarcelDekker)，紐約州紐約，1995) (2nded.，MarcelDekker,NY,N.Y. : 1995)。在此描述 的無水藥物組合物和劑型可采用無水或低水分材料在低水分或低濕度條件下制成。如果預 計在生產(chǎn)、包裝和/或儲存期間會與水分和/或濕氣發(fā)生大量接觸，那么包含乳糖和至少一 種含有伯胺或仲胺的活性成分的藥物組合物和劑型優(yōu)選是無水的。無水組合物優(yōu)選用已知 可防止暴露于水的材料來包裝，因此可將它們裝在合適的制劑盒中。合適的包裝的例子包 括但不限于密封的薄膜、塑料、帶有干燥劑或沒有干燥劑的單位劑量容器（如藥瓶）、水泡 包裝和窄條包裝。
[0133] 控制釋放劑型和延遲釋放劑型。在在此所沭方面的一@【具體實施方式】中,R0B0-2 抑制劑可通過控制或延遲釋放的形式給予受治療者。理想地，在醫(yī)療中使用最優(yōu)設計的控 釋制劑的特征在于：采用最少藥物，在短時間內(nèi)治愈或控制病癥?？蒯屩苿┑膬?yōu)點包括： 1)延長藥物活性；2)降低給藥頻率；3)提高受治療者依從性；4)使用更少的總藥物；5)減 少局部或全身副作用；6)最小化藥物積累；7)減少血液水平波動；8)提高療效；9)減少增 強作用或藥物活性損失；以及10)改善的疾病或狀態(tài)的控制速度（吉姆，朱成，《控釋劑型 設計》（Technomic出版，蘭開斯特，賓夕法尼亞州，2000年））（Kim,Cherng-ju,Controlled ReleaseDosageFormDesign, 2(TechnomicPublishing,Lancaster,Pa. : 2000)) 〇 控釋制 劑可用于控制式（I)化合物的起始作用、作用持續(xù)時間、治療窗內(nèi)的血漿水平和峰值血液 水平。特別地，控制或延遲釋放劑型或制劑可用于保證實現(xiàn)式（I)化合物的最大效果，同時 最小化潛在的負面影響和安全隱患，這可以在從劑量下給藥的藥物（即，低于最小治療水 平）以及超過該藥物毒性水平時發(fā)生。
[0134] 各種已知的控制或延遲釋放劑型、制劑或裝置適于與在此所述R0B0-2抑制劑共 同使用。示例包括但不限于以下文件中描述的那些：美國專利號3, 845, 770、3, 916, 899、 3, 536, 809、3, 598, 123、4, 008, 719、5674, 533、5, 059, 595、5, 591，767、5, 120, 548、 5, 073, 543、5, 639, 476、5, 354, 556、5, 733, 566 和 6, 365, 185B1，每一個文件通過引入作為 參考將其整體并入本文。例如通過使用例如羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、凝膠、可 滲透性膜、等滲系統(tǒng)（例如OROS? (阿爾扎公司，山景城,加利福尼亞州，美國））、多層 包衣、微顆粒、脂質(zhì)體或微球體或其組合來產(chǎn)生不同比例的理想釋放效果，這些劑型可用于 緩釋或控釋一種或多種活性成分。另外，離子交換材料可用于制備所公開化合物的固定 化形式、吸附鹽形式，從而實現(xiàn)藥物的控制遞送。特異性的離子交換材料的示例包括但不 限于，Duolite?A568和Duolite?AP143 (羅門哈斯公司，春之樓，賓夕法尼亞州，美國） (Rohm&Haas,SpringHouse,Pa.USA)〇
[0135] 在在此所述方法的一些【具體實施方式】中，用于在此描述方法的R0B0-2抑制劑通 過持續(xù)釋放或脈沖形式給予受治療者。脈沖療法不是一種相同量組合物隨時間推移的不連 續(xù)給藥的形式，而是包括在降低頻率或降低給藥劑量時進行相同劑量組合物的給藥。當受 治療者持續(xù)發(fā)生失調(diào)時，持續(xù)釋放或脈沖給藥是特別優(yōu)選的，例如，當受治療者患有慢性腎 臟疾病。可以減少每個脈沖的劑量，并且在此所述給予的R0B0-2抑制劑的總量隨著受治療 者或患者治療過程中減至最小。
[0136] 必要時候，脈沖之間的間隔可由本領域普通技術人員確定。經(jīng)常地，脈沖間的間 隔一般可通過在下一脈沖遞送之前，受治療者體內(nèi)不再檢測到組合物或該組合物的活性組 分時，給予組合物的另一劑量計算。間隔也可根據(jù)組合物在體內(nèi)的半衰期計算。間隔可以 計算為大于體內(nèi)的半衰期，或2、3、4、5甚至10倍以上的該組合物的半衰期。美國專利號 4, 747, 825、4, 723, 958、4, 948, 592、4, 965, 251 和 5, 403, 590 公開了用于脈沖組合物通過輸 注或其它形式遞送至受治療者的多種方法和裝置。
