用于診斷阿扎胞苷耐藥性的試驗(yàn)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及使用包含在取自患者生物流體樣品中的BCL2L10蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)所述患者對(duì)阿扎胞治療苷治療的耐藥性的體外分析方法以及特異性結(jié)合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子。其特征在于從患者中取出生物流體樣品；計(jì)算所述生物流體樣品中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的總細(xì)胞的百分比；將該計(jì)算的百分比與參比閾值進(jìn)行比較，該閾值介于20％和60％之間；并所述生物流體中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比大于所述參比值的患者被診斷為對(duì)阿扎胞苷治療有耐藥性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于診斷阿扎胞音耐藥性的試驗(yàn)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能夠體外診斷患者對(duì)阿扎胞巧治療的耐藥性的分析方法。本發(fā)明還涉 及使得能夠預(yù)測(cè)患者對(duì)阿扎胞巧治療的耐藥性的體外分析試劑盒W及所述試劑盒的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] NHa 人O HO. W U OH Ih
[0003] 具有上式的阿扎胞巧是目前患有不適于造血干細(xì)胞移植的骨髓增生異常綜合征 (MD巧和急性髓細(xì)胞白血病（AML)的患者的唯一被認(rèn)可的治療。阿扎胞巧還使用Vidaza⑩ 的名稱銷(xiāo)售用于治療該些疾病。
[0004] 阿扎胞巧（AZA)是一種在該兩種疾病中產(chǎn)生40%-60%反應(yīng)的低甲基化劑 化ypomethylating agent)D
[0005] 骨髓增生異常綜合征（MD巧和急性髓細(xì)胞白血?。ˋML)是發(fā)生于骨髓干細(xì)胞的髓 系血液病，骨髓干細(xì)胞包含相當(dāng)于白細(xì)胞的粒細(xì)胞系的前體、相當(dāng)于紅細(xì)胞的成紅細(xì)胞系 的前體、相當(dāng)于血小板的巨核細(xì)胞系的前體和組織-單核細(xì)胞系的前體。MDS的特征在于粒 細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞骨髓細(xì)胞系的一種或所有H種的嚴(yán)重成熟障礙（其是引起血細(xì)胞 減少癥的原因）。DMS可發(fā)展成為急性白血?。ˋL)。傳統(tǒng)上，診斷W血液和骨髓的細(xì)胞學(xué)研 究、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)。DMS包括各種類(lèi)型的貧血或難治性血細(xì)胞減少癥W及 5q-綜合征。
[0006] AML的特征在于粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞系H種的骨髓前體的快速增殖，導(dǎo)致不 成熟細(xì)胞在血液和骨髓中蓄積，破壞了正常的血細(xì)胞生成。其診斷基于與用于MDS的相同 技術(shù)。AML包括未分化型AML、極低分化型AML、髓細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病、粒-單 核細(xì)胞性白血病W及急性紅細(xì)胞性白血病和急性成巨核細(xì)胞性白血病。原發(fā)性或繼發(fā)性 AML可能是在各種器官或組織（皮膚、神經(jīng)節(jié)、乳腺、消化道、脾等）中形成腫瘤的原因，產(chǎn)生 了髓系肉瘤，亦稱綠色瘤或粒細(xì)胞肉瘤。AML可表現(xiàn)為急性白血病，并且與惡性淋己瘤一起 提出了診斷難題。
[0007] 用阿扎胞巧治療的MDS或AML患者對(duì)阿扎胞巧有耐藥性（"AZA耐藥"）或?qū)Π⒃?胞巧敏感（"AZA敏感"）。然而，甚至"AZA敏感"患者在差不多的一段時(shí)間過(guò)去后，似乎都 遭到全身性復(fù)發(fā)。
[000引換句話說(shuō)，即使40%用阿扎胞巧治療的患者立即有耐藥性，且約60%的患者在最 初數(shù)月對(duì)所述治療敏感，全部患者在短期或中期都將發(fā)生對(duì)該種治療的耐藥性。該種現(xiàn)象 在傳統(tǒng)上被稱為復(fù)發(fā)，是指對(duì)患者W前對(duì)之敏感的治療產(chǎn)生耐藥性。
[0009] 現(xiàn)行的預(yù)后評(píng)級(jí)系統(tǒng)使得可能預(yù)測(cè)和預(yù)計(jì)用低甲基化劑治療的患者的總體生存。 該些系統(tǒng)基于患者亞群中所評(píng)價(jià)的預(yù)后評(píng)分。該些是由患者的核型研究和某些臨床特征限 定的風(fēng)險(xiǎn)群。然而，與該些評(píng)級(jí)系統(tǒng)有關(guān)的結(jié)果是不可靠的反應(yīng)預(yù)測(cè)因子。
