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      腺病毒腫瘤診斷法

      文檔序號:6213909閱讀:609來源:國知局
      腺病毒腫瘤診斷法
      【專利摘要】本文提供了使用重組腺病毒檢測受試者中癌癥的組合物和方法。更具體地,使用重組腺病毒診斷患者的癌癥以及進(jìn)一步使用重組腺病毒篩選有效治療所述患者癌癥的化合物。
      【專利說明】腺病毒腫瘤診斷法
      [0001]相關(guān)申請的交叉引用
      [0002]本申請要求于2012年3月14日提交的美國臨時(shí)申請N0.61/610,970的優(yōu)先權(quán),所述臨時(shí)申請為了所有目的全文納入本文。
      [0003]對聯(lián)邦政府資助研發(fā)做出的發(fā)明的權(quán)利的聲明
      [0004]本發(fā)明是在美國國家衛(wèi)生研究院授予的政府支持的基金R01HG004876、R21RR024453和R43RR031424下進(jìn)行的。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。

      【背景技術(shù)】
      [0005]細(xì)胞從實(shí)體瘤擴(kuò)散到身體遠(yuǎn)端的被稱為轉(zhuǎn)移的過程造成了所有腫瘤相關(guān)的死亡的90%以上。起源于原發(fā)性腫瘤的細(xì)胞可進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并流動以侵入遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤的器官和組織并在其中定殖和增殖。因此,這些循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CLC)的檢測為轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的早期鑒定和治療祀向提供了寶貴的機(jī)會(Cristofanilli, 2004 ;de Bono, 2008)。目前用于檢測CTC的技術(shù)包括反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光原位雜交以及最近的微流體技術(shù)。遺憾的是,RT-PCR不能區(qū)分活的轉(zhuǎn)移性CTC和源于原發(fā)性腫瘤的核酸或細(xì)胞片段。
      [0006]基于抗體的技術(shù)不能用于檢測所有癌癥,而僅能檢測那些表達(dá)最常見的和被很好地表征的標(biāo)記物的癌癥。當(dāng)前系統(tǒng)的CTC計(jì)數(shù)(enumerat1n)僅提供了一層關(guān)于癌癥診斷的信息。已經(jīng)證明CellSearch? (Veridex, Raridan NJ)裝置取得了 CTC分析的商業(yè)成功并且其被FDA批準(zhǔn)用于乳腺、前列腺和結(jié)腸,然而在卵巢、直腸和肺中的使用還有待批準(zhǔn)。所述CellSearch?,系統(tǒng)的局限性包括:(a)依賴于EpCAM的表達(dá)水平(PunnooseEA,等人,PLoS ONE.2010 ;5(9):el2517), (b)不使用間充質(zhì)標(biāo)記物(Punnoose EA,等Λ , PLoS ONE.2010 ;5(9):el2517), (c)依賴于抗體親和力用來捕獲(Nagrath S,等人,Nature, 2007 ;450(7173): 1235-9.18097410),以及最重要的(d)缺少 CTC 表型特征。
      [0007]沒有任何抗體具有100%的腫瘤或組織特異性,而且抗體既結(jié)合活的CTC也可以結(jié)合死的CTC。因此需要更敏感的、更加特異的以及可應(yīng)用更加廣泛的檢測血液中非常少量的CTC的技術(shù)。另外,急需開發(fā)新的診斷劑和工具,其不僅能檢測和捕獲CTC還能對它們的惡性潛能進(jìn)行定量以及“預(yù)先”確定在切除個(gè)體患者的腫瘤中最有效療法。
      [0008]盡管癌癥在基因組范圍內(nèi)具有復(fù)雜性和可變性,但是共同點(diǎn)是它們都具有生長失調(diào)的表型,即所謂的癌癥標(biāo)志,這是由相對少量的關(guān)鍵途徑發(fā)生突變而引起的。 申請人:沒有將重心放在檢測大量的且在腫瘤之間高度可變的單個(gè)基因損傷上,而是構(gòu)建了診斷性病毒,所述病毒在其基因組中整合了多個(gè)轉(zhuǎn)錄和分子模塊以感染和檢測患者的腫瘤,報(bào)告腫瘤的分子“標(biāo)志”以及“預(yù)先”報(bào)告腫瘤對不同療法的反應(yīng)。使用這些試劑,任何給定腫瘤的分子損傷和惡性特征可被快速識別(24小時(shí)以內(nèi))并可通過標(biāo)準(zhǔn)化自動平臺來評分。另夕卜,這些試劑也能作為報(bào)告分子以快速且直接地測定患者的腫瘤是否可能對具體治療產(chǎn)生反應(yīng)。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0009]在一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括給予受試者重組報(bào)告性腺病毒。使所述重組報(bào)告性腺病毒感染受試者中的癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。從受試者中獲得含有所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的樣品并檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞,從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      [0010]在另一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品。使重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞,檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      [0011]在另一方面,提供了確定測試化合物是否抑制了來自癌癥患者的癌細(xì)胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品。將重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞生長足夠的時(shí)間。測定所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的生長水平并將所述水平與對照水平對比,其中與對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的細(xì)胞癌的生長。
      [0012]在另一方面,提供了分離來自受試者的樣品中報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的方法。所述方法包括將所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞與未感染的細(xì)胞分離,其中所述分離至少部分地基于所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的表達(dá)的報(bào)告基因表型。
      [0013]在另一方面,提供了含有癌細(xì)胞報(bào)告分子模塊和癌細(xì)胞結(jié)合模塊的重組報(bào)告性腺病毒。
      [0014]在另一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括將本文(包括其中的實(shí)施方案)中提供的含有重組報(bào)告性腺病毒給予受試者。使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述受試者中的癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。從含有所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的受試者中獲得樣品,并檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      [0015]在另一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品。將本文(包括其中的實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒感染癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞,檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      [0016]在另一方面,提供了檢測測試化合物是否抑制了來自癌癥患者的癌細(xì)胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品以及將本文(包括其中的實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒感染癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞生長足夠的時(shí)間并測定所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的生長水平。將所述水平與對照水平對比,其中與對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的癌細(xì)胞的生長。
      [0017]在另一方面,提供了檢測癌癥的試劑盒。所述試劑盒包括本文(包括其中的實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒。
      [0018]在另一方面,提供了用于篩選癌癥藥物的試劑盒。所述試劑盒包括癌癥抑制性化合物和本文(包括其中的實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒。
      [0019]在另一方面,提供了用于分離癌細(xì)胞的試劑盒。所述試劑盒包括用于檢測表達(dá)的報(bào)告基因表型的裝置和本文(包括其中的實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0020]圖1.癌癥的標(biāo)志
      [0021]圖2.Adsemly在體外反應(yīng)中快速地從模塊部分裝配Ad基因組。圖2上部分:被分成轉(zhuǎn)錄和功能模塊并被克隆到質(zhì)粒上的基因組。圖2中間部分:將E1、E3和E4模塊用腫瘤特異性啟動子驅(qū)動的熒光蛋白修飾以突出CTC。圖2下部分:多位點(diǎn)特異性的病毒在體外重新裝配和重建示意圖。
      [0022]圖3.P16被沉默時(shí)E2F-應(yīng)答啟動子被激活。
      [0023]圖4.將空間濾波器(遮罩)放置在所述器件外觀的放大圖像中。染色細(xì)胞的輸入熒光脈沖信號用不同的空間濾波器調(diào)節(jié),然后將所述信號用PMT記錄,產(chǎn)生了時(shí)間域上的不同的光電流波形,其對應(yīng)于細(xì)胞通過微流體通道時(shí)的不同的位置,例如(111)、(1101)或(1011)。這種時(shí)空編碼技術(shù)通過使用僅僅一個(gè)PMT來區(qū)分3種或甚至更多種信號,從而降低了系統(tǒng)的大小和成本。
      [0024]圖5.圖5(a)裝置結(jié)構(gòu)。將250 μ m寬的主流體通道分成3個(gè)亞通道。中間的通道用于收集廢液,同時(shí)左邊和右邊的通道用于收集樣品。通過光纖將照明光(488nm激光)遞送到所述裝置中并由涂有Teflon AF的光流體波導(dǎo)引導(dǎo)。將PZT驅(qū)動器整合至裝置中。方塊中是由PDMS制成的裝置的分選接合點(diǎn)。圖5(b)當(dāng)PZT驅(qū)動器垂下時(shí),目的細(xì)胞被推到右邊的分選通道,同時(shí)非靶細(xì)胞直接進(jìn)入到中間的廢液通道而不會引發(fā)PZT。圖5(c)流動豐旲式觀察。左邊:通過置加用聞速CMOS攝像機(jī)每0.3ms拍攝的照片對分選到右邊通道的熒光珠進(jìn)行的追蹤。右邊:不同電壓強(qiáng)度下進(jìn)入PZT驅(qū)動器的微珠的軌跡曲線圖。其有助于設(shè)置用于足夠偏轉(zhuǎn)的闕值電壓。
      [0025]圖6.使用NanoSort-UCSD μ FACS系統(tǒng)從未染色細(xì)胞中分選出熒光染色的紅白血病細(xì)胞(Κ562)的說明。得到230倍的富集因子(40)。
      [0026]圖7.操作流程和預(yù)期的來自轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTC的熒光讀出。
      [0027]圖8.通過病毒載體對CTC進(jìn)行表型分析。
      [0028]圖9.選擇的腫瘤診斷途徑的熒光讀出。該圖列出了一組最初的4種診斷性表達(dá)盒(左邊)和它們在細(xì)胞中的預(yù)期表型(右邊)。CMV-[Foxo3-GFP]盒具有組成型活性,因此GFP能在所有含有有活性的CMV啟動子的細(xì)胞類型中表達(dá)。在含有低活性PI3K/Akt的細(xì)胞中,例如非腫瘤組織,F(xiàn)oxo3-GFP融合蛋白定位到細(xì)胞核中。然而,在含有高活性PI3K/Akt的細(xì)胞中,例如在腫瘤細(xì)胞中,F(xiàn)oxo3-GFP融合蛋白定位到細(xì)胞質(zhì)中。E2F- [mCherry-CRTC2]盒僅僅在具有無活性pRB的細(xì)胞(例如在幾乎所有的腫瘤中)中有活性。在這些細(xì)胞中,如果腫瘤抑制子Lkbl是完整的,貝U mCherry-CRTC2融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。然而,在缺失了Lkbl功能的腫瘤細(xì)胞中,mCherry-CRTC2融合蛋白則定位到細(xì)胞核中。所述血清應(yīng)答元件(SRE)啟動子僅在具有激活的生長因子信號傳導(dǎo)或有絲分裂原刺激的細(xì)胞中表達(dá)YFPj^示該細(xì)胞是快速分裂的細(xì)胞例如腫瘤。最后,SMAD-應(yīng)答啟動子盒驅(qū)動含有有活性的TGF3信號傳導(dǎo)的細(xì)胞中tdTomato的表達(dá),在某些癌癥中,這種現(xiàn)象與轉(zhuǎn)移表型聯(lián)系在一起。當(dāng)結(jié)合在一起時(shí),該四種表達(dá)盒提供了五種不同的癌癥相關(guān)途徑的信息。