[0137] 在一些【具體實施方式】中，可制備包含R0B0-2抑制劑的持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放 制劑的合適示例包括含有抑制劑的固體疏水性聚合物的半滲透基質(zhì)，其中基質(zhì)以成型制品 如膜或微膠囊存在。持續(xù)釋放基質(zhì)的示例包括聚酯、水凝膠（如聚（2-羥乙基-甲基丙烯 酸酯）或聚乙烯醇）、聚乳酸（美國專利號3, 773, 919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸（y ethyl-L-glutamate)共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物 如醋酸亮丙瑞林（LUPRONDEPOT)(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微 球）以及聚_D_ (-)-3-輕基丁酸。
[0138] 用于體內(nèi)給藥的含有R0B0-2抑制劑的制劑優(yōu)選是無菌的。例如，采用無菌過濾膜 過濾或其它本領域技術人員已知的方法可輕易實現(xiàn)無菌。
[0139] 在此一些方面還提供了分析方法、方法和系統(tǒng)，其依照指示慢性腎臟疾病的生物 標志物或慢性腎臟疾病或蛋白尿的預傾向，基于R0B02的表達譜或序列信息，確定個體是 否具有慢性腎臟疾病或慢性腎臟疾病或蛋白尿的預傾向。如在此所示，R0B02作為生物標 志物對鑒定受治療者是否患有慢性腎臟疾病或是否具有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的高 風險，或監(jiān)控慢性腎臟疾病或蛋白尿進程的治療效果是有用的。
[0140] 如在此所用的"生物標志物"是指一種有機生物分子，其區(qū)別地存在于樣品中使一 種表型狀態(tài)（phenotypicstatus)受治療者（例如患有一種疾?。┡c另一種表型狀態(tài)受治 療者（例如沒有患?。﹨^(qū)分開。如果計算得到的不同群組中的生物標志物的平均或中位表 達水平具有統(tǒng)計顯著性，則生物標志物區(qū)別存在于不同表型狀態(tài)中。統(tǒng)計顯著性一般檢驗， 除其它外還包括，檢驗、方差分析（ANOVA)、Kruskal_Wallis秩和檢驗、Wilcoxon秩和檢 驗、曼-惠特尼U檢驗和機率比。生物標志物，單獨或組合，提供受治療者屬于一種表型狀 態(tài)或另一種的相對風險的測量。照這樣，它們作為標志物對疾?。ㄔ\斷）、藥物和藥物毒性 的治療效果（診療）是有用的。
[0141] 用于在此所述分析方法的R0B02表達可由任何合適方法檢測，包括蛋白質(zhì)水平檢 測或mRNA表達水平檢測。R0B02多肽可以以任何可從受治療者獲得的生物樣本中找到的 形式檢測，或者任何操縱生物樣本引起的形式（例如樣本處理引起的）。R0B02修飾形式 可包括如下方式獲得的產(chǎn)品：等位基因變異體、剪接變異體、翻譯后修飾（例如糖基化、溶 蛋白質(zhì)水解裂解（如母本蛋白質(zhì)片段）、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、半胱氨酰化 (cysteinylation)、磺化、乙?；鹊龋⒌途鄯磻?、解低聚反應（以使單體從蛋白質(zhì)多聚體 形式中分離）、變性作用等等。
[0142] 設計的在此所述分析方法用以檢測R0B02的所有形式或特殊形式。在需要時，不 同形式R0B02之間進行區(qū)分，例如不同亞型，可通過使用基于區(qū)分不同形式的物理特性的 檢測方法完成，物理特性例如，不同分子量、不同分子大小、存在/不存在不同表位等等。
[0143] 因此，在此一些方面提供了用于診斷受治療者患有慢性腎臟疾病或具有患有慢性 腎臟疾病或蛋白尿風險的分析方法，該分析方法包括：測量從受治療者獲得的生物樣本中 R0B02蛋白質(zhì)或核酸水平，其中，如果從受治療者取得的生物樣本中R0B02的水平等于或高 于（例如統(tǒng)計量上明顯高于）R0B02閾值參考水平，受治療者極有可能具患慢性腎臟疾病或 蛋白尿的風險，或具有慢性腎臟疾病。例如，R0B02水平增加大于約10%，或大于約20%， 或大于約30 %，或大于約40 %，或大于約50 %，或大于約60 %，或更多，與R0B02閾值參考 水平相比。在一些【具體實施方式】中，R0B02水平的增加高于中值或平均R0B02閾值參考水 平至少一個標準偏差或至少兩個標準偏差，或更多。例如，所述中值或平均R0B02閾值參考 水平可從5個或更多個沒有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的受治療者取得的樣本、或5個或 更多個從相同受治療者在不同時間點取得的樣本中獲得。
[0144] 在這些分析方法的一些【具體實施方式】中，將生物樣本中測得的R0B02的量與參考 閾值水平或參考生物樣本進行相比，參考生物樣本例如從年齡匹配的正常對照（例如不具 有患有慢性腎臟疾病或蛋白尿風險的年齡匹配的受治療者）得到的生物樣本，或健康的受 治療者，例如健康個體。