[0010] MDS患者中有一半具有正常核型，并且具有相同染色體異常的患者常常在臨床上 是異質(zhì)的。體細(xì)胞點(diǎn)突變常見(jiàn)于MDS?；騎P53、EZ肥、ETV6、RUNX1和ASXLl的突變是MDS 患者中總體生存率低的預(yù)測(cè)因子，其獨(dú)立于其它已確立的危險(xiǎn)因子。
[0011] 然而，現(xiàn)有系統(tǒng)不提供在不給予患者所述治療的情況下能夠診斷患者對(duì)阿扎胞巧 的敏感性的合適結(jié)果。
[0012] 目前，用于測(cè)定患者是否對(duì)阿扎胞巧治療有耐藥性的唯一的已知方法是將所述治 療給予患者至少6個(gè)月，并確定所述治療是否有效果。
[0013] 使用該相同方法來(lái)鑒定患者的復(fù)發(fā)。實(shí)際上，目前已知的鑒定患者復(fù)發(fā)的唯一方 法是確定阿扎胞巧治療對(duì)患者不再有效的時(shí)間。不存在在相關(guān)癥狀出現(xiàn)之前能夠預(yù)測(cè)該種 復(fù)發(fā)的時(shí)間的方法。
[0014] 當(dāng)被建議用于MDS和/或AML患者時(shí)，阿扎胞巧治療是每日皮下注射至上臂、大腿 或腹部7天，接著21天的休息期?？赡墚a(chǎn)生多種較嚴(yán)重或不太嚴(yán)重的不良反應(yīng)，例如頗內(nèi)出 血、敗血癥、血壓變化、嗜睡、全身不適感和脫發(fā)。另外，阿扎胞巧治療的費(fèi)用相當(dāng)可觀。每 年治療約為80, 000歐元。因此目前沒(méi)有可靠且便宜地診斷患者對(duì)阿扎胞巧治療是敏感還 是耐藥的方法。
[0015] 另外，目前需要預(yù)測(cè)患者對(duì)阿扎胞巧治療的耐藥性W避免將阿扎胞巧給予該治療 對(duì)其無(wú)效的患者，不論是從其給藥開(kāi)始無(wú)效，還是在所述患者產(chǎn)生耐藥性的數(shù)月之后無(wú)效。 實(shí)際上，將該類(lèi)治療給予耐藥患者是強(qiáng)制性的，對(duì)患者可能是有危險(xiǎn)的，并且還可產(chǎn)生相當(dāng) 大的不必要的費(fèi)用。該適用于建議MDS和/或AML患者阿扎胞巧治療的兩種情況，并適用 于所有治療性阿扎胞巧治療。實(shí)際上，阿扎胞巧耐藥性與阿扎胞巧分子有關(guān)，而非其給予的 方式。
[0016] 更快地鑒定立即產(chǎn)生耐藥性的患者W及最初是敏感的患者的復(fù)發(fā)時(shí)間的能力也 是有利的，因?yàn)樗沟每赡茉谒龌颊叩呐R床病況惡化之前提供其它的臨床試驗(yàn)。
[0017] 因此能夠盡早診斷是必要的，不論患者將對(duì)阿扎胞巧治療敏感，還是能夠預(yù)測(cè)患 者的復(fù)發(fā)時(shí)間。
[0018] 出乎意料的是，本 申請(qǐng)人:能夠證實(shí)取自患者的生物流體樣品中B化化10蛋白質(zhì)的 表達(dá)水平與該患者對(duì)阿扎胞巧治療的敏感性之間的聯(lián)系。
[0019] 在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，通用術(shù)語(yǔ)B化2L10定義為相當(dāng)于B化2L10基因、B化化10 RNA轉(zhuǎn) 錄物或B化2L10蛋白質(zhì)。
[0020] B化化10基因是具有體外促調(diào)亡作用的Bcl-2家族的成員。B化化10蛋白質(zhì)與 Bcl-2蛋白家族都具有BHUBH4和肌2結(jié)構(gòu)域。作為Bcl-2家族促調(diào)亡因子特有的B冊(cè)結(jié) 構(gòu)域不存在于B化2L10蛋白質(zhì)中。然而，在有關(guān)B化2L10的促調(diào)亡或抗調(diào)亡性質(zhì)的文獻(xiàn)中 仍然有相互矛盾的結(jié)果，特別是因?yàn)槠湓谛∈笾械募俣ǖ闹毕蛲次铮∣dholog)也被描 述為具有促調(diào)亡活性。
[0021] B化化10可與Bcl-2家族的成員，特別是Bd-2、Bd-xL和Bax相互作用，W調(diào)節(jié) 不同情況下的細(xì)胞調(diào)亡。某些出版物例如論文"Loss of B化化10 protein expression as prognostic predictor for poor clinical outcome in gastric carcinoma(BCL2L10 蛋白質(zhì)表達(dá)喪失作為胃癌中臨床結(jié)局差的預(yù)后預(yù)測(cè)因子），化Stopathology 2010, 57, 814-82"提出B化化10是一種抗調(diào)亡基因。
[0022] B化化10的過(guò)量表達(dá)被描述為通過(guò)抑制由線粒體釋放的細(xì)胞色素C遏制細(xì)胞調(diào) 亡。