      [0029]圖10.對腺病毒Adsembly模塊進(jìn)行改造以構(gòu)建腫瘤診斷病毒。使用Adsembly基因組組裝方法構(gòu)建病毒。在該圖表中,示出了其中放置了起初的四種癌癥診斷表達(dá)盒中每一種的Adsembly模塊。將兩種盒克隆到El模塊中,因?yàn)樵谥暗膶?shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明了 El模塊允許雙表達(dá)盒的存在。將E3模塊的E3A/E3B部分刪除并用單個(gè)盒子替換。沒有顯示在表I中列出的對尾絲基因的改造,所述尾絲也存在于E3模塊中。最后,將E4區(qū)域刪除并用單個(gè)的模塊替換。可在材料與方法中找到關(guān)于刪除和插入的更具體的信息。對這些Adsembly載體改造以后,將它們用在常規(guī)Adsembly反應(yīng)中以構(gòu)建含有一種或更多所述腫瘤診斷表達(dá)盒的病毒。

      【具體實(shí)施方式】
      [0030]1.定義
      [0031]“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其
      [0032]多聚體,以及它們的互補(bǔ)序列。所述術(shù)語包括含有已知的核酸類似物或修飾的主鏈殘基或修飾的連接的核酸,所述核酸可以是合成的、天然存在的和非天然存在的,具有與參照核酸相似的結(jié)合特性,并且以與參考核酸類似的方式代謝。這樣的類似物的實(shí)例包括,但不限于,硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
      [0033]除非另有說明,特定的核酸序列也暗含其保守性修飾的變體(例如,簡并密碼子置換)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。具體地,簡并密碼子置換可以通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)所選(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷置換的序列來實(shí)現(xiàn)(Batze 等,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ;0htsuka 等人,J.B1l.Chem.260:2605-2608(1985) ;Rossolini 等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98 (1994))。術(shù)語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。
      [0034]特定的核酸序列還暗含“剪接變體”。相似地,由核酸編碼的特定的蛋白質(zhì)暗含由該核酸的剪接變體編碼的任何蛋白?!凹艚幼凅w”,顧名思義,是基因可變剪切的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后,可將起始的核酸轉(zhuǎn)錄物剪接以使不同的(可變的)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。剪接變體的產(chǎn)生機(jī)制不同,但是都包括外顯子的可變剪接。通過通讀轉(zhuǎn)錄從相同的核酸衍生的不同多肽也包含在此定義中。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物(包括所述剪接產(chǎn)物的重組體形式)包括在此定義中。鉀通道剪接變體的實(shí)例在Leicher等,J.B1l.Chem.273 (52): 35095-35101 (1998)中論述。
      [0035]可采用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)連接和限制性酶切技術(shù)構(gòu)建含有所需的治療基因的編碼和調(diào)控序列的合適的載體(見Maniatis等人,in Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982))。可以對分離的質(zhì)粒、DNA 序列、或合成的寡核苷酸進(jìn)行切割、加尾和重新連接以形成所需的形式。
      [0036]當(dāng)將核酸與另一核酸序列置于功能性關(guān)系中時(shí),該核酸被“可操作地連接”。例如,如果前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA被表達(dá)為參與多肽分泌過程中的前蛋白,那么所述前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA與所述多肽的DNA可操作地連接;或者如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄,那么該啟動子或增強(qiáng)子與所述編碼序列可操作地連接;如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于可促進(jìn)翻譯的位置,那么所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)與所述編碼序列可操作地連接。一般,“可操作地連接”意指連接的DNA序列是相鄰的,并且,在分泌性前導(dǎo)序列的情況下是鄰近的并且處于閱讀相中。然而,增強(qiáng)子不必是鄰接的。通過在適宜的限制酶切位點(diǎn)處連接來實(shí)現(xiàn)連接。如果這樣的位點(diǎn)不存在,則依據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭或連接體。
      [0037]在兩條或多條核酸或多肽序列的上下文中,術(shù)語“相同”或“同一性”百分?jǐn)?shù)指的是使用以下描述的使用默認(rèn)參數(shù)的BLAST或BLAST2.0序列比對算法或通過手動比對以及視覺觀察(見,例如,NCBI網(wǎng)址等)測定的相同的或者具有特定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩條或多條序列或亞序列(即在比較窗口或指定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行最大相關(guān)性的比較和比對時(shí),在指定的區(qū)域內(nèi)大約60%同一性、優(yōu)選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高的同一性)。然后將這些序列稱為“基本相同的”。該定義也指的是,或者可以應(yīng)用于測試序列的互補(bǔ)(compliment)序列。所述定義還包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有置換的那些序列。如下所述,所述優(yōu)選的算法可產(chǎn)生缺口(gap)等。優(yōu)選地,同一性存在于長度為至少約25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi),或更優(yōu)選地,在長度為至少約50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)。
      [0038]在序列比對時(shí),一般一種序列作為測試序列與之比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí),將測試序列和參考序列輸入電腦,如果需要的話,指定序列坐標(biāo),并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地,使用默認(rèn)程序參數(shù),或者指定替代參數(shù)。然后基于所述程序參數(shù),序列比較算法計(jì)算所述測試序列相對于參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。
      [0039]本文使用的“比較窗口 ”包括涉及具有任何一個(gè)選自如下鄰接位置數(shù)目的區(qū)段:20-600、通常約50-約200、更通常約100-約150,其中在將兩個(gè)序列以最佳方式進(jìn)行比對后,可以將一條序列與具有相同數(shù)目鄰接位置的參考序列進(jìn)行比較。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的??赏ㄟ^以下方法進(jìn)行最佳的用于比較的序列比對,例如,通過Smith&ffaterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)的局部同源算法,通過 Needleman&Wunsch, J.Mol.B1l.48:443 (1970)的同源比對算法,通過 Pearson&Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444(1988)的相似性搜索法,通過這些算法的計(jì)算機(jī)化工具(Wisconsin Genetics軟件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA,Genetics Computer Group, 575ScienceDr., Madison, WI),或者通過人工比對和視覺觀察(見例如,Current Protocol inMolecular B1logy (Ausubel 等,eds.1995 增刊))。
      [0040]適合用于測定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的優(yōu)選實(shí)例為BLAST和BLAST2.0 算法,所述算法分別記載于在 Altschul 等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.B1l.215:403-410(1990)中。使用具有本文所述參數(shù)的BLAST和BLAST2.0來測定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列同一性百分?jǐn)?shù)。本領(lǐng)域已知,進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)信息中心公開獲得。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中的具有長度W的短的字串,來鑒定高計(jì)分序列對(HSP),當(dāng)將所述短字串與數(shù)據(jù)庫序列中的具有相同長度的字串進(jìn)行比對時(shí),所述短的字串匹配或者滿足一些陽性值的閾值得分T。T被稱為相鄰字串得分閾值(Altschul等,上文)。這些起始相鄰字串匹配(hit)作為種子用于起始搜索尋找包含它們的更長的HSP。只要累積比對得分可增加,就將所述字串匹配沿著每條序列雙向延伸。對于核酸序列,使用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎(jiǎng)分;通常>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分;通常〈0)計(jì)算累積得分。對于氨基酸序列,使用得分矩陣來計(jì)算累積得分。所述字串匹配在每個(gè)方向上的延伸在下列情況下會終止:當(dāng)累積比對得分從其最大獲得值降低了數(shù)量X時(shí);由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對的累積,所述累積得分達(dá)到零或更低時(shí);或者到達(dá)任一序列的末端時(shí)。所述BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核酸序列)使用字串長度(W)為11、期望值(E)為10、M = 5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對于氨基酸序列,所述BLASTN程序使用字串長度(W)為 3、期望值(E)為 10 以及 BLOSUM62 得分矩陣(見 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915(1989))比對(B)為 50、期望值(E)為 10、M = 5、N = -4 以及兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。
      [0041]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可以互換使用,是指氨基酸殘基的多聚體。所述術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸多聚體,以及天然存在的氨基酸多聚體和非天然存在的氨基酸多聚體。
      [0042]術(shù)語“氨基酸”指的是天然存在的和合成的氨基酸,以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸,以及后來被修飾的那些氨基酸,例如,羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指的是具有和天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物,即,與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的α-碳,例如,高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這類類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或者修飾的肽主鏈,但是保留著和天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指的是具有與氨基酸通常的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同,但是以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化學(xué)化合物。
      [0043]本文中的氨基酸可被稱為其通常已知的IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號。類似地,核苷酸可被稱為其通常接受的單字母密碼。