[0145] 在的一些【具體實施方式】中，在此公開的分析方法、系統(tǒng)和試劑盒可也可用于監(jiān)測 給予受治療者的治療進程。例如，可以測量受治療者的生物樣本中第一時間點（如tl)的 R0B02的水平，并與R0B02生物標志物參考閾值水平相比，如果測得的R0B02水平等于或高 于參考閾值水平，可以給予受治療者合適的治療性療法或養(yǎng)生法，以延遲或降低慢性腎臟 疾病或蛋白尿的發(fā)生，例如，如在此公開方法的增加鍛煉，降低心臟壓力，調(diào)整飲食等等，然 后，R0B02的生物標志物蛋白質(zhì)面板水平可在第二時間點（如t2)和隨后時間點（如t3、t4、t5等等）測得，并與一個或多個時間點（如tl或任何隨后時間點）的tR0B02水平或 R0B02的參考閾值水平相比，以確定治療性治療或藥物治療或養(yǎng)生法對于降低慢性腎臟疾 病或蛋白尿風險、延遲或減少慢性腎臟疾病或蛋白尿發(fā)生的是否有效。在一些這樣的具體 實施方式中，在此公開的分析方法、系統(tǒng)或試劑盒可能用于監(jiān)測有癥狀的受治療者（例如， 已知患有慢性腎臟疾病或蛋白尿的受治療者）的治療性治療，這里有效的治療是可以減少 受治療者的R0B02,可選擇地，在此公開的分析方法、系統(tǒng)或試劑盒可能用于監(jiān)測有癥狀的 受治療者的預防性治療（例如，用于預防受治療者慢性腎臟疾病或蛋白尿的發(fā)生）效果，例 如，根據(jù)在此公開的方法，或其它本領域已知的方法或因為遺傳原因，已經(jīng)鑒定這里的受治 療者具有患慢性腎臟疾病或蛋白尿的風險。
[0146] 在此使用的術語"樣本" 一般是指含有核酸、DNA或RNA，或氨基酸的任何材料。一 般而言,這樣的材料會以下面的形式存在：血液樣本、大便樣本、組織樣本、細胞、細菌、組織 切片或口腔抹試。樣本是可以被制備的，例如樣本可以是新鮮的、固定的、冷凍的或嵌入石 蠟中。在此使用的術語"生物樣本"是指從受治療者取得的細胞或細胞群或一些組織或液 體。最經(jīng)常的是，樣本可以脫離受治療者，但術語"生物樣本"也可是指體內(nèi)分析的細胞或 組織，即不需要脫離受治療者。經(jīng)常地，"生物樣本"含有來自動物的細胞，但該術語也可是 指非細胞生物材料，例如血液、唾液或尿液中的非細胞組分，其可用于測量基因表達水平。 生物樣本包括但不限于，活組織切片、刮片（scrapes)、全血、血漿、血清、尿液、唾液、細胞培 養(yǎng)或腦脊液。生物樣本還包括活組織切片、細胞培養(yǎng)液。生物樣本或組織樣本可以是指脫 離個體的組織或液體樣本，例如包括但不限于，尿液、血液、血漿、血清、腎臟活組織切片、大 便、痰液、脊髓液、胸膜液、乳頭吸出物（nippleaspirates)、淋巴液、皮膚外部、呼吸道、腸 道和泌尿生殖道、淚水、唾液、奶、細胞（包括但不限于血細胞）、腫瘤、器官以及體外細胞培 養(yǎng)物組分的樣本。在一些【具體實施方式】中，當獲得尿液樣本時，離心尿液樣本以沉淀任何腎 臟細胞，基于此可進行在此所述的分析方法和方法。在一些【具體實施方式】中，樣本來自腎臟 活組織切片，例如腎臟或其部分的芯針活組織切片，例如足細胞樣本。另外，使用細針抽吸 樣本。在一些【具體實施方式】中，生物樣本是可以制備的，例如生物樣本可以是新鮮的、固定 的、冷凍的或嵌入石蠟中。可通過將細胞樣本脫離受治療者而得到樣本，但也可以通過使用 預先分離的細胞（例如，由另一人分離）來完成，或在此描述的體內(nèi)的方法。
[0147] 如在此使用的術語"表達"可交換地是指多肽或蛋白質(zhì)的表達或多核苷酸的表達 或基因的表達。表達也指預轉(zhuǎn)譯修飾蛋白的表達和翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的表達，以及前體 mRNA分子，或者剪接或成熟的mRNA分子的表達。例如，多核苷酸的表達可通過測量RNA轉(zhuǎn) 錄分子的產(chǎn)生來確定，如信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄水平。例如，蛋白質(zhì)或多肽的表達可采用與多 肽結(jié)合的抗體通過免疫分析確定。應用于多核苷酸的術語"編碼"是指一種可以"編碼"多 肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸，如果以其天然狀態(tài)或當采用本領域技術人員公知的的方法進行操 作時，它可以被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生可以被翻譯成氨基酸序列而生成多肽和/或其片段的RNA。反義 鏈是這些核酸的補體，由此可推導出編碼序列。術語"內(nèi)源性地表達"或"內(nèi)源性表達"是 指基因產(chǎn)物在正常水平和在正常調(diào)節(jié)該細胞類型中的表達。