[002引最近表明，低甲基化劑地西他濱引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡和許多基因（包括B化2L10)的 正調(diào)節(jié)，亦稱"增量調(diào)節(jié)"?，F(xiàn)今，已表明患者對(duì)某些抗癌治療的抗性和BCL2L10基因的 表達(dá)之間有關(guān)系，特別在專(zhuān)利申請(qǐng)JP201016203UA)中，該申請(qǐng)描述了該樣的事實(shí)，即 B化化10基因的擴(kuò)增使得能夠檢測(cè)對(duì)基于喜樹(shù)堿的治療有耐藥性的癌細(xì)胞。同樣，專(zhuān)利申請(qǐng) US2009143236(A1)描述了通過(guò)研究某些基因（特別包括BCL2L10)的擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)某些藥物 耐藥性獲得的方法。然而，在該兩項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)中，對(duì)其耐藥性進(jìn)行了評(píng)價(jià)的抗癌劑不包括阿 扎胞巧。
[0024] 專(zhuān)利申請(qǐng)US2011/0129833表明患者中Bcl-2家族基因表達(dá)的增加與將響應(yīng)化療 治療的患者的可能性降低關(guān)聯(lián)。然而，該專(zhuān)利申請(qǐng)中絲毫未提到該個(gè)結(jié)論適用于基于阿扎 胞巧的治療。
[00巧]論文 "Role of B化2L10 methylation and TET2 mutations in M曲er risk myelodysplastic (較高危骨髓增生異常中B化2L10甲基化和TET2突變的作 用），Le址emia. 2011 Dec ;25(12)"描述了阿扎胞巧耐藥性的現(xiàn)象。該文件描述了 B化2L10 基因啟動(dòng)子的甲基化和阿扎胞巧耐藥性之間的關(guān)聯(lián)的存在。具體地講，B化化10基因啟動(dòng)子 過(guò)度甲基化與患有胃癌的患者的低生存率關(guān)聯(lián)。該出版物教導(dǎo)了具有高甲基化的BCL2L10 啟動(dòng)子的患者患MDS的風(fēng)險(xiǎn)高和響應(yīng)外遺傳治療（例如阿扎胞巧治療）的機(jī)會(huì)小。然而， 該出版物絲毫未教導(dǎo)BCL2L10蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)能夠得出相同結(jié)論。
[0026] 取而代之的是，該出版物提出正是BCL2L10表達(dá)的低水平與響應(yīng)阿扎胞巧的機(jī)會(huì) 小有關(guān)。另外，即使高水平的BCL2L10甲基化確實(shí)與對(duì)阿扎胞巧治療的耐藥性有關(guān)，該個(gè)數(shù) 據(jù)也不會(huì)與BCL2L10蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。實(shí)際上，基因的甲基化水平不必與產(chǎn)生自 所述基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。特別是在BCL2L10的情況下。
[0027] 另外，鑒于上述先有技術(shù)，絲毫未提出在BCL2L10蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和阿扎胞巧 耐藥性現(xiàn)象之間存在聯(lián)系。并且更加絲毫未提出在BCL2L10蛋白質(zhì)的高表達(dá)水平和阿扎胞 巧耐藥性之間存在關(guān)系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0028] 所述問(wèn)題的解決辦法涉及使用包含在取自所述患者的生物流體樣品中的BCL2L10 蛋白質(zhì)W及特異性結(jié)合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子，使得可診斷患者的阿扎胞巧治療耐藥 性的體外分析方法，其特征在于：
[0029] -從患者中取得生物流體樣品；
[0030] -計(jì)算所述生物流體中表達(dá)B化化10蛋白質(zhì)的總細(xì)胞的百分比；
[003。-將所述計(jì)算的百分比與參比闊值進(jìn)行比較，所述闊值介于20%和60%之間；和
[003引-所述生物流體中表達(dá)B化2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比高于所述參比值的患者被 診斷為對(duì)阿扎胞巧治療有耐藥性。
[0033] 出乎意料的是，本 申請(qǐng)人:表明在表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的患者生物流體細(xì)胞的百分 比和阿扎胞巧耐藥性之間關(guān)系的存在。
[0034] W前從未提出用于該百分比的參比闊值的測(cè)定，超出該參比闊值，便可斷定患者 對(duì)阿扎胞巧耐藥。