      [0044]“保守性修飾變體”適用于氨基酸和核酸序列。就具體的核酸序列而言,保守性修飾變體指的是編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的那些氨基酸,或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí),保守性修飾變體指的是其基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性,大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如,密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此,在每一個(gè)由一個(gè)密碼子指定為丙氨酸的位置上,所述密碼子可改變?yōu)槿魏我粋€(gè)所述的相應(yīng)密碼子,而不會改變所編碼的多肽。這類核酸改變是“沉默改變”,其是保守性修飾改變的一種。本文中每一條編碼多肽的核酸序列也描述了所述核酸的每一種可能的沉默改變。技術(shù)人員會理解,核酸中的每一個(gè)密碼子(除了 AUG,其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子,以及TGG,其通常是色氨酸的唯一密碼子)都可被修飾從而產(chǎn)生功能相同的分子。因此,對于表達(dá)產(chǎn)物而言,而并未對于實(shí)際探針序列而言,編碼多肽的核酸的每一個(gè)沉默改變都暗含在每一個(gè)所述序列中。
      [0045]對于氨基酸序列,技術(shù)人員應(yīng)理解,對核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行能夠改變、添加或刪除所編碼的序列中的單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的單個(gè)置換、刪除或添加,這類單個(gè)置換、刪除或添加產(chǎn)生“保守性修飾變體”,在所述保守性修飾變體中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所置換。提供了功能相似的氨基酸的保守性置換表是本領(lǐng)域熟知的。這類保守性修飾變體除了包括上述之外,還包括本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源序列和等位基因。
      [0046]下列八組中每組都含有相互之間為保守性置換的氨基酸。I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ;2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷;5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ;7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(見,例如,Creighton, Proteins(1984))。
      [0047]當(dāng)用于例如細(xì)胞、病毒、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí),術(shù)語“重組的”表示,所述細(xì)胞、病毒、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)或者通過改變天然氨基酸或者蛋白質(zhì)而被修飾或者表示所述細(xì)胞源自這樣修飾的細(xì)胞。因此,例如,重組的細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中不存在的基因或者表達(dá)那些原本異常表達(dá)、低水平表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。
      [0048]短語“嚴(yán)格雜交條件”指的是在這種條件下通常在核酸的復(fù)雜混合物中,探針與其靶亞序列雜交而不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的,并且在不同的環(huán)境下是不同的。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的廣泛指南見于Tijssen,Techniques in B1chemistry and Molecular B1logy—Hybridizat1n withNucleic Probes, “Overview of principles of hybridizat1n and the strategy ofnucleic acid assays”(1993)。通常,將嚴(yán)格條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度和pH下比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)值低約5-10°C。^是(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)達(dá)到平衡后(靶序列過量存在時(shí),在Tm下,平衡時(shí)50%的探針被占用)與靶序列互補(bǔ)的探針的50%與靶序列雜交時(shí)的溫度。嚴(yán)格條件還可以通過加入去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)來獲得。對于選擇性或特異性雜交,陽性信號至少兩倍于背景,優(yōu)選10倍于背景雜交。示例性的嚴(yán)格雜交條件可如下:在50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS中,在42°C下孵育,或者,在5x SSCU%SDS中,在65°C下孵育、在65°C下用0.2x SSC和0.1% SDS洗滌。
      [0049]在嚴(yán)格條件下不與彼此雜交的核酸,如果其編碼的多肽基本相同,則它們?nèi)匀皇腔鞠嗤?。例如,?dāng)使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性來構(gòu)建核酸拷貝時(shí),會發(fā)生這種情形。在這些情況下,核酸一般在中等嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行雜交。示例性的“中等嚴(yán)格雜交條件”包括在40%甲酰胺、I M似(:1、1%505的緩沖液中在371:下雜交,并在451:下用1父SSC洗滌。陽性雜交為至少兩倍于背景。普通技術(shù)人員會容易地理解,其他雜交和洗滌條件可用于提供具有相似嚴(yán)格性的條件。確定雜交參數(shù)的其他指南在大量參考文獻(xiàn)中提供,例如,Current Protocols in Molecular B1logy, ed.Ausubel et al., John Wiley&Sons。
      [0050]對于PCR,盡管退火溫度取決于引物長度而可在約32°C -48°C間變化,但是約36°C的溫度一般用于低嚴(yán)格性擴(kuò)增。盡管高嚴(yán)格性退火溫度取決于引物長度和特異性而可在約50°C到約65°C范圍內(nèi),但是對于高嚴(yán)格性PCR擴(kuò)增,一般溫度為約62°C。高和低嚴(yán)格性擴(kuò)增的一般循環(huán)條件包括90°C _95°C變性階段持續(xù)30 sec-2min、退火階段持續(xù)30sec-2min、以及約72°C延伸階段持續(xù)l-2min。低和高嚴(yán)格性擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指南在例如Innis etal.(1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applicat1ns, Academic Press, Inc.N.Y.)中提供。
      [0051]術(shù)語“轉(zhuǎn)染作用”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)作用”、“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”可互換使用并被定義為將核酸分子或蛋白質(zhì)引入到細(xì)胞的過程。使用非病毒或基于病毒的方法將核酸引入到細(xì)胞中。所述核酸分子可以是編碼完整蛋白或者其功能部分的序列。一般,核酸載體包括蛋白表達(dá)必需的元件(例如,啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)等)。轉(zhuǎn)染的非病毒方法包括不使用病毒DNA或病毒顆粒作為遞送系統(tǒng)而將核酸分子引入到細(xì)胞中的任何適當(dāng)?shù)姆椒?。示例性的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、聲致穿孔、熱擊轉(zhuǎn)染、磁轉(zhuǎn)染和電穿孔。對于基于病毒的方法,任何有用的病毒載體都可用于本文描述的方法中。病毒載體的實(shí)例包括,但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒和腺-伴隨病毒載體。在一些方面,使用腺病毒載體按照本領(lǐng)域熟知的常規(guī)步驟將核酸分子引入至細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染作用”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)作用”也指的是將蛋白質(zhì)從外部環(huán)境引入至細(xì)胞中。一般,蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用或轉(zhuǎn)染作用依賴于能夠穿過細(xì)胞膜的多肽或蛋白質(zhì)與目的蛋白的結(jié)合。參見,例如,F(xiàn)ord等,(2001)Gene Therapy8:1-4and Prochiantz(2007)Nat.Methods 4:119-20。
      [0052]轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)可在宿主細(xì)胞中瞬時(shí)或穩(wěn)定發(fā)生。在“瞬時(shí)表達(dá)”過程中,所述轉(zhuǎn)染核酸沒有整合到宿主細(xì)胞基因組中,并且在細(xì)胞分裂過程中未轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞中。因?yàn)樗鲛D(zhuǎn)染核酸的表達(dá)僅限于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,因此所述基因的表達(dá)隨著時(shí)間而都丟失。相比之下,當(dāng)轉(zhuǎn)染基因與另一個(gè)賦予轉(zhuǎn)染細(xì)胞選擇優(yōu)勢的基因共轉(zhuǎn)染時(shí),所述轉(zhuǎn)染基因可發(fā)生穩(wěn)定表達(dá)。這樣的選擇優(yōu)勢可以是對給予細(xì)胞的某種毒素的抗性??赏ㄟ^轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的將轉(zhuǎn)染基因插入到宿主基因組中來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入過程中,所述基因以可預(yù)測的方式放置在兩個(gè)轉(zhuǎn)座子接頭序列之間,所述兩個(gè)轉(zhuǎn)座子接頭序列使得能夠插入至宿主基因組中并隨后被切除。
      [0053]當(dāng)提及細(xì)胞培養(yǎng)物本身或培養(yǎng)過程時(shí),術(shù)語“培養(yǎng)”、“正在培養(yǎng)”、“生長”、“正在生長”、“維持”、“正在維持”、“擴(kuò)增”、“正在擴(kuò)增”等可互換使用,意指在適合存活的條件下在體外(例如,離體)維持細(xì)胞。使得培養(yǎng)的細(xì)胞能夠存活,并且培養(yǎng)可導(dǎo)致細(xì)胞生長、分化或分裂。所述術(shù)語并不意味著在培養(yǎng)物中的細(xì)胞都能存活、生長或分裂,因?yàn)橐恍┘?xì)胞可自然衰老等。一般將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中,所述培養(yǎng)基可在培養(yǎng)的過程中更換。
      [0054]術(shù)語“培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)液”指的是細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。培養(yǎng)基一般為等滲溶液,并且可以為液態(tài)的、凝膠狀的、或半固態(tài)的,例如,以提供細(xì)胞粘附的基質(zhì)或支持物。本文使用的培養(yǎng)基可包括用于培養(yǎng)細(xì)胞所必需的營養(yǎng)支持物、化學(xué)支持物和結(jié)構(gòu)支持物的組分。
      [0055]“對照”樣品或數(shù)值指的是充當(dāng)參照的樣品,通常為已知的參照,用于與測試樣品進(jìn)行比較。例如,可從測試條件(例如,存在測試化合物)中獲取測試樣品,并將所述測試樣品與來自已知條件(例如,不存在測試化合物(陰性對照)、或者存在已知化合物(陽性對照))中的樣品進(jìn)行比較。對照也可表示從很多測試或結(jié)果收集而來的平均值。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解,可設(shè)計(jì)對照用于評估任何數(shù)量的參數(shù)。例如,可設(shè)置對照以基于藥理學(xué)數(shù)據(jù)(例如,半衰期)或治療學(xué)量度(例如,副作用的比較)來比較治療效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解哪些對照在給定的情形中有價(jià)值,并且應(yīng)能夠基于與對照數(shù)值進(jìn)行的比較來分析數(shù)據(jù)。對照還可以對確定數(shù)據(jù)的顯著性有價(jià)值。例如,如果對于給定參數(shù)的數(shù)值在對照中的變化性很大,則認(rèn)為測試樣品的變化不顯著。
      [0056]在包含“另外的”、“其他的”、或“第二”組分的組合物(例如,癌細(xì)胞報(bào)告模塊、報(bào)告基因表型)中,本文使用的第二組分不同于其他組分或第一組分?!暗谌苯M分不同于其它、第一和第二組分,并且類似地,其他列舉的或另外的組分也不同。