[0148] 可以用于在此所述分析方法、方法和系統(tǒng)的用于測量樣本或生物樣本中R0B02蛋 白質(zhì)或核酸水平的檢測方法，包括光學方法，電化學方法（伏安法和電流分析技術），原子 力顯微鏡技術和射頻方法，例如多級共振光譜。光學方法包括顯微鏡檢查，包括共焦和非共 焦兩者，熒光檢測，發(fā)冷光，化學發(fā)光，吸光度，反射比，透射比，雙折射或折射率（例如表面 等離子體共振，橢圓測量術，共振鏡法，光柵耦合器波導法或干涉量度法）。
[0149] 在此所述分析方法、方法和系統(tǒng)的這些【具體實施方式】中，其中，R0B02蛋白質(zhì)水平 是可以測量的，例如，SEQIDNO: 1或SEQIDN0:3的蛋白質(zhì)水平，人們可以使用任何本領 域普通技術人員公知的蛋白質(zhì)組學方法來測量生物樣本中生物標志物蛋白的水平。測量 可以是定量的或定性的，只要測量能夠確定或指示生物樣本中R0B02蛋白質(zhì)的水平是否等 于、高于或低于R0B02蛋白的參考閾值水平。
[0150] 在一些【具體實施方式】中，測得的R0B02蛋白質(zhì)水平可以是測定R0B02蛋白質(zhì)本身 數(shù)量的R0B02蛋白質(zhì)水平的初始測量，例如，通過測量樣本中R0B02蛋白質(zhì)分子數(shù)量），或者 在一些【具體實施方式】中，它可以是R0B02蛋白質(zhì)二級測量（從該測量可以，但不必然，推導 出R0B02蛋白質(zhì)的數(shù)量，例如功能活性的測量或核酸的測量，如編碼R0B02蛋白質(zhì)的mRNA)。 可從初始測量導出或得到定性數(shù)據(jù)。
[0151] 在此所述分析方法和方法的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白質(zhì)水平可采用基于 親和力的測量技術測得。與抗體相關的"親和力"是本領域很好理解的術語，且意思是抗 體與結(jié)合伴侶結(jié)合的程度或強度，結(jié)合伴侶例如在此所述的生物標志物（或其抗原決定部 位）。親和力可通過本領域已知的多種方法測量和/或表達，包括但不限于，平衡解離常數(shù) (Kd或Kd)，表觀平衡解離常數(shù)（Kd或Kd)，以及IC5tl (競爭分析方法中實現(xiàn)50 %抑制的所需 量，與在此的"150"可交換使用）?？梢岳斫獾氖?，基于本發(fā)明的目的，親和力是結(jié)合至表位 的給定數(shù)量的抗體的平均親和力。
[0152] 基于親和力的測量技術利用特異性結(jié)合至測量中的生物標志物蛋白質(zhì)（一種"親 和試劑"，例如抗體或適體）的分子，雖然也可使用其它技術，如基于光譜的技術（例如基質(zhì) 輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法，MALDI-T0F光譜），或測量生物活性的分析方法（例如 測量生長因子絲裂原活性的分析方法）。用于在此所述分析方法和方法的基于親和力的測 量技術可包括基于抗體的分析方法（免疫分析法）和利用適體（與其它分子特異性結(jié)合的 核酸分子）的分析方法，例如酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗（ELONA)。此外，利用抗體和適體兩 者的分析方法預期也是可以的（例如利用抗體捕獲和適體檢測的夾心格式分析）。各種各 樣基于親和力的試驗也是本領域公知的。
[0153] 基于親和力的分析方法使用至少一種源于生物標志物蛋白質(zhì)的表位，即R0B02,且 多種基于親和力的分析方法的格式使用一種以上的表位（即"夾心"格式分析方法涉及兩 種或多種表位；至少一種表位用于捕獲生物標志物蛋白質(zhì)，和至少一種不同表位用于檢測 標志物）。
[0154] 基于親和力的分析方法可以是競爭或直接反應格式，使用夾心型格式，且可進一 步是多相的（如利用固體支持物）或同質(zhì)的（如在單相中發(fā)生），和/或使用免疫沉淀反 應。多種分析方法包括使用標記親和試劑（例如抗體、多肽或適體）；該標簽可以是，例如， 酶的、熒光的、化學發(fā)光的、放射性的或染料分子。放大探針信號的分析方法也是已知的，這 些分析方法的示例為利用生物素和抗生物素蛋白的分析方法，以及酶標記和介導的免疫分 析方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定方法（ELISA)和ELONA分析方法。例如，生物液體樣本的生 物標記物濃度可由LUM[NEX?分析方法或ELISA測量。生物標志物或特異性于生物標 志物的試劑可附于表面，并可直接或間接測量水平。
[0155] 在在此所述分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白質(zhì)水平可采 用基于親和力的免疫分析測定技術測量。