[0035] 該種方法使得可能在給予患者所述阿扎胞巧分子之前診斷出患者的阿扎胞巧耐 藥性。該種方法還使得可能有利地預(yù)測(cè)之前對(duì)阿扎胞巧治療敏感的患者的復(fù)發(fā)。
[0036] 本發(fā)明的分析方法使得可避免用阿扎胞巧對(duì)患者的任何不必要的治療。因此就患 者的健康和適當(dāng)治療而言，W及經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)來(lái)看，該是有利的。本發(fā)明的第二個(gè)目的涉及能夠 進(jìn)行本發(fā)明的體外分析方法的用于體外分析的試劑盒，所述試劑盒包括特異性結(jié)合從取自 患者的生物流體獲取的細(xì)胞中的BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子。
[0037] 最后，本發(fā)明的第H個(gè)目的涉及本發(fā)明的體外分析試劑盒用于實(shí)施監(jiān)測(cè)阿扎胞巧 治療W預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的方法中的用途。
[0038] 為了更好地理解與體外阿扎胞巧耐藥性有關(guān)的機(jī)制，本發(fā)明人制備了阿扎胞巧耐 藥性SKMl髓樣細(xì)胞，稱為AZA-R或SKM^R。相比之下，AZA-S或SKMl-S是阿扎胞巧敏感細(xì) 胞。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039] 在閱讀下列有關(guān)附圖給出的非限制性描述，將更好地理解本發(fā)明，其中：
[0040] 圖1顯示篩選獲自表達(dá)Bcl-2蛋白的SKMl細(xì)胞系的細(xì)胞的結(jié)果。SKMl-S和SKM^R 細(xì)胞用1 U M阿扎胞巧處理24小時(shí)。然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)W評(píng)價(jià)Bd-2、Md-l、Bd-xl 和B化2L10蛋白質(zhì)的量?？狗60抗體用作加載對(duì)照。
[0041] 圖2-6顯示患AML的SKMl-S和SKMl-R細(xì)胞系中B化化10蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0042] 在圖2、3和4中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，定量測(cè)定SKMl-S和SKMl-R細(xì)胞中的B化2L10 蛋白質(zhì)水平。
[0043] 圖5顯示通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（稱為RT-PCR)進(jìn)行的SKMl-S和SKMl-R細(xì) 胞的mRNA分析。
[0044] 圖6顯示能夠觀察SKM^S和SKM^R細(xì)胞中B化化10蛋白質(zhì)水平的蛋白質(zhì)印跡結(jié) 果。
[0045] 圖7-10顯示SKMl-R細(xì)胞對(duì)阿扎胞巧重新敏感，接著消除B化2L10基因表達(dá)。 B化化10基因表達(dá)的消除通常稱為"敲減"，在該種情況下為B化2L10敲減。
[0046] SKMl-S 和 SK]\a-R 細(xì)胞用 W下干擾 RNA 轉(zhuǎn)染；Luc siRNA、BCL2L10siRNA 或 Bd-2 siRNA。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，細(xì)胞用I y M阿扎胞巧刺激。
[0047] 圖7中，通過(guò)XTT試驗(yàn)（木糖耐量試驗(yàn)），在刺激24小時(shí)后測(cè)量細(xì)胞代謝。所示結(jié) 果等于進(jìn)行了 4次的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差（ + SEM)。
[0048] 圖8顯示在加入1 U M阿扎胞巧后24小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察到的脫天蛋白酶-3 標(biāo)記的結(jié)果。
[0049] 圖9顯示在加入1 U M阿扎胞巧后24小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所得的楓化丙錠（PI) 標(biāo)記的結(jié)果。
[0050] 圖10顯示為了測(cè)定BCL2L10和Bcl-2表達(dá)的抑制在加入1 U M阿扎胞巧后24小 時(shí)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。
[005。 圖11、12和13中，顯示了 B化化10的蛋白質(zhì)表達(dá)在阿扎胞巧耐藥患者中特異性增 加。
[0052] 圖11顯示通過(guò)對(duì)7名健康患者、7名阿扎胞巧敏感患者和5名阿扎胞巧耐藥患者 的"新鮮"骨髓樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢出的B化2L10、Bcl-2和邸K蛋白質(zhì)的表達(dá)。顯示了 各亞群中兩名患者的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。