      [0057]用于本文時(shí),術(shù)語“癌癥”指的是哺乳動物中的所有類型的癌癥、腫瘤或惡性腫瘤,包括白血病、癌和肉瘤。不例性的癌癥包括腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、頭&頸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞性肺癌、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宮癌和髓母細(xì)胞瘤。另外的實(shí)例包括,霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、原發(fā)性腦瘤、原發(fā)性腦癌、惡性胰島瘤(malignant pancreatic insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、惡變前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、內(nèi)分泌和外分泌胰腺腫瘤以及前列腺癌。
      [0058]術(shù)語“白血病”廣義上指的是造血器官的進(jìn)行性惡性疾病,并且一般由血液和骨髓中白細(xì)胞和它們的前體的異常增殖和發(fā)育來表征。白血病通常在臨床上基于以下幾點(diǎn)進(jìn)行分類:(1)急性或慢性疾病的持續(xù)時(shí)間和特性;(2)涉及細(xì)胞的類型:骨髓細(xì)胞(骨髓內(nèi)產(chǎn)生的)、淋巴細(xì)胞(淋巴生成的)或單核細(xì)胞;和(3)白血病或非白血病(亞白血病)血液中異常細(xì)胞數(shù)量的增加或非增加。P388白血病模型能夠預(yù)測體內(nèi)抗白血病活性而被廣泛接受。認(rèn)為不管正在進(jìn)行治療的白血病的類型是什么,在P388測定中測試為陽性的化合物通常在體內(nèi)表現(xiàn)出一定水平的抗白血病活性。因此,本發(fā)明包括治療白血病的方法,以及,優(yōu)選地,治療以下類型白血病的方法:急性非淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、成人T-細(xì)胞白血病、白細(xì)胞不增多性白血病、非白血性白血病(aleukocythemic leukemia)、嗜堿性粒細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、牛白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚細(xì)胞性白血病、嗜酸性粒細(xì)胞性白血病、格羅斯白血病、多毛細(xì)胞白血病、成血性白血病、成血細(xì)胞性白血病、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白細(xì)胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、成淋巴性白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞白血病、巨核細(xì)胞白血病、小原粒性白血病、單核細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞性白血病、骨髓性粒細(xì)胞性白血病、粒單核細(xì)胞性白血病、內(nèi)格利白血病、漿細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、前髓細(xì)胞性白血病、里德爾細(xì)胞性白血病、席林白血病、干細(xì)胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細(xì)胞性白血病。
      [0059]術(shù)語“肉瘤”通常指的是由類似胚性結(jié)締組織的物質(zhì)組成的腫瘤并且通常由嵌入在纖維狀物質(zhì)或均一物質(zhì)中的緊密堆積的細(xì)胞組成??梢杂每鼓[瘤的硫醇結(jié)合的線粒體氧化劑和抗癌劑的結(jié)合來治療的肉瘤包括:軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy' s 肉瘤、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(Iiposarcoma)H泡狀軟組織肉瘤、成釉細(xì)胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠色瘤肉瘤、絨毛膜癌、胚胎性肉瘤、腎母細(xì)胞瘤(Wilms' tumor sarcoma)、子宮內(nèi)膜肉瘤、間質(zhì)肉瘤、尤因氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纖維細(xì)胞肉瘤、巨細(xì)胞肉瘤、粒細(xì)胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤、B細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤、淋巴瘤、T細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤、延森肉瘤、卡波西肉瘤、枯氏細(xì)胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉肉瘤、骨膜外肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、勞斯肉瘤、漿液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛細(xì)管擴(kuò)張性肉瘤。
      [0060]術(shù)語“黑色素瘤”指的是起源于皮膚和其他器官的黑素細(xì)胞系統(tǒng)的腫瘤??梢杂每鼓[瘤藥硫醇結(jié)合的線粒體氧化劑和抗腫瘤劑的結(jié)合治療的黑色素瘤包括:例如,肢端雀斑樣黑色素瘤、無黑色素黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克勞德曼黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、惡性雀斑樣黑色素瘤、惡性黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、指甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和淺表擴(kuò)張性黑色素瘤。
      [0061]術(shù)語“癌”指的是由易于浸潤周圍組織并產(chǎn)生轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞組成的惡性腫瘤(new growth) □可以用抗腫瘤藥硫醇結(jié)合的線粒體氧化劑和抗腫瘤劑的結(jié)合治療的示例性的癌包括,例如,腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、腺樣囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma)、基底細(xì)胞癌(carcinomabasocellulare)、基底細(xì)胞樣癌、基底鱗狀細(xì)胞癌、細(xì)支氣管肺泡癌、細(xì)支氣管癌、支氣管原癌、腦樣癌、膽管細(xì)胞癌、絨毛膜癌、膠體癌、粉剌狀癌、子宮體癌、篩形癌、胸廓癌、皮膚癌、柱狀癌、柱狀細(xì)胞癌、導(dǎo)管癌、硬癌、胚胎性癌、髓樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮細(xì)胞癌、夕卜植癌、潰痕性癌、硬癌(carcinoma fibrosum)、膠樣癌(gelatiniforni carcinoma)、膠樣癌(gelatinous carcinoma)、巨細(xì)胞癌(giant cell carcinoma)、巨細(xì)胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌、顆粒細(xì)胞癌、發(fā)母質(zhì)癌、多血癌、肝細(xì)胞癌、許特爾細(xì)胞癌、粘液癌、hypemephroid carcinoma,幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮內(nèi)癌、上皮內(nèi)癌、克羅姆佩柯赫爾癌(Krompecher' s carcinoma)、庫爾契茨基細(xì)胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細(xì)胞癌、豆?fàn)畎?lenticular carcinoma)、豆?fàn)畎?carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、軟癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、克魯肯伯格瘤(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麥細(xì)胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、乳頭狀癌、門脈周癌、浸潤前癌、鱗狀細(xì)胞癌(prickle cell carcinoma)、粉剌癌(pultaceous carcinoma)、腎細(xì)胞癌、備細(xì)胞癌、肉瘤樣癌、施奈德氏(Schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細(xì)胞癌、單純癌、小細(xì)胞癌、硬癌(solanoid carcinoma)、球形細(xì)胞癌、梭形細(xì)胞癌、髓樣癌(carcinoma spong1sum)、鱗狀癌、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)、繩捆癌、血管擴(kuò)張性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangiectodes)、移行細(xì)胞癌、結(jié)節(jié)性皮癌(carcinoma tuberosum)、結(jié)節(jié)性皮癌(tuberous carcinoma)、撫狀癌和域毛狀癌。
      [0062]本文中的“治療有效劑量或治療有效量”意指能產(chǎn)生給藥目的療效的劑量。準(zhǔn)確的劑量和制劑取決于治療的目的,并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)來確定(見,例如,Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms (vols.1-3, 1992) ;Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ;Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 20th Edit1n, Gennaroj Editor(2003),and Pickarj DosageCalculat1ns (1999))。
      [0063]術(shù)語“可藥用的鹽”或“可藥用的載體”意指包括依據(jù)本文所述的化合物中的具體的取代基,使用相對無毒的酸或堿而制備的活性化合物的鹽。當(dāng)本發(fā)明化合物含有相對酸性的官能度時(shí),可通過在凈相(neat)或在合適的惰性溶劑中將中性形式的這類化合物與足量的所需堿接觸在適合的惰性溶劑中接觸來獲得堿加成鹽??伤幱脡A加成鹽的實(shí)例包括:鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機(jī)胺鹽或鎂鹽、或相似的鹽。當(dāng)本發(fā)明化合物含有相對堿性的官能度時(shí),可通過在凈相或在合適的惰性溶劑中將中性形式的這類化合物的中性形式與足量的所需酸接觸來獲得酸加成鹽??伤幱盟峒映甥}的實(shí)例包括:衍生自無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫鹽(monohydrogencarbonic acid)、磷酸、磷酸氫鹽(monohydrogenphosphoric acid)、憐酸二氫鹽(dihydrogenphosphoric acid)、硫酸、硫酸氫鹽(monohydrogensulfuric acid)、氫碘酸或亞磷酸等的酸加成鹽;以及衍生自相對無毒的有機(jī)酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥拍酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等的鹽。也包括氨基酸的鹽例如精氨酸鹽等和有機(jī)酸的鹽例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(見,例如Berge等,Journalof Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977))。本發(fā)明某些特定的化合物同時(shí)含有使所述化合物轉(zhuǎn)換成堿加成鹽或酸加成鹽的堿性和酸性官能度。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他可藥用載體適用于本發(fā)明。
      [0064]I1.方法
      [0065]在一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括給予受試者重組報(bào)告性腺病毒。使所述重組報(bào)告性腺病毒能夠感染受試者中的癌細(xì)胞,由此形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。從所述受試者中獲得含有所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的樣品并檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。本文提供的重組報(bào)告性腺病毒是包含至少一個(gè)(例如,一個(gè))編碼報(bào)告蛋白質(zhì)的序列的重組腺病毒。重組報(bào)告性腺病毒的非限制性實(shí)例在表2和圖9中顯示。根據(jù)公開的申請PCT/US2011/048006中記載的方法形成本文(包括實(shí)施方案)提供的重組報(bào)告性腺病毒,所述申請為了所有目的全文納入本文。所述報(bào)告蛋白可以是熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白)或它可以是能被熒光標(biāo)記從而易于檢測的蛋白。可通過將熒光標(biāo)記的抗體與報(bào)告蛋白結(jié)合來實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中,所述重組報(bào)告性腺病毒包括可操作地與編碼熒光蛋白的核酸連接的巨細(xì)胞病毒啟動子。在一些其他實(shí)施方案中,所述熒光蛋白為綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中,所述重組報(bào)告性腺病毒包括可操作地與編碼熒光蛋白的核酸連接的E2F啟動子。在一些其他實(shí)施方案中,所述突光蛋白為紅色突光蛋白。在一些實(shí)施方案中,所述重組報(bào)告性腺病毒包括可操作地與編碼熒光蛋白的核酸連接的SRE啟動子。在一些其他實(shí)施方案中,所述熒光蛋白為黃色突光蛋白。在一些實(shí)施方案中,所述重組報(bào)告性腺病毒包括可操作地與編碼突光蛋白的核酸連接的SMAD-應(yīng)答啟動子。在一些其他實(shí)施方案中,所述熒光蛋白為紅色熒光蛋白。