[0156] 免疫分析技術可包括任何定性或定量測量生物樣本中R0B02蛋白質(zhì)水平的免疫 分析技術。合適的免疫分析技術包括但不限于，放射免疫檢定法，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分 析），"夾心"免疫分析法，免疫放射測定法，免疫擴散分析法，原位免疫分析法（例如采用膠 體金、酶或放射性同位素標記），Western印跡分析，免疫沉淀反應法，免疫突光分析法，免 疫電泳分析法，熒光免疫分析（FIA)，免疫放射測定法（IRM)，免疫酶測定法（IEM)，免疫 發(fā)光測定法以及免疫熒光測定法（MadersbacherS.，伯杰P.，《抗體與免疫確定法》，方法， 21:41-50,2000 年）（MadersbacherS,BergerP.Antibodiesandimmunoassays.Methods 2000 ;21:41-50)，化學發(fā)光法，免疫-PCR技術和Western印跡分析。同樣地，可定性或定量 測量生物樣本中生物標志物水平的基于適體的分析方法可用于在此所述的分析方法、方法 和系統(tǒng)中。通常，在免疫分析幾乎所有格式中，抗體可代替適體，盡管適體允許額外的分析 方法格式（例如采用核酸放大技術如PCR(美國專利號4, 683, 202)的結(jié)合適體的放大）或 與合成引物的等溫放大（美國專利號6, 251，639和6, 692, 918)。
[0157] 在此所述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白水平可采用 基于親和力的免疫分析技術進行測量，免疫分析法可通過測量生物標志物/抗體相互作用 的蛋白質(zhì)/抗體相互作用程度完成?？墒褂萌魏我阎拿庖叻治龇椒?。
[0158] 在一些【具體實施方式】中，結(jié)合伴侶，如在結(jié)合分析方法中結(jié)合至R0B02蛋白的抗 體或配體，優(yōu)選標記的特異性結(jié)合伴侶，但不一定是抗體。結(jié)合伴侶通常標記本身，但可替 換地，其可通過產(chǎn)生信號的二次反應而被檢測到，信號例如是從另一標記的物質(zhì)產(chǎn)生的。
[0159] 因此，特異性結(jié)合至R0B02蛋白的抗體可用于在此的分析方法、方法和系統(tǒng)中，用 于確定生物樣本中R0B02蛋白的存在和/或其量，其可用于檢測診斷樣本中存在的R0B02 蛋白濃度的增加或降低。這樣的抗體可通過任何免疫診斷領域熟知的方法找到。抗體可以 是蛋白質(zhì)生物學相關狀態(tài)的任何抗R0B02蛋白抗體。因此，例如，它們可以針對R0B02蛋白 的以糖基化形式存在于人體中的非糖基化形式而被找到，或針對攜帶R0B02蛋白相關表位 的縮氨酸。
[0160] 在此的這些分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，可使用放大的分析方 法格式，由此檢測的相對低的蛋白質(zhì)水平的可產(chǎn)生增強的"信號"。放大的免疫分析法的 一種具體格式是增強的化學發(fā)光法。例如，抗體用辣根過氧化物酶標記，參與與魯米諾、過 氧化物底物和增強發(fā)射光強度和持續(xù)時間的化合物的化學發(fā)光反應，特別是4-碘苯酚或 4_輕基肉桂酸。
[0161] 在此的這些分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，可使用包括免 疫-PCR的放大的免疫分析法。在這個技術中，抗體與任意含有PCR引物的DNA分子共 價連接，由此，連接有抗體的DNA用聚合酶鏈反應進行放大。參見E.R.亨德里克森等， 《核酸研究》，23:522-529 (1995) (E.R.Hendricksonetal·，NucleicAcidsResearch 23:522-529(1995))〇
[0162] 因此，在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的所有【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水 平可采用蛋白結(jié)合劑確定，在此也可稱為"蛋白質(zhì)結(jié)合實體"或"親和試劑"，具體來說，是抗 體。例如，具體來說是抗體如抗-生物標志物抗體的親和試劑可用于免疫分析法中，特別是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析法）。在【具體實施方式】中，生物標志物蛋白的水平可在生物樣本 中采用本領域公知的方法測量，例如包括但不限于，同種型蛋白質(zhì)的同種型特異性化學或 酶分解，免疫印跡法，免疫組織化學分析，ELISA以及質(zhì)譜分析法。