[0053] 圖 12 顯不借助 ImageJ 軟件程序（ImageJ 是由 P^Jational Insti1:ute of Health(NIH)編寫(xiě)于化va中的用于圖像處理的免費(fèi)軟件程序）分析的B化2L10和E服蛋白 質(zhì)表達(dá)及B化2L10表達(dá)與E服表達(dá)的比率的定量測(cè)定。
[0054] 圖13顯示借助ImageJ軟件程序分析的B化2L10和E服蛋白質(zhì)表達(dá)的定量測(cè)定及 B化化10表達(dá)與E服表達(dá)的比率的定量測(cè)定。
[005引 圖14-17顯示阿扎胞巧耐藥MDS或AML患者中，骨髓中表達(dá)B化化10蛋白質(zhì)的細(xì) 胞的百分比增加的事實(shí)。
[005引圖14中，在患有32名患MDS或AML并正進(jìn)行阿扎胞巧治療的患者中和在8名健 康患者（全部來(lái)自組群1)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，定量測(cè)定表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百 分比。
[0057] 圖15中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，定量測(cè)定冷凍于DMSO的樣品中表達(dá)B化2L10蛋白質(zhì)的 細(xì)胞的百分比，所述樣品來(lái)自14名患有低危MDS的患者、31名患有高危MDS或AML且用阿 扎胞巧治療的患者（全部來(lái)自組群2)。
[0058] 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，定量測(cè)定冷凍于DMSO的樣品中表達(dá)B化2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百 分比，所述樣品來(lái)自16名患有高危MDS的患者或診斷中的患者，如圖16所示。
[0059] 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，定量測(cè)定冷凍于DMSO的樣品中表達(dá)B化2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百 分比，所述樣品來(lái)自15名全都正在進(jìn)行阿扎胞巧治療的患有高危MDS或AML的患者，如圖 17所示。
[0060] 圖18a和18b顯示表達(dá)B化化10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比和接受治療的MDS或AML 患者的總體生存之間的相關(guān)性。
[00川按照Kaplan-Meier,檢查了用AZA治療的MDS或AML患者的具有移植 (transplantation)的總體生存的比較，W及其骨髓中表達(dá)BCL2L10的細(xì)胞的百分比。
[0062] 圖19-22使得可證實(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的BCL2L10蛋白質(zhì)定量技術(shù)。
[0063] 圖19中，肥K293系的細(xì)胞用W下轉(zhuǎn)染：并入B化2L10的Myc表位標(biāo)簽N端部分的 PCDNA3表達(dá)質(zhì)?；虿⑷雰HMyc表位標(biāo)簽的N端部分的PCDNA3表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù) 定量測(cè)定BCL2L10蛋白質(zhì)表達(dá)水平。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)圖19。
[0064] 圖20中，肥K293系的細(xì)胞用干擾SiLuc RNA或干擾Si-B化化10 RNA轉(zhuǎn)染。通過(guò) 流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定BCL2L10蛋白質(zhì)表達(dá)水平。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)圖20。
[0065] 圖21和22顯示通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的B化化10蛋白質(zhì)水平?？狗60抗體用作 加載對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0066] 本發(fā)明涉及分析尤其通過(guò)對(duì)生物流體總細(xì)胞的BCL2L10蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定量測(cè) 定能夠體外診斷患者對(duì)阿扎胞巧治療耐藥性的方法。