      [0066]在另一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品。將重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒能夠感染癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞,檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。在一些實(shí)施方案中,根據(jù)本文提供的方法的檢測包括檢測報(bào)告基因的表型。在一些其他實(shí)施方案中,所述報(bào)告基因表型為熒光報(bào)告基因表型。當(dāng)用本文提供的重組報(bào)告性腺病毒感染細(xì)胞(例如,癌細(xì)胞)時(shí),用足以表達(dá)報(bào)告表型的量的重組報(bào)告性腺病毒感染所述細(xì)胞。
      [0067]在另一方面,提供了測定測試化合物是否抑制來自癌癥患者的癌細(xì)胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品。將重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒能夠感染癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞能夠有足夠的時(shí)間生長。測定所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的生長水平并將所述水平與對照水平相比,其中和對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的癌細(xì)胞的生長。本文提供的對照水平是在沒有所述測試化合物存在的條件下癌細(xì)胞的生長水平。
      [0068]在一些實(shí)施方案中,根據(jù)本文提供的方法的癌癥是肺癌、皮膚癌或乳腺癌。在其他實(shí)施方案中,根據(jù)本文提供的方法的癌細(xì)胞是循環(huán)癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中,所述癌細(xì)胞是惡變前細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中,根據(jù)本文提供的方法的樣品是體液。在一些其他實(shí)施方案中,所述體液為血液。在其他實(shí)施方案中,所述體液為血清或血漿。在其他實(shí)施方案中,所述體液為尿液、唾液、肺組織、支氣管肺泡灌洗樣品或呼出氣冷凝物。
      [0069]在另一方面,提供了分離來自受試者的樣品中報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的方法。所述方法包括將所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞與未感染細(xì)胞分離,其中所述分離至少部分基于所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的表達(dá)的報(bào)告基因表型。在一些實(shí)施方案中,所述報(bào)告基因表型是熒光活性的水平。在其他實(shí)施方案中,所述報(bào)告基因表型是細(xì)胞生長的水平。在其他實(shí)施方案中,所述報(bào)告基因表型是異常細(xì)胞形態(tài)的水平。在一些實(shí)施方案中,所述方法進(jìn)一步包括使得所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞能夠有足夠的時(shí)間去生長,從而表達(dá)所述表達(dá)的報(bào)告基因表型。在一些實(shí)施方案中,所述未感染細(xì)胞是非癌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中,所述樣品為血液樣品。
      [0070]在另一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括將本文(包括其實(shí)施方案)提供的重組報(bào)告性腺病毒給予受試者。使所述重組報(bào)告性腺病毒能夠感染所述受試者中的癌細(xì)胞,從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。從含有所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的受試者中獲得樣品,并檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      [0071]在另一方面,提供了檢測受試者中癌癥的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品。將本文(包括其實(shí)施方案)提供的重組報(bào)告性腺病毒與癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒能夠感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞,檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。在一些實(shí)施方案中,所述方法進(jìn)一步包括給予所述受試者癌癥治療。
      [0072]提供了測定測試化合物是否抑制來自癌癥患者的癌細(xì)胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品以及將本文(包括其實(shí)施方案)提供的重組報(bào)告性腺病毒與癌細(xì)胞接觸。使所述重組報(bào)告性腺病毒能夠感染癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞。使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞能夠有足夠的時(shí)間去生長并測定所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的生長水平,將所述水平與對照水平相比,其中與對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的癌細(xì)胞的生長。
      [0073]II1.組合物
      [0074]本文特別提供了用于癌細(xì)胞的診斷和檢測的重組報(bào)告性腺病毒。在一方面,提供了含有癌細(xì)胞報(bào)告模塊和癌細(xì)胞結(jié)合模塊的重組報(bào)告性腺病毒。本文提供的癌細(xì)胞報(bào)告模塊包括編碼報(bào)告蛋白的報(bào)告基因。所述報(bào)告蛋白可以是熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白)或它可以是能被熒光標(biāo)記從而易于檢測的蛋白。可通過將熒光標(biāo)記的抗體與報(bào)告蛋白結(jié)合來實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記。本文提供的癌細(xì)胞結(jié)合分子是能夠結(jié)合由癌細(xì)胞表達(dá)的分子的分子(例如,細(xì)胞受體)。所述細(xì)胞結(jié)合分子可以是小分子或蛋白。在一些實(shí)施方案中,所述癌細(xì)胞報(bào)告模塊包括可操作地與報(bào)告基因連接的癌癥應(yīng)答啟動子。本文提供的癌癥應(yīng)答啟動子是在癌細(xì)胞中具有活性的啟動子,其中所述活性是可檢測地不同于非癌細(xì)胞中所述啟動子的活性。在一些實(shí)施方案中,與所述啟動子在非癌細(xì)胞中的活性相比,所述活性降低。在其他實(shí)施方案中,與所述所述啟動子在非癌細(xì)胞中的活性相比,所述活性增加。在一些其他實(shí)施方案中,所述報(bào)告基因是熒光報(bào)告基因。
      [0075]在一些實(shí)施方案中,所述重組腺病毒還包含免疫逃避模塊。本文提供的免疫逃避模塊是蛋白質(zhì)或多肽,如果所述重組報(bào)告性腺病毒表達(dá)了所述蛋白質(zhì)或多肽,則其防止所述重組報(bào)告性腺病毒被癌癥患者的免疫系統(tǒng)檢測。
      [0076]在一些實(shí)施方案中,所述癌細(xì)胞報(bào)告模塊是第一癌細(xì)胞報(bào)告模塊,所述重組報(bào)告性腺病毒還包括第二癌細(xì)胞報(bào)告模塊和第三癌細(xì)胞報(bào)告模塊。在一些實(shí)施方案中,所述第一癌細(xì)胞報(bào)告模塊能表達(dá)第一報(bào)告基因表型,所述第二癌細(xì)胞報(bào)告模塊能表達(dá)第二報(bào)告基因表型,所述第三癌細(xì)胞報(bào)告模塊能表達(dá)第三報(bào)告基因表型。在一些其他實(shí)施方案中,所述第一報(bào)告基因表型、第二報(bào)告基因表型和第三報(bào)告基因表型均為可檢測地不同的。在一些實(shí)施方案中,所述第一報(bào)告基因表型指不第一癌癥,第二報(bào)告基因表型指不第二癌癥,第三報(bào)告基因表型指示第三癌癥。在一些其他實(shí)施方案中,所述第一癌癥、所述第二癌癥和所述第三癌癥各自不同。在一些實(shí)施方案中,第一報(bào)告基因表型、第二報(bào)告基因表型和第三報(bào)告基因表型指不單一癌癥。
      [0077]IV.試劑盒
      [0078]在另一方面,提供了用于檢測癌癥的試劑盒。所述試劑盒包括本文(包括其實(shí)施方案)提供的重組報(bào)告性腺病毒。在一些實(shí)施方案中,所述試劑盒包括用于從來自受試者的組織或細(xì)胞樣品中分離細(xì)胞(例如,潛在的癌細(xì)胞)的試劑,例如本文描述的那些(例如磁珠或其他基于親和性的分離材料,貯存緩沖液等)。因此,所述試劑盒可包括能夠與至少一種細(xì)胞特異性的標(biāo)記物特異性結(jié)合的抗體或其他試劑。所述試劑盒也可包括用于在處理和檢測過程中盛裝樣品的試管或其他容器。所述試劑盒還包括在適于感染細(xì)胞和檢測細(xì)胞的條件下將所述重組報(bào)告性腺病毒給予所述患者的說明書。
      [0079]在另一方面,提供了用于篩選癌癥藥物的試劑盒。所述試劑盒包括癌癥抑制性化合物和本文(包括其實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒。在一些實(shí)施方案中,所述試劑盒包括用于給藥癌癥抑制性化合物的試劑(例如貯存緩沖液)和用于檢測報(bào)告基因表型的桌面檢測設(shè)備。
      [0080]在另一方面,提供了用于分離癌細(xì)胞的試劑盒。所述試劑盒包括用于檢測表達(dá)的報(bào)告基因表型的裝置和本文(包括其實(shí)施方案)中提供的重組報(bào)告性腺病毒。在一些實(shí)施方案中,所述試劑盒包括用于從來自受試者的組織或細(xì)胞樣品中分離癌細(xì)胞的試劑,例如本文描述的那些(例如磁珠或其他基于親和性的分離材料,貯存緩沖液等)。因此,所述試劑盒可包括能夠與至少一種癌細(xì)胞特異性標(biāo)記物特異性結(jié)合的抗體或其他試劑。所述試劑盒也可包括用于在處理和檢測過程中盛裝樣品的試管或其他容器。所述試劑盒還包括在適于感染癌細(xì)胞和檢測癌細(xì)胞的條件下將所述重組報(bào)告性腺病毒給予所述患者的說明書。
      [0081]V.
      【具體實(shí)施方式】
      [0082] 申請人:意欲開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化自動平臺,所述標(biāo)準(zhǔn)化自動平臺能夠在分子混合和預(yù)后能力的水平上提供床旁檢測診斷以告知臨床決定,而這一點(diǎn)在任何其它的檢測系統(tǒng)、生物標(biāo)記物或相關(guān)的基因表達(dá)譜中是不可能做到的。已經(jīng)開發(fā)了一種從血液中檢測、計(jì)數(shù)、表征和分離有活力的CTC的無創(chuàng)性測試。該測試警告臨床醫(yī)生源自原發(fā)病灶的癌癥的存在或進(jìn)展,同時(shí)告知關(guān)于根據(jù)循環(huán)癌細(xì)胞的數(shù)目性質(zhì)和由遺傳畸變失調(diào)的腫瘤途徑來確定應(yīng)該用多大的力度來治療患者的臨床決策。此外,使用由技術(shù)員操作的快速經(jīng)濟(jì)的自動平臺,基于有力的轉(zhuǎn)錄報(bào)告分子和分子標(biāo)記,可確定哪條關(guān)鍵的癌癥途徑失調(diào)。可以分離、捕獲所述CTC,并將其直接用于檢測它們對不同的潛在治療方案應(yīng)答的能力以及它們告知關(guān)于哪一種治療選擇最可能獲得最大功效的臨床醫(yī)師決策的能力。
      [0083]通過熒光蛋白讀出數(shù)據(jù)來提供關(guān)于腫瘤途徑的定量和定性數(shù)據(jù)的病毒載體
      [0084]目前在腫瘤基因組中已經(jīng)鑒定出100,000種以上的突變(Stratton MR, CampbellPJ, Futreal PA, Nature.2009 ;458(7239):719-24.19360079)其中至少 350 個(gè)基因表現(xiàn)為頻發(fā)突變(Futreal PA 等人,Nat Rev Cancer,.2004 ;4(3): 177-83.14993899)。盡管這是新的遺傳學(xué)知識,癌癥患者的診斷、預(yù)后和治療仍然主要依賴于主觀組織病理學(xué)、轉(zhuǎn)變的替代性生物標(biāo)記物、可變的表面標(biāo)記物或相關(guān)的基因表達(dá)譜。隨著NDA測序的發(fā)展,不久可能會對每一個(gè)癌癥患者的腫瘤進(jìn)行測序。然而,即使這種情況有可能,但是這些數(shù)據(jù)也不會顯示癌癥微環(huán)境內(nèi)的決定腫瘤表型的表觀遺傳修飾和關(guān)鍵相互作用,或者也不能使人們預(yù)測這些因子如何相互作用以測定患者的臨床結(jié)果或患者腫瘤對于不同治療的應(yīng)答。