[0163] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平可 采用"酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA)"測量。ELISA是一種采用標記（如酶聯(lián)）形式的抗 體檢測和測量抗原濃度的技術。本領域技術人員公知的ELISA有不同形式。以下文獻中 描述了本領域已知的ELISA標準技術：《免疫診斷方法》，第二版，羅斯和比格茨編輯，約翰 威利 & 傘斯，1980(MethodsinImmunodiagnosis^, 2ndEdition,RoseandBigazzi,eds. JohnWiley&Sons,1980);坎貝爾等，《方法與免疫學》，W.A.本杰明公司，1964(Campbell etal.，''MethodsandImmunology^,ff.A.Benjamin,Inc. , 1964);和OellerichM. 1984, 《臨床化學和臨床生物化 #》，22:895-904(〇Θ--ΘΓ?(Λ，Ε1984，?α?η·α?ΘΠ?·α?η· Biochem.，22:895-904.)。
[0164] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平可采 用夾心ELISA分析方法測量。"夾心ELISA"中，抗體（例如抗-酶）連接至固相（即微量 滴定板），并暴露在含有抗原（例如酶）的生物樣本中。然后清洗固相以除去未結(jié)合的抗 原。隨后標記的抗體（例如酶聯(lián)）結(jié)合至結(jié)合抗原（如果存在）以形成抗體-抗原-抗體 的夾心。因此，采用這種方法，R0B02的第一抗體與例如塑料微量滴定板的孔的固相結(jié)合， 并與樣本一起培養(yǎng)，分析R0B02蛋白特異性的標記第二抗體。與抗體連接的酶的示例為堿 性磷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光素酶，脲酶和β-半乳糖苷酶。連接抗體的酶與底物反應， 生成可以測量的有色反應產(chǎn)物。
[0165] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平采用 抗體捕獲分析方法或競爭ELISA測量。在"競爭ELISA"中，抗體與含有抗原（即酶）的樣 本一起培養(yǎng)。然后抗原-抗體混合物與覆蓋抗原（即酶）的固相（例如微量滴定板）接 觸。樣本中存在的抗原越多，可用于與固相結(jié)合的自由抗體就越少。然后將標記的（例如 酶聯(lián)）第二抗體加至固相中，以確定與固相結(jié)合的初始抗體的量。因此，在一些這樣的具體 實施方式中，生物測試樣本可以與固相結(jié)合，并且可添加抗R0B02蛋白抗體（例如與R0B02 特異性結(jié)合的抗體）并使其結(jié)合。清洗未結(jié)合材料后，與固相結(jié)合的抗體的量可采用與第 一抗體相反的標記的第二抗體確定。
[0166] 在這些分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，標記物優(yōu)選酶。例如，酶的 底物可為顯色的、熒光的或化學發(fā)光的。
[0167] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平可采 用免疫組織化學法測量。在"免疫組織化學法"中，通過將組織暴露在被檢測蛋白特異性的 抗體中，將組織切片用于測試特異性蛋白。然后，通過多種方法中的任一種將抗體可視化， 以確定蛋白的存在和存在蛋白的量。用于可視化抗體的方法的示例，例如，通過將連接至抗 體的酶（例如熒光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或β_半乳糖苷酶），或化學方法（例 如DAB/底物發(fā)色體）。然后將樣本經(jīng)顯微鏡分析，優(yōu)選采用光學顯微鏡分析被可在可見光 譜中檢測的著色劑染色的樣本，采用本領域技術人員已知的多種染色方法和試劑中的任一 種方法。
[0168] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平可采 用放射免疫檢定法測量。放射免疫檢定法是一種采用抗原的標記（如放射性或熒光性標 記）形式檢測和測量抗原即R0B02濃度的技術?？乖姆派湫詷擞浳锏氖纠?H、14C 和1251。生物樣本中R0B02的濃度通過將生物樣本中的R0B02與標記（例如放射性）的 R0B02競爭地與R0B02抗體結(jié)合。為了保證標記的R0B02和未標記的R0B02之間的競爭性 結(jié)合，標記的R0B02存在的濃度足以使抗體的結(jié)合位點飽和。樣本中R0B02濃度越高，結(jié)合 至抗體的標記的R0B02的濃度越低。