[0067] 按照本發(fā)明，患者是人類(lèi)。有利的是，該分析方法特別適于惡性血液?。ɡ缢柘?血液?。┑幕颊摺Ｔ贉?zhǔn)確地說(shuō)，患者患有AML或MDS。
[0068] 按照本發(fā)明，生物流體是從人體獲得的流體。作為生物流體的非限制性實(shí)例，可提 及骨髓、血液、腦脊液和尿液。優(yōu)選本發(fā)明的生物流體是骨髓。
[0069] 按照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"總細(xì)胞"涵蓋存在于所采集的生物流體中的全部細(xì)胞。如果所 采集的生物流體是骨髓，總細(xì)胞特別包括造血干細(xì)胞化SC)和骨髓間質(zhì)細(xì)胞，它們是造血 細(xì)胞。
[0070] 按照本發(fā)明，特異性結(jié)合B化2L10蛋白質(zhì)的生物分子是能夠特異性結(jié)合B化2L10 蛋白質(zhì)的分子。有利的是，該些是單克隆或多克隆抗體、可溶性受體或適配體，優(yōu)選單克隆 或多克隆抗體。還優(yōu)選特異性結(jié)合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子為單克隆抗體。作為特異性 結(jié)合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子的非限制性實(shí)例，可提及"Cell Si即aling化chnologies" 公司參考號(hào)為"#3869"的抗B化2L10蛋白質(zhì)。
[OCm] 按照本發(fā)明，參比闊值，亦稱"截止"值，相當(dāng)于生物流體中B化2L10陽(yáng)性細(xì)胞的百 分比，即表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比。
[007引當(dāng)所獲得的生物流體總細(xì)胞中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比值大于該"截 止"值時(shí)，受測(cè)試的患者可診斷為對(duì)阿扎胞巧耐藥。相反地，當(dāng)所獲得的值低于該"截止"值 時(shí)，受測(cè)試的患者可診斷為對(duì)阿扎胞巧敏感。
[0073] 按照本發(fā)明，參比闊值介于20 %和60 %之間，優(yōu)選介于30 %和55 %，更優(yōu)選該參 比闊值等于50%。
[0074] 本發(fā)明的分析方法使得可診斷患者對(duì)阿扎胞巧治療有耐藥性。所述用阿扎胞巧治 療的患者在其治療期間每1、3和6個(gè)月然后在之后每3個(gè)月通常必須進(jìn)行骨髓抽吸。因此， 所采集的作為阿扎胞巧治療傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)一部分的骨髓樣品還可用于本發(fā)明的分析方法。因此 就該種對(duì)阿扎胞巧治療有耐藥性的診斷而言，不一定在患者中進(jìn)行特定的骨髓抽吸。
[00巧]換句話說(shuō)，鑒于所述體外分析方法能夠診斷患者的阿扎胞巧耐藥性，因此不必進(jìn) 行在傳統(tǒng)治療情況下對(duì)所抽吸的骨髓樣品進(jìn)行的額外檢查，該對(duì)患者是有利的。
[0076] 按照本發(fā)明，生物流體中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比的測(cè)量通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)（免疫分型）、疏水作用色譜法化IC)或定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)進(jìn)行。優(yōu)選該種 測(cè)量通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（免疫分型）進(jìn)行。
[0077] 本發(fā)明還涉及通過(guò)檢測(cè)包含在取自所述患者的生物流體樣品中的BCL2L10基因 的過(guò)量表達(dá)，能夠診斷患者的阿扎胞巧治療耐藥性的體外分析方法，其特征在于：
[0078] -從患者中取得生物流體樣品；
[0079] -通過(guò)檢測(cè)B化2L10基因的過(guò)量表達(dá)，計(jì)算所述生物流體中表達(dá)B化2L10的總細(xì)胞 的百分比；
[0080] -將所述計(jì)算的百分比與參比闊值進(jìn)行比較，所述闊值介于20%和60%之間；和
[0081] -所述生物流體中表達(dá)BCL2L10的細(xì)胞的百分比大于所述參比闊值的患者被診斷 為對(duì)阿扎胞巧治療有耐藥性。