      [0085]盡管癌癥具有復(fù)雜性和遺傳變異性,但是所有的癌癥都具有決定它們惡性潛能的表型,即所謂的“癌癥標(biāo)志”,這是相對少數(shù)關(guān)鍵途徑中發(fā)生突變的結(jié)果。(圖1,(HanahanD, Weinberg RA, Cell, 2000 ; 100 (I): 57-70.10647931))。在各個(gè)腫瘤中,盡管使這些途徑失調(diào)的突變有所不同,但都聚集在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄元件和效應(yīng)因子的下游。例如,RTKs, RAS, PTEN、P1-3K或RAF中的突變可導(dǎo)致腫瘤能夠足以依靠自身來完成生長因子信號傳導(dǎo),而RB本身的突變、P16的缺失(點(diǎn)突變和表觀遺傳沉默)或細(xì)胞周期蛋白的過表達(dá)可使RB腫瘤抑制因子途徑失活(Du ff, Searle JS, Curr Drug Targets, 2009 ;10(7):581-9.19601762 ;Sherr CJ, Cel,2004 ;116(2):235-46.14744434;Rossi DJ,Weissman IL,Cell, 2006 ;125(2):229-31.16630811 ;Gazdar AF, Oncogene, 2009 ;28 Suppl 1:S24-31.19680293 ;Yuan TL, Cantley LC, Oncogene,.2008 ;27 (41): 5497-510.18794884)。所述突變的獲得和它們產(chǎn)生的表型特征的獲得不是同時(shí)發(fā)生的,但是經(jīng)常經(jīng)過進(jìn)展階段并且發(fā)生在很長的一段時(shí)間內(nèi)??墒褂没谠\斷性的轉(zhuǎn)錄報(bào)告分子和細(xì)胞的測定來從功能上測定這些關(guān)鍵分子活性的失調(diào)程度。例如,Rb或pl6中的突變導(dǎo)致E2F驅(qū)動的啟動子的激活(Du ff, SearleJS,Curr Drug Targets, 2009 ; 10 (7):581-9.19601762 ;SherrCJ, Cel,2004 ; 116 (2):235-46.14744434)。類似地,SMAD的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的定位指示TGF β途徑的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)移(Shi Y, Massague J.,Cell, 2003 ;113(6):685-700.12809600)。在基礎(chǔ)研究和藥物篩選應(yīng)用中,將這些基于轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞的熒光定位的讀出結(jié)果用作腫瘤途徑活性的報(bào)告分子。
      [0086] 申請人:沒有將重心放在檢測大量且在腫瘤之間高度可變的單個(gè)基因損傷上,而是構(gòu)建了病毒診斷性靶標(biāo)(drones),所述病毒診斷性靶標(biāo)(drones)將多種轉(zhuǎn)錄模塊和分子模塊整合到其基因組中以檢測患者的腫瘤,報(bào)告腫瘤的分子“標(biāo)記”以及其早期對不同治療的反應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)這一目的, 申請人:開發(fā)了變形的新技術(shù)平臺,所述技術(shù)平臺是 申請人:近期開發(fā)的用來構(gòu)建新一代腫瘤選擇性復(fù)制腺病毒(O' Shea CC, Oncogene, 2005 ;24(52):7636-9.16299525 ;0' Shea CC.,Oncogene, 2005 ;24(52):7640-55.16299526)。腺病毒是天然多基因表達(dá)載體,其能夠在轉(zhuǎn)染一小時(shí)內(nèi)到達(dá)細(xì)胞核(O' Shea CC, Oncogene, 2005 ;
      24(52):7636-9.16299525 ;0 ' Shea CC.,Oncogene, 2005 ;24 (52):7640-55.16299526 ;Leopold PL, Crystal RG, Adv Drug Deliv Rev., 2007 ;59(8):810-21.17707546) ? 申請人:的‘Adsembly’使得從來自于基因組構(gòu)建部件(構(gòu)建于具有與Ad2/5不同趨向性和特性或者已經(jīng)被遺傳修飾以賦予改變的功能的60個(gè)以上的人和動物腺病毒)和外源元件的文庫在體外快速從頭裝配自定義的腺病毒基因組(圖2) (O' Shea CC, Oncogene, 2005 ;24(52):7636-9.16299525)。 申請人:已經(jīng)使用該技術(shù)構(gòu)建了 60個(gè)以上具有多種突變和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的新病毒,并且已經(jīng)表明使用該方法構(gòu)建的病毒能夠進(jìn)行高效價(jià)生長。
      [0087]E1、E2和E3區(qū)域不是培養(yǎng)中復(fù)制所必需的或者其可由可獲得的細(xì)胞系補(bǔ)充(Goncalves MA, de Vries AA,Rev Med Virol.,2006 ; 16 (3): 167-86.16710837)。這些區(qū)域中的每一個(gè)都具有獨(dú)立的啟動子元件,所述啟動子元件通過選擇性剪接來驅(qū)動多種基因產(chǎn)物(16種基因)的表達(dá)。 申請人:將這開發(fā)為一個(gè)系統(tǒng),用來改造(engineer)單個(gè)的有效診斷劑,所述診斷劑包括對不同癌癥樣品中的失調(diào)的途徑活性進(jìn)行多路定量測量(表I)。將所述天然病毒啟動子用在含有關(guān)鍵突變/表型的癌癥中激活的啟動子替換。這些啟動子驅(qū)動4種不同的熒光報(bào)告基因融合蛋白的表達(dá),所述熒光報(bào)告基因融合蛋白提供關(guān)于患者腫瘤中失調(diào)的關(guān)鍵途徑的額外的信息,例如,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的NF-κ B(發(fā)炎)、T0RC2 (LKBI 突變和代謝)、F0X0 (PI3-K/AK 突變)或者 SMAD 4 (TGF β 途徑突變)(ShiY, Massague J., Cell,2003 ;113 (6):685-700.12809600 ;0eckinghaus A,Ghosh S., ColdSpring Harb Perspect B1l.,2009 ;1 (4):a000034.20066092 ;ffullschleger S,LoewithR,Hall MN, Cell, 2006 ;124(3):471-84.16469695 ;ffeidinger C et al., Endocr RelatCancer, 2008 ;15(4):917-29.18775975)。使用這些試劑,任何給定腫瘤的分子損傷和惡性特征可被快速識別(24小時(shí)以內(nèi))并可通過NanoSortlab-on-a-chip μ FACS來評分。另夕卜,這些試劑也能作為報(bào)告分子被用于快速且直接地檢測患者的腫瘤是否可能對具體治療產(chǎn)生反應(yīng)。 申請人:的技術(shù)在幾個(gè)重要方面對之前記載的基于病毒的CTC檢測方法(Fong SM等人,Surgery, 2009 ;146 (3):498-505.19715807 ;Kojima T 等人,J Clin Invest., 2009 ;119(10):3172-81.19729837)進(jìn)行了改進(jìn)。通過使用“Adsembly”,可構(gòu)建腫瘤應(yīng)答熒光元件的文庫。Adsembly可實(shí)現(xiàn)多種特制的用于特定類型腫瘤和途徑突變檢測的腺病毒的快速構(gòu)建。Adsembly還使得能夠簡化腺病毒的重定向,因此使CTC轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)會最大。最后,Adsembly使得容易從不同基因組模塊進(jìn)行多基因表達(dá),所述多基因表達(dá)增加了在CTC檢測過程中可獲得的信息量。
      [0088]Lab-On-A-Chip 技術(shù)
      [0089]已經(jīng)提出了改善CTC計(jì)數(shù)和捕獲的方法,并且已經(jīng)證明流式細(xì)胞術(shù)是成功的(Allan AL, Keeney Μ.,J Oncol.,2010 ;2010:426218.20049168)。流式細(xì)胞術(shù)可在多種參數(shù)下進(jìn)行快速卻高度特異的定量的逐個(gè)細(xì)胞分析,以及能夠?qū)TC進(jìn)行分選用于進(jìn)一步的分子表征。另外,流式細(xì)胞術(shù)是成熟的、公認(rèn)的、具有商業(yè)可行性的技術(shù)。然而,多種障礙使得目前的流式細(xì)胞術(shù)在CTC的床旁檢測(point-of-care)分析中不實(shí)用。首先,必須通過人工將各個(gè)抗體移液到細(xì)胞樣品中來對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。由于抗體處理、移液不準(zhǔn)確、儲存的不一致、抗體批次的差異,該過程可能會導(dǎo)致數(shù)據(jù)方面產(chǎn)生較大差異。第二,目前的流式細(xì)胞儀很昂貴而且具有較大的占地面積(即,不可移動)。最后,目前的流式細(xì)胞儀在進(jìn)行操作時(shí)在技術(shù)上和分析上都具有挑戰(zhàn)性。
      [0090]為了解決這些技術(shù)問題, 申請人:已經(jīng)開發(fā)了將微流體(microfIuidics)、光電子學(xué)(photonics)、微聲學(xué)(microacoustics)與創(chuàng)新性的分析技術(shù)結(jié)合在一起的lab-on-a-chip技術(shù)。這些由NanoSort.1nc授予獨(dú)占許可的專利技術(shù)能通過堅(jiān)固、便攜的、便宜的裝置使得流式細(xì)胞術(shù)能進(jìn)行床旁檢測(point-of-care),所述技術(shù)僅以當(dāng)前工業(yè)翹楚的幾分之一的成本和空間滿足或超出當(dāng)前工業(yè)翹楚的性能(Cho SH, Chen CH, TsaiFS,Godin JM, Lo YH, Lab Chip., 2010 ; 10 (12):1567-73.20379604 ;Cho SH et al., ConfProc IEEE Eng Med B1l Soc., 2009 ;2009:1075-8.19965141 ;Chen CH 等人,B1medMicrodevices, 2009 ;11 (6): 1223-31.19649710 ;Chen CH,等人,In:Hawkins AR, editor.Handbook of Optofluidics: CDC Press ;2010.p.664 ;Godin J,Lo YH, B1med OptExpress, 2010 ;1 (5): 1472-9.21258563)。
      [0091]基于病毒的檢測器和診斷介導(dǎo)的CTC的熒光顯示
      [0092] 申請人:構(gòu)建了一系列替換病毒E1、E3和E4轉(zhuǎn)錄單元的腫瘤途徑活性模塊,已將使用另外的修飾將所述模塊重新組裝到病毒骨架中,以賦予新的組織嗜性和其他活性。已經(jīng)在人腫瘤細(xì)胞系(其具有已知的表型/突變)以及原代細(xì)胞中驗(yàn)證了這些病毒診斷試劑,并且已經(jīng)在培養(yǎng)物和人血液樣品中都得到了證實(shí)。
      [0093]第一組診斷性腺病毒已經(jīng)被改造以表達(dá)四種不同的熒光生物標(biāo)記物,所述熒光生物標(biāo)記物被用來診斷具有在RB/pl6、TGF0、生長因子/P1-3K/Ras/MAPK、LKBl/AMPK途徑中的突變的腫瘤細(xì)胞,不僅對所述腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記為了檢測和收集,還確定所述腫瘤細(xì)胞的惡化潛能和其對治療的反應(yīng)。來自Sanger中心和Cosmic數(shù)據(jù)庫的最新數(shù)據(jù)顯示EGFR在28% 的腫瘤中增加 / 突變,RB (12% ),pl6(13% ), Ras(17% ), LKBl (9% ), SMAD4(2% )。該方法的可行性已經(jīng)通過以下證明:使用這類腫瘤特異性啟動子用于開發(fā)溶瘤病毒,以選擇性地誘導(dǎo)病毒基因在癌癥中的表達(dá),從而確保腫瘤進(jìn)行選擇性病毒復(fù)制(O' SheaCC,Oncogene, 2005 ;24(52):7636-9.16299525:0 ' Shea CC.,Oncogene, 2005 ;24(52):7640-55.16299526 ;Huang TG et al., Gene Ther.,2003 ; 10 (15):1241-7.12858189 ;McCormick F., Cancer B1l Ther., 2003 ;2 (4Suppl I):S157-60.14508094 ;RiesSJ, Brandts CH, Drug Discov Today, 2004 ;9(17):759-68.15450242 ;Ch1cca EA, Nat RevCancer, 2002 ;2(12):938-50.12459732)。
      [0094]例如,來自健康女性的乳腺組織含有不同的人乳腺上皮細(xì)胞(vHMEC)的亞群,在所述人乳腺上皮細(xì)胞亞群中pl6INK4a是表觀遺傳沉默的(Holst CR, Cancer Res., 2003 ;63(7):1596-601.12670910)并且所述人乳腺上皮細(xì)胞亞群被認(rèn)為代表了乳腺癌惡變前的前體(Tlsty TD, J Mammary Gland B1l Neoplasia, 2004 ;9(3):263-74.15557799 ;Crawford YG 等人,Cancer Cell, 2004 ;5 (3):263-73.15050918 ;Romanov SR 等A, Nature, 2001 ;409(6820):633-7.11214324)。在圖 3 中, 申請人:表明,其中天然 El 啟動子被細(xì)胞 E2F 啟動子(Johnson L 等人,Cancer Cell, 2002 ;1(4):325-37.12086848)替換的病毒特異性地驅(qū)動vHMEC和HMEC中下游病毒蛋白的表達(dá)。 申請人:使用類似的策略檢測和分離CTC,但是使用了不能復(fù)制的病毒,其中病毒基因現(xiàn)在被熒光標(biāo)記物替換,這使得能夠使用整合的lab-on-a-chip μ FACS對CTC進(jìn)行檢測、定量和分選。