[0169] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平可采 用免疫放射測定法（IRMA)測量。IRM是一種免疫分析方法，其中，抗體試劑被放射性地標 記。IRMA需要多價抗原綴合產(chǎn)物，采用技術與蛋白質(zhì)綴合，所述蛋白質(zhì)例如兔血清白蛋白 (RSA)。多價抗原綴合物的每個分子必須具有至少2個抗原殘基，并且抗原殘基必須有足夠 的分開距離，以使至少2個抗體結(jié)合至抗原。例如，在IRM中，多價抗原綴合物可與固體表 面如塑料球相連。與放射性標記的抗原結(jié)合的未標記的抗原和抗體"樣本"被加至含有多價 抗原綴合物覆蓋的球的試管中。樣本中的抗原與多價抗原綴合物競爭抗原抗體結(jié)合位點。 適當?shù)臐摲诤?，清洗掉未結(jié)合的反應物，并確定固體球表面的放射性量。結(jié)合的放射性抗 體的量與樣本中抗原的濃度成反比。
[0170] 其它用于檢測生物樣本中R0B02蛋白水平的技術可依據(jù)醫(yī)生喜好進行，并根 據(jù)在此的公開內(nèi)容和生物樣本種類（即，血漿、尿液、組織樣本等）進行。Western印 跡（托賓等，《美國國家科學院學報》，76:4350 (1979))(Towbinetat.，Proc.Nat.Acad. Sci. 76:4350(1979))是這種技術中的一種，其中，適當處理的樣本在SDS-PAGE凝膠中運 行，之后轉(zhuǎn)移至固體支持物載體上，如硝化纖維濾器?？蓹z測地標記的抗R0B02抗體或蛋白 結(jié)合分子用于評定R0B02蛋白水平，可檢測標記物的信號強度與R0B02蛋白的量對應。存 在的R0B02蛋白的量的水平也可被量化，例如通過光密度測定法。
[0171] 在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白的水平可采 用質(zhì)譜分析法如MALDI/T0F(飛行時間），SELDI/T0F，液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用（LC-MS)，氣相 色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用（GC-MS)，高效液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用（HPLC-MS)，毛細管電泳-質(zhì)譜法 聯(lián)用，核磁共振譜或串聯(lián)質(zhì)譜（例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等）測量。參見例如美國 專利申請?zhí)?0030199001、20030134304、20030077616,通過引用將其整體并入本文中。
[0172] 在一些這樣的【具體實施方式】中，這些方法可與機器、計算機系統(tǒng)和媒體結(jié)合，以 產(chǎn)生用于測量和分析生物樣本中R0B02蛋白水平的自動化系統(tǒng)，并產(chǎn)生識別生物樣本中 R0B02蛋白的水平的可打印報告。在一些實例中，R0B02水平的測量是通過確定模塊和比較 模塊遠程完成的。
[0173] 質(zhì)譜法是本領域眾所周知的，并用于定量和/或鑒定生物分子，例如蛋白質(zhì)（參見 例如，Li等（2000)，Tibtech，18 :151-160;Rowley等（2000)，方法，20:383-397JPKuster 和Mann(1998)，《結(jié)構生物學當代進展》，8:393-400) (see,e.g·，Lietal. (2000)Tibtech 18:151-160；Rowleyetal. (2000)Methods20:383-397；andKusterandMann(1998) Curr.Opin.StructuralBiol. 8:393-400)。此外，質(zhì)譜技術已經(jīng)發(fā)展至能夠?qū)Ψ蛛x蛋白質(zhì) 的至少部分的從頭測序。Chait等，《科學》，262:89-92 (1993) ;Keough等，《美國科學院院 刊》，96:7131-6(1999)(Chaitetal.,Science262:89-92(1993);Keoughetal.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 96:7131-6 (1999));Bergman評論，EXS88:133-44(2000)(reviewed inBergman,EXS88:133-44(2000))。
[0174] 在某些【具體實施方式】中使用氣相離子分光光度法。在其它【具體實施方式】中，采用 激光解吸/電離質(zhì)譜分析樣本。現(xiàn)代激光解吸/電離質(zhì)譜（"LDI-MS"）可以以兩種主要變型 實施：基質(zhì)輔助激光解吸/電離（"MALDI"）質(zhì)譜和表面增強激光解吸/電離（"SELDI")。 在MLDI中，分析物與含有基質(zhì)的溶液混合，并將一滴液體放在底物表面。然后將基質(zhì)溶液 與生物分子共結(jié)晶。將底物放入質(zhì)譜儀中。激光能直接作用于底物表面，在此吸收和電離 生物分子，沒有將其明顯分散。參見例如，美國專利號5, 118, 937 (Hillenkamp等）和美國 專利號5, 045, 694(Beavis&Chait)，通過引用將其整體并入本文中。