[0082] B化化10基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)優(yōu)先通過(guò)比較基因組雜交CO!方法、流式細(xì)胞術(shù)方 法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerization chain reaction) (qPCR)進(jìn)行。B化化10基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)更優(yōu)先通過(guò)比較基因組雜交CO!方 法、DNA芯片方法或定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)進(jìn)行。B化化10基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)還更優(yōu) 先通過(guò)DNA芯片方法或定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)進(jìn)行。
[0083] 本發(fā)明還涉及包含特異性結(jié)合取自患者的生物流體樣品的細(xì)胞中的BCL2L10蛋 白質(zhì)的生物分子的體外分析試劑盒，所述試劑盒使得可預(yù)測(cè)所述生物流體中表達(dá)BCL2L10 蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比大于介于20%和60%之間的參比闊值的患者對(duì)阿扎胞巧治療有耐 藥性。
[0084] 還涉及包含選自W下的至少一種試劑的體外分析試劑盒：
[00財(cái)-能夠擴(kuò)增B化化10片段的一對(duì)引物，和
[0086] -能夠檢測(cè)B化化10存在的探針，
[0087] 所述試劑盒使得可預(yù)測(cè)所述生物流體中表達(dá)BCL2L10的細(xì)胞的百分比大于介于 20%和60%之間的參比闊值的患者對(duì)阿扎胞巧治療有耐藥性。
[0088] 本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及本發(fā)明的試劑盒或方法在實(shí)施監(jiān)測(cè)阿扎胞巧治療W預(yù) 測(cè)復(fù)發(fā)的方法中的用途。
[0089] 按照本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，使用本發(fā)明的試劑盒或方法還使得可根據(jù)患者 的反應(yīng)修改治療。
[0090] 按照本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，當(dāng)患者特別是患有骨髓增生異常綜合征和/或 急性髓細(xì)胞白血病的患者診斷出阿扎胞巧治療耐藥性時(shí)，將包括至少一種抗腫瘤藥和/或 抗炎藥在內(nèi)的替代治療給予所述患者。
[0091] 優(yōu)選將選自焼化劑、抗代謝物、植物生物堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和抗腫瘤抗生素的 抗腫瘤化合物給予所述患者。
[0092] 作為可按照本發(fā)明使用的抗腫瘤藥的非限制性實(shí)例，特別可提及阿卡地新（亦稱 AICAR，為5-氨基咪哇-4-甲醜胺-1-目-D-巧喃核糖巧的簡(jiǎn)稱）、阿卡地新的衍生物、放 線菌素D、安嚇巧、意環(huán)類(lèi)例如多柔比星或柔紅霉素、阿糖胞巧（aracytin)、ATRA(全反式 維甲酸）、博來(lái)霉素、測(cè)替佐米、白消安、喜樹(shù)堿的衍生物、順笛、卡笛、苯下酸氮芥、地西他 濱、德己金（Cbpakine)、多西他賽、表鬼白毒素的衍生物、埃羅替尼、依巧泊巧、5-氣尿嚼巧 巧即)、氣達(dá)拉濱、輕基脈、異環(huán)磯醜胺、組蛋白脫己醜酶（HDAC)抑制劑、來(lái)那度胺、甲氨蝶 嶺、絲裂霉素C、紫杉醇、普卡霉素、琉基嘿嶺、塞替派、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春瑞濱。還可提 及用于不同腫瘤病理學(xué)的酪氨酸激酶抑制劑（TKI)，例如伊馬替尼、達(dá)沙替尼、尼洛替尼和 舒尼替尼。
[0093] 可W使用的阿卡地新的衍生物、其外消旋體、對(duì)映體和非對(duì)映體及其混合物、其互 變異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選具有W下通式：
[0094]

【權(quán)利要求】
1. 一種使用包含在取自患者的生物流體樣品中的BCL2L10蛋白質(zhì)以及特異性結(jié)合 BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子，使得可診斷所述患者的阿扎胞苷治療耐藥性的體外分析方法， 其特征在于： -從患者中取得生物流體樣品； -計(jì)算所述生物流體中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的總細(xì)胞的百分比； -將所述計(jì)算的百分比與參比閾值進(jìn)行比較，所述閾值介于20%和60%之間；和 -所述生物流體中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞的百分比高于所述參比值的患者被診斷 為對(duì)阿扎胞苷治療有耐藥性。
2. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述生物流體是骨髓。