      [0095]為了達(dá)到此目的,將病毒“E1”模塊啟動子和開放閱讀框用E2F啟動子替換,所述E2F啟動子能夠驅(qū)動T0RC2-eYFP融合蛋白。這樣能夠鑒定在pRb/pl6途徑和LKBl中有突變的細(xì)胞。用兩種盒子替換病毒“E3”模塊啟動子和開放閱讀框。由血清應(yīng)答元件(SRE)調(diào)控的CMV啟動子能夠驅(qū)動mCherry,從而鑒定EGFR/RAS/RAF/MAPK途徑的高度激活,TGF β調(diào)控的啟動子能夠驅(qū)動mOrange,從而鑒定具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞。病毒“E4”模塊啟動子和開放閱讀框被驅(qū)動eGFP-FOXO的CMV主要IE啟動子替換,所述eGFP-FOXO在幾乎所有的細(xì)胞中表達(dá)并且既可以作為標(biāo)準(zhǔn)化熒光的方法也可以作為鑒定在PTEN/P1-3K/AKT途徑中有突變的細(xì)胞的方法。
      [0096]為了確保CTC感染, 申請人:還引入了新創(chuàng)新。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Ad5是用于基礎(chǔ)和臨床研究中的最主要的腺病毒。Ad5的細(xì)胞受體是和E-鈣黏蛋白一起標(biāo)記上皮細(xì)胞的CAR。然而,CAR的表達(dá)經(jīng)常在正在進(jìn)行上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的細(xì)胞中下調(diào),例如這種現(xiàn)象可能發(fā)生在轉(zhuǎn)移過程中。為了感染和檢測這些細(xì)胞, 申請人:已經(jīng)構(gòu)建和驗(yàn)證了幾種結(jié)合到不同細(xì)胞受體(例如CD46)的尾絲假型病毒,從而使CTC轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能性最大(表2)。
      [0097]已經(jīng)在在原代肺和乳腺上皮細(xì)胞以及一組含有已知分子損傷的肺和乳腺癌細(xì)胞系中對該最初的一系列五種病毒(每種都祀向一種可選的受體但是都含有相同的表達(dá)盒)進(jìn)行了檢驗(yàn)(Neve RM 等,Cancer Cell, 2006 ; 10 (6): 515-27.17157791)。在 MOI=30下用所述五種病毒的每一種轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞24小時(shí),接著用FACS和顯微鏡進(jìn)行熒光檢測。證實(shí)了在培養(yǎng)物中腫瘤的選擇性基因表達(dá)之后, 申請人:優(yōu)化了人血液樣品情況中的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。之前已經(jīng)證明能復(fù)制的腺病毒載體(Kojima T et al., J Clin Invest., 2009 ;119(10):3172-81.19729837)和復(fù)制缺陷型腺病毒載體(Lyons M et al.,MolTher.,2006 ; 14 (I): 118-28.16580883)都能轉(zhuǎn)導(dǎo)全血樣品中的細(xì)胞(包括摻有腫瘤細(xì)胞的樣品)。將7.5 ml從血庫中獲得的失效的全血(expired whole blood)用含有氯化銨的紅細(xì)胞裂解緩沖液處理。接著以1、10、100或1000個(gè)細(xì)胞/ml血液的濃度向所述樣品中摻入肺癌細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞(Punnoose EA等,PLoS ONE.2010 ;5 (9): el2517)。摻入原代肺或乳腺上皮細(xì)胞作為副對照。對兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)方案進(jìn)行檢測。在一種情形中,將細(xì)胞沉淀并以每種病毒14UO5和16 PFU的濃度將五種病毒的混合物加入到樣品中。在第二種情形下,不沉淀細(xì)胞而將病毒加入到全血中。加入病毒以后,將細(xì)胞在37°C下振蕩孵育16或24小時(shí),離心收集,用PBS洗滌2次,并通過μ FACS分選。
      [0098]用于CTC 分離的 NanoSort-UCSD 臺式 μ FACS
      [0099]NanoSort使用由一些NIH NCRR資助部分支持的來自Yuhwa Lo ’ sUCSD實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)開發(fā)了唯一的全功能lab-on-a-chip微型熒光激活細(xì)胞分選器(μ FACS)原型(ChoSH, Chen CH, Tsai FS,Godin JM, Lo YH, Lab Chip.,2010 ; 10 (12):1567-73.20379604 ;Cho SH 等人,Conf Proc IEEE Eng Med B1l Soc., 2009 ;2009:1075-8.19965141 ;Chen CH 等人,B1med Microdevices, 2009 ;11(6):1223-31.19649710 ;Chen CH 等A , In:Hawkins AR, editor.Handbook of Optofluidics:CDC Press ;2010.ρ.664)。所述lab-on-a-chip μ FACS使用了用于熒光和散射檢測的芯片光學(xué)波導(dǎo)和獨(dú)特設(shè)計(jì)的時(shí)空編碼的結(jié)構(gòu)。光學(xué)詢問后,所述裝置使用整合的壓電磁盤驅(qū)動器通過轉(zhuǎn)移有限體積(10pL到InL)的流體來分選單個(gè)細(xì)胞。圖4示出了在檢測點(diǎn)處的來自光倍增管(PMT)的典型的時(shí)空編碼的熒光信號(1110),短時(shí)間后接著進(jìn)行另一個(gè)時(shí)空編碼的熒光信號(1011),由此來確認(rèn)成功的分選(Cho SH 等人,Conf Proc IEEE Eng Med B1l Soc., 2009 ;2009:1075-8.19965141 ;Godin J, J B1photonics., 2008 ; I (5): 355-76.19343660)。該裝置具有以下獨(dú)特特征:確認(rèn)單獨(dú)分選事件的成功以及確保滯留每個(gè)CTC。所述檢測信號(編碼為1110)應(yīng)該記錄而隨后的(1011)信號沒有記錄,該系統(tǒng)立刻檢測到CTC已經(jīng)離開了分選器。在這種情況下,用戶可以選擇第二次處理樣品以捕獲CTC。
      [0100]圖5示意性地示出了所述壓電分選器的原理和該芯片分選器如何有效地轉(zhuǎn)換(switch)液流。本文所示的液流轉(zhuǎn)換速度受限于 申請人:的CCD攝像機(jī)的速度,因此實(shí)際的液流轉(zhuǎn)換速度從而分選速度在實(shí)際中要快幾倍。圖6顯示了細(xì)胞分選的結(jié)果同時(shí)表I總結(jié)了 NanoSort-UCSD的μ FACS和BD的Mo-Flow系統(tǒng)之間的比較。使用μ FACS系統(tǒng), 申請人:完成了 CTC的計(jì)數(shù)和分離。
      [0101]FACS (熒光激活的細(xì)胞分選)被用作用于CTC計(jì)數(shù)和分離的基本模型,所述模型具有修飾和優(yōu)化的lab-on-chip設(shè)計(jì)。這些修飾包括所述壓電分選器和微流體流動限制的設(shè)計(jì)。和目前的優(yōu)化速度而非特異性的設(shè)計(jì)不同,優(yōu)化的分選使用了使收集效率最大化以確保能夠分選每個(gè)單個(gè)CTC的設(shè)計(jì)。關(guān)于流動限制,目前的設(shè)計(jì)使用了鞘流(sheath flow)以產(chǎn)生側(cè)流限制,還使用了由Naval研究實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的“人字形式樣”以實(shí)現(xiàn)在橫向方向上的流動限制(Howell PB, Jr.,Lab Chip, 2008 ;8(7): 1097-103.18584084)。然而,由于大的懸浮細(xì)胞(例如,CTCs)具有較強(qiáng)升力,因此“人字形”設(shè)計(jì)對其不太有效(Godin J.整合微流體的光學(xué)系統(tǒng).La Jolla:University of California, San Diego ;2010)。 申請人:會研究并優(yōu)化可選的流動限制設(shè)計(jì)(例如,利用彎曲通道中的慣性力和偏心力(Bhagat A等人,微流體和納米流體,2009 ;7(2):217-26 ;Bhagat AAS 等人,流體物理,2008 ;20 (10): 101702-4 ;Di Carlo D 等人,Anal Chem, 2008 ;80 (6): 2204-11.18275222 ;Di Carlo D 等人,Proc NatlAcad Sci U S A, 2007 ; 104 (48): 18892-7.18025477))來改善 CTC 限制并聚焦在流動流中。流動流中改善的CTC限制降低了熒光和散射信號的變異系數(shù)(CV),這能夠降低計(jì)數(shù)誤差。
      [0102]使用NanoSort裝置測試樣品。 申請人:接著使用商品流式細(xì)胞儀(例如,F(xiàn)ACSAria, BD)來測量“收集的樣品”和“廢液”中的細(xì)胞濃度。收集的樣品和廢液間的細(xì)胞比率顯示了計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性和分選效率
      [0103]結(jié)合使用腫瘤選擇性突光病毒載體和μ FACS以檢測和分離來自臨床血液樣品的CTC
      [0104]為了驗(yàn)證腫瘤特異性熒光病毒載體和μ FACS技術(shù)在臨床樣品中的應(yīng)用, 申請人:從來自于UCSD Moore癌癥中心的來自IV期非小細(xì)胞肺癌患者中獲取外周血樣品。該特定的腫瘤對 申請人:的病毒很合適,因?yàn)樵撃[瘤是上皮來源的(CD45-、EpCAM+和細(xì)胞角蛋白8和18+、和/或細(xì)胞角蛋白19+)并且可以使用CellSearch CTC平臺(Veridex)對其進(jìn)行檢驗(yàn)。另外,該腫瘤尤其適用于 申請人:的病毒,因?yàn)樵撃[瘤是幾種不同的人腺病毒的天然和主要靶標(biāo)。將7.5 ml全血收集在肝素化試管中,并用含有氯化銨的紅細(xì)胞裂解緩沖液處理。接著將五種病毒的混合物加入到樣品中并在37°C下振蕩孵育24小時(shí)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后,將細(xì)胞以100xg進(jìn)行沉淀、用PBS洗滌兩次并通過μ FACS進(jìn)行分選。收集在背景上發(fā)熒光的細(xì)胞用于進(jìn)一步的顯微鏡處理。 申請人:會確定用來診斷癌癥標(biāo)志的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染色(圖7和8)。
      [0105]將所述NanoSort實(shí)驗(yàn)方案和最好的用于檢驗(yàn)的可商購的系統(tǒng)CellSearch (Veridex)進(jìn)行比較。兩種方法都分析7.5mL血液。將由臨床實(shí)驗(yàn)室(ApoCell、Houston、TX)進(jìn)行CellSearch。對結(jié)果進(jìn)行分析、由小組進(jìn)行討論并準(zhǔn)備公布在同行評議的出版物中。
      [0106]V1.實(shí)驗(yàn)步驟
      [0107]所有的載體都是在Ad5 Adsembly載體的基礎(chǔ)上操作而來。
      [0108]Δ El {SREp-YFP} - {CMVp- [Foxo3-GFP]}質(zhì)粒的構(gòu)建
      [0109]通過PCR得到質(zhì)粒pENTR Ad5 Δ El CMV-GFP的骨架。該片段含有具有驅(qū)動eGFP的CMV啟動子的插入片段的Ad5基因組(GenBank登錄號AC_000008/G1:56160529F)的376-3514位的刪除。通過PCR從質(zhì)粒pSRE_luc上得到SRE啟動子,并通過PCR從質(zhì)粒P⑶NA3上得到BGH多腺苷酸化信號。使用序列和連接非依賴性克隆(SLIC)將SRE啟動子和BGH多聚A結(jié)合到pENTR Ad5AEl CMV-GFP骨架中以構(gòu)建質(zhì)粒pENTR Ad5AElSREp-CMV-GFP。這也在SRE啟動子和BGH多聚A信號之間產(chǎn)生了 PacI限制性酶切位點(diǎn)。通過 PCR 從 Ultimate ORF Collect1n (Invitrogen)中的含有 Foxo3 的 cDNA 的質(zhì)粒上得到Foxo3 cDNA。通過SLIC將其直接融合到通過PCR獲得的質(zhì)粒pENTR Ad5AEl SREp-CMV-GFP的骨架中GFP的N-末端。這產(chǎn)生質(zhì)粒pENTR Ad5 Λ El SREp-CMV-[Foxo3_GFP]。最后,通過PCR從質(zhì)粒pLanYFP-NT上得到Ian-YFP的cDNA,并通過SLIC將其克隆到Pac1-酶切的質(zhì)粒 pENTR Ad5AEl SREp-CMV-[Foxo3-GFP]上。這產(chǎn)生質(zhì)粒 pENTR Λ El {SREp-YFP} - {CMVp-[Foxo3-GFP]}。
      [0110]Δ Ε3 {SMADrp-tdTomato}質(zhì)粒系列的構(gòu)建
      [0111]將該五種質(zhì)粒(pENTRAd5 E3、pENTR Ad5 E3 Ad5/3 尾絲、pENTR Ad5 E3 Ad5/ll尾絲、pENTR Ad5 E3 Ad5/34尾絲、以及pENTR Ad5 E3 Ad5_RGD尾絲)的每個(gè)都做下面一系列的改變。首先,通過定點(diǎn)誘變將E3啟動子中的27539-27542位的TATA盒子序列(GenBankAccess1n AC_000008)突變?yōu)?CATC。并且,將 27509-27514 位的 ATF 結(jié)合位點(diǎn)從 TCGTCA 突變?yōu)門AGGCA。這兩種改變降低了 E3啟動子的基本活性以減少假陽性讀出。接著通過PCR得到這些載體的骨架以刪除E3A和E3B區(qū)域(28130-30807位),使用SLIC將PacI限制性酶切位點(diǎn)前的SMAD-應(yīng)答啟動子(SMADrp)插入到該骨架中。最后,通過PCR得到tdTomato并使用SLIC將其插入到Pac1-消化的載體中。
      [0112]Δ E4 {E2Flp- [mCherry-CRTC2]}質(zhì)粒的構(gòu)建