[0175] 在SELDI中，修飾底物表面以使其成為解吸過程的積極參與者。一種變體的表面 用吸附劑和/或捕獲試劑衍生化以使其選擇性地結(jié)合至感興趣的蛋白。另一種變體的表面 用能量吸收分子衍生化，當用激光照射時，能量吸收分子不被吸收。另一種變體的表面用結(jié) 合有感興趣蛋白和含有激光應用時斷裂的光解鍵的分子進行衍生化。在這些方法的每一種 方法中，衍生劑定一般位于底物表面的特異性位置，其上施加樣本。參見例如美國專利號 5, 719, 060和WO98/59361，通過引用將其整體并入本文中。例如，這兩種方法可以組合，通 過使用SELDI親和表面來捕獲分析物，以及將含有基質(zhì)的液體加入捕獲的分析物中以得到 能量吸收材料。
[0176] 關于質(zhì)譜的更多信息，參見例如《儀器分離原理（第3版）》，Skoog，桑德斯學 院出版，費城，1985;和《化學技術柯克奧斯莫默百科全書（第4版）》，第15卷（John Wiley&Sons，紐約，1995)，第 1071-1094 頁（PrinciplesofInstrumentalAnalysis, 3rd edition. ,Skoog,SaundersCollegePublishing,Philadelphia, 1985；andKirk-Othmer EncyclopediaofChemicalTechnology, 4thed.Vol. 15(Johnffiley&Sons,NewYork 1995)，pp. 1071-1094)。
[0177] R0B02蛋白水平的檢測通常取決于信號強度的檢測。反過來，這可以反映出結(jié)合 至底物的多肽的數(shù)量和特征。例如，在某些【具體實施方式】中，比較第一樣本和第二樣本的 光譜中峰值的信號強度（例如視覺上地、通過計算機分析等），以確定具體生物分子的相對 量?？墒褂密浖绦?，例如生物標記向?qū)С绦颍ㄙ惛ゼ锵到y(tǒng)公司，弗里蒙特，加利福尼 亞州），幫助分析質(zhì)譜圖。質(zhì)譜儀及其相關技術是本領域技術人員是熟知的。
[0178] 在在此所述分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白水平可采用 凝膠電泳技術測量，具體為SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳），特別是二維 PAGE(2D-PAGE)，優(yōu)選二維SDS-PAGE(2D-SDS-PAGE)。根據(jù)具體實施例，該分析方法是基于 2D-PAGE，具體采用優(yōu)選4-9的pH范圍的固相pH梯度（IPGs)。
[0179] 在在此描述的分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白水平可采 用凝膠電泳技術測量，具體地，上述提到的技術與其它蛋白質(zhì)分離方法組合，特別是本領域 技術人員已知的方法，具體為色譜分析和體積排阻法。
[0180] 在在此所述分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白水平可采用 共振技術測量，具體為表面等離子體共振。
[0181] 在在此所述分析方法、方法和系統(tǒng)的一些【具體實施方式】中，R0B02蛋白水平可采 用蛋白質(zhì)生物芯片測量。生物芯片一般包括具有基本平坦表面的固體底物，其上連接有捕 獲試劑（例如，一種吸附劑或親和劑）。通常，生物芯片表面包括多個結(jié)合有捕獲試劑的 可尋址位置。生物芯片還可包括作為對照的結(jié)合捕獲試劑。蛋白質(zhì)生物芯片是可適用于 捕獲多肽的生物芯片。本領域中有多種蛋白質(zhì)生物芯片。例如，這些包括以下公司生產(chǎn) 的蛋白質(zhì)生物芯片：賽弗吉生物系統(tǒng)公司（弗里蒙特，加利福尼亞），Zyomyx(海沃市，力口 利福尼亞），英杰公司（卡爾斯巴德，加利福尼亞），Biacore(烏普薩拉，瑞典）和通用電 器醫(yī)療生物學有限公司（伯克郡，英國）（(^口116找61113；[085^七61118，111(3.(?代1]10111：，〇311；1；·· ),Zyomyx(Hayward,Calif. ),Invitrogen(Carlsbad,Calif. ),Biacore(Uppsala,Sweden)andProcognia(Berkshire,UK))。以下專利或公開的專利申請中描述了這些蛋白質(zhì)生物芯 片的示例：美國專利號 6, 225, 047 (Hutchens&Yip)，美國專利號 6, 537, 749(Kuimelisand Wagner)，美國專利號 6, 329, 209(Wagner等），PCT國際
【發(fā)明者】衛(wèi)寧·陸, 學萍·范, D·J·薩倫特 申請人:波士頓醫(yī)療中心有限公司