3. 權(quán)利要求1或2之一的方法，其特征在于所述參比閾值等于50%。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生物流體中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì) 的細(xì)胞的百分比的測(cè)量通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、疏水作用色譜法（HIC)或定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (qPCR)進(jìn)行，優(yōu)選通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。
5. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述特異性結(jié)合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物 分子是對(duì)BCL2L10蛋白質(zhì)有特異性的抗體。
6. -種通過(guò)檢測(cè)包含在取自患者的生物流體樣品中的BCL2L10基因的過(guò)量表達(dá)，使得 可診斷所述患者的阿扎胞苷治療耐藥性的體外分析方法，其特征在于： -從患者中取得生物流體樣品； -通過(guò)檢測(cè)BCL2L10基因的過(guò)量表達(dá)，計(jì)算所述生物流體中表達(dá)BCL2L10的總細(xì)胞的百 分比； -將所述計(jì)算的百分比與參比閾值進(jìn)行比較，所述閾值介于20%和60%之間；和 -所述生物流體中表達(dá)BCL2L10的細(xì)胞的百分比大于所述參比閾值的患者被診斷為對(duì) 阿扎胞苷治療有耐藥性。
7. 權(quán)利要求6的方法，其特征在于BCL2L10基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)通過(guò)比較基因組雜交 CGH方法、流式細(xì)胞術(shù)方法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)進(jìn)行。
8. 權(quán)利要求7的方法，其特征在于BCL2L10基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)通過(guò)比較基因組雜交 CGH方法、通過(guò)DNA芯片方法或定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)進(jìn)行。
9. 權(quán)利要求8的方法，其特征在于BCL2L10基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)通過(guò)DNA芯片方法或 定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR)進(jìn)行。
10. -種包含特異性結(jié)合取自患者的生物流體樣品細(xì)胞中的BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分 子的體外分析試劑盒，所述試劑盒使得可預(yù)測(cè)所述生物流體中表達(dá)BCL2L10蛋白質(zhì)的細(xì)胞 的百分比大于介于20%和60%之間的參比閾值的患者對(duì)阿扎胞苷治療有耐藥性。
11. 權(quán)利要求6的分析試劑盒，其特征在于所述生物流體是骨髓。
12. -種包含選自以下至少一種試劑的體外分析試劑盒： -能夠擴(kuò)增BCL2L10片段的一對(duì)引物，和 -能夠檢測(cè)BCL2L10存在的探針， 所述試劑盒使得可預(yù)測(cè)所述生物流體中表達(dá)BCL2L10的細(xì)胞的百分比大于介于20% 和60 %之間的參比閾值的患者對(duì)阿扎胞苷治療有耐藥性。
13. 權(quán)利要求10、11或12的試劑盒在實(shí)施用于監(jiān)測(cè)阿扎胞苷治療以預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的方法中 的用途。
14. 權(quán)利要求13的試劑盒的用途，其特征在于使得能夠根據(jù)所述患者的反應(yīng)修改所述 治療。
15. 權(quán)利要求13或14的用途，其特征在于所述患者患有骨髓增生異常綜合征和/或急 性髓細(xì)胞白血病。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK104321649SQ201380013105
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月28日
【發(fā)明者】托馬斯·克魯塞奧, 帕特里克·奧伯格, 基洛姆·羅伯特, 弗雷德里克·盧西亞諾 申請(qǐng)人:尼斯-索菲亞·安蒂波利斯大學(xué), 尼斯大學(xué)中心醫(yī)院, 國(guó)家健康和醫(yī)學(xué)研究院