      [0113]通過PCR得到pENTR Ad5 E4的骨架以刪除Ad5基因組的32927-35815位,并使用SLIC將其與PacI限制性酶切位點(diǎn)前的E2F1啟動子結(jié)合。通過PCR從病毒0NYX-411的DNA上得到E2F1啟動子。這產(chǎn)生質(zhì)粒pENTR Ad5 Δ E4 E2Flp。通過PCR從Ultimate ORFCollect1n中的含有CRTC2 cDNA的質(zhì)粒上得到CRTC2 cDNA,并且從質(zhì)粒pmcherry-Cl上得到mCherry cDNA。用SGLRS氨基酸接頭將CRTC2融合到mCherry的C-末端,使用SLIC將其克隆到PacI消化的載體pENTR Ad5 Δ E4 E2Flp上。這構(gòu)建了質(zhì)粒pENTRAd5ΔE4{E2Flp-[mCherry-CRTC2]}。
      [0114]關(guān)于PCR,使用Phus1n酶(NEB)進(jìn)行所有的PCR。所有的PCR都使用Ix HF緩沖液、200 μ M每種(1見1\0.5 4]\1每種引物和1ng模板進(jìn)行。PCR條件如下:98°C 30秒——10個(gè)循環(huán)的98°C 10秒、65°C 30秒(每2個(gè)循環(huán)溫度降低1°C )、對于每Ikb的PCR產(chǎn)物長度72 0C 30秒——72 0C 5分鐘,4°C保持。
      [0115]關(guān)于SLIC,將線性片段用外切核酸酶在室溫下在以下20μ I反應(yīng)體系中處理12分鐘,所述反應(yīng)體系為:50mM Tris pH8、10mM MgCl2、50 μ g/mL BSA、200mM尿素、5mM DTT和0.5μ I Τ4 DNA聚合酶。通過加入Ιμ? 0.5Μ EDTA將反應(yīng)終止,接著在75°C下孵育20分鐘。然后在新試管中將等量的T4處理的DNA混合至約20 μ I體積。對于結(jié)合兩個(gè)片段的SLIC,使用10 μ I的各反應(yīng)液。對于結(jié)合三個(gè)片段的SLIC,使用7μ I的各反應(yīng)液。通過以下方式將片段退火:加熱到65°C 10分鐘,接著緩慢冷卻以每5秒降低溫度0.5°C直至25°C。退火后,轉(zhuǎn)化5 μ I反應(yīng)液并篩選克隆。
      [0116]關(guān)于從改造的入門載體質(zhì)粒構(gòu)建病毒,使用Adsembly基因組裝配方法構(gòu)建這些病毒。將20 fmol的雙向DEST載體與50 fmol的Ad5 El入門載體以及各10 fmol的Ad5 E3和E4入門載體結(jié)合。將這些載體在10 μ I的終體積中與2 μ I LR Clonase II(Invitrogen)結(jié)合。將該反應(yīng)在25°C下過夜孵育(12-16小時(shí))。通過加入1μ I蛋白酶K(Invitrogen)并在37°C下孵育10分鐘終止反應(yīng)。然后將5 μ I反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到對ccdB基因產(chǎn)物敏感的高效感受態(tài)細(xì)菌中(>le9 cfu/yg)。隨后分離菌落并篩選完整的基因組。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用FuGENE6 ((Roche)將陽性克隆轉(zhuǎn)染到293-E4細(xì)胞中,五天后回收病毒。
      [0117]轉(zhuǎn)導(dǎo)原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞以測定來自病毒的熒光讀出。將正常非腫瘤細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞放置在顯微鏡室載玻片上。第二天,去除培養(yǎng)基并加入病毒接種物。病毒接種物的總感染復(fù)數(shù)等于30。2小時(shí)以后,移除所述接種物并加入新鮮培養(yǎng)基。24小時(shí)以后,將細(xì)胞用PBS洗滌一次,并用4%多聚甲醛固定30分鐘。固定以后,將細(xì)胞用PBS洗滌一次并進(jìn)行熒光成像。
      [0118]Vn.表格
      [0119]表1.CTC的定量和定性測定
      [0120]

      【權(quán)利要求】
      1.檢測受試者中癌癥的方法,所述方法包括: (i)給予受試者重組報(bào)告性腺病毒; (?)使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述受試者中的癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞; (iii)從所述受試者中獲得含有所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的樣品;以及 (iv)檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      2.檢測受試者中癌癥的方法,所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品; (?)將重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸; (iii)使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞;以及 (iv)檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      3.測定測試化合物是否抑制來自癌癥患者的癌細(xì)胞的生長的方法,所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品; (?)使重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸; (iii)使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞; (iv)使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞有足夠的時(shí)間去生長; (v)測定所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的生長水平;以及 (vi)將所述水平與對照水平相比,其中和所述對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制來自所述患者的癌細(xì)胞的生長。
      4.權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的方法,其中所述癌癥為肺癌、皮膚癌或乳腺癌。
      5.權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的方法,其中所述癌細(xì)胞為循環(huán)癌細(xì)胞。
      6.權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的方法,其中所述癌細(xì)胞為惡變前細(xì)胞。
      7.權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的方法,其中所述樣品為體液或組織樣品。
      8.權(quán)利要求7的方法,其中所述體液為血液。
      9.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的方法,其中所述檢測包括檢測報(bào)告基因表型。
      10.權(quán)利要求9的方法,其中所述報(bào)告基因表型為突光報(bào)告基因表型。
      11.分離來自受試者的樣品中的報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的方法,所述方法包括將所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞與未感染的細(xì)胞分離,其中所述分離至少部分地基于所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的表達(dá)的報(bào)告基因表型。
      12.權(quán)利要求11的方法,還包括使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞有足夠的時(shí)間去生長,從而表達(dá)所述表達(dá)的報(bào)告基因表型。
      13.權(quán)利要求11的方法,其中所述未感染的細(xì)胞為非癌細(xì)胞。
      14.權(quán)利要求11的方法,其中所述樣品為血液樣品。
      15.含有癌細(xì)胞報(bào)告模塊和癌細(xì)胞結(jié)合模塊的重組報(bào)告性腺病毒。
      16.權(quán)利要求15的重組報(bào)告性腺病毒,還包括免疫逃避模塊。
      17.權(quán)利要求15的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述癌細(xì)胞報(bào)告模塊包括與報(bào)告基因可操作地連接的癌癥應(yīng)答啟動子。
      18.權(quán)利要求17的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述報(bào)告基因?yàn)橥还鈭?bào)告基因。
      19.權(quán)利要求15的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述癌細(xì)胞報(bào)告模塊是第一癌細(xì)胞報(bào)告模塊,并且所述重組報(bào)告性腺病毒還包含第二癌細(xì)胞報(bào)告模塊和第三癌細(xì)胞報(bào)告模塊。
      20.權(quán)利要求19的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述第一癌細(xì)胞報(bào)告模塊能表達(dá)第一報(bào)告基因表型,所述第二癌細(xì)胞報(bào)告模塊能表達(dá)第二報(bào)告基因表型,并且所述第三癌細(xì)胞報(bào)告模塊能表達(dá)第三報(bào)告基因表型。
      21.權(quán)利要求20的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述第一報(bào)告基因表型、所述第二報(bào)告基因表型和所述第三報(bào)告基因表型均為可檢測地不同的。
      22.權(quán)利要求20的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述第一報(bào)告基因表型指不第一癌癥,所述第二報(bào)告基因表型指示第二癌癥,并且所述第三報(bào)告基因表型指示第三癌癥。
      23.權(quán)利要求22的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述第一癌癥、所述第二癌癥和所述第三癌癥均獨(dú)立地是不同的。
      24.權(quán)利要求20的重組報(bào)告性腺病毒,其中所述第一報(bào)告基因表型、所述第二報(bào)告基因表型和所述第三報(bào)告基因表型都指示單一癌癥。
      25.檢測受試者中癌癥的方法,所述方法包括: (i)給予受試者權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的重組報(bào)告性腺病毒; (?)使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述受試者中的癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞; (iii)從受試者中獲得含有所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的樣品;以及 (iv)檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      26.檢測受試者中癌癥的方法,所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品; (?)使權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸; (iii)使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞;以及 (iv)檢測所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞從而檢測了所述受試者中的癌癥。
      27.權(quán)利要求25或26中任一項(xiàng)的方法,還包括給予所述受試者癌癥治療。
      28.測定測試化合物是否抑制來自癌癥患者的癌細(xì)胞的生長的方法,所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細(xì)胞的樣品; (?)將權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的重組報(bào)告性腺病毒與所述癌細(xì)胞接觸; (iii)使所述重組報(bào)告性腺病毒感染所述癌細(xì)胞從而形成報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞; (iv)使所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞有足夠的時(shí)間去生長; (v)測定所述報(bào)告病毒感染的癌細(xì)胞的生長水平;以及 (vi)將所述水平與對照水平相比,其中和對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制來自所述患者的癌細(xì)胞的生長。
      29.檢測癌癥的試劑盒,所述試劑盒包括權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的重組報(bào)告性腺病毒。
      30.篩選癌癥藥物的試劑盒,所述試劑盒包括抑制癌癥的化合物和權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的重組報(bào)告性腺病毒。
      31.分離癌細(xì)胞的試劑盒,所述試劑盒包括用于檢測表達(dá)的報(bào)告基因表型的裝置和權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的重組報(bào)告性腺病毒。
      【文檔編號】G01N33/569GK104204805SQ201380014047
      【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月14日
      【發(fā)明者】C·奧謝, C·帕沃斯 申請人:薩克生物研究學(xué)院
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