胰腺β-細胞紊亂中的可溶性MANF的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明部分地提供用于診斷胰腺β-細胞紊亂、預(yù)測受試者發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險、監(jiān)測處于發(fā)展胰腺β-細胞紊亂風(fēng)險的受試者的胰腺β-細胞功能或胰腺β-細胞團、監(jiān)測受試者中胰腺β-細胞紊亂的治療效力、鑒別發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者、選擇治療胰腺β-細胞紊亂的受試者、選擇參加臨床研究的受試者和檢測胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。這些方法包括確定可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自受試者的生物樣品中的至少一個水平。還提供包含可溶性MANF蛋白的藥物組合物和包含特異性結(jié)合可溶性MANF的抗體或抗原結(jié)合性抗體片段的試劑盒。
【專利說明】胰腺β -細胞紊亂中的可溶性MANF
[0001]優(yōu)先權(quán)申明
[0002]本申請要求2012年I月24日提交的美國專利申請序列號61/590，021的優(yōu)先權(quán)。在此將美國專利申請序列號61/590，021的整體引入以作參考。

【背景技術(shù)】
[0003]受試者的胰腺β -細胞的功能或數(shù)量的缺失促成包括I型糖尿病(糖尿病(diabetes mellitus))、2型糖尿病和Wolfram綜合征等的多種疾病的發(fā)病(pathogenesis)。在I型糖尿病中，患者由于胰島素缺乏而具有高血糖水平。一般來說，胰島素的絕對缺乏發(fā)生在患有I型糖尿病的患者中，而胰島素的相對缺乏發(fā)生在患有2型糖尿病的患者中。越來越多的證據(jù)表明功能性胰腺β -細胞團(β -cell mass)減少是I型和2型糖尿病二者，以及糖尿病如Wolfram綜合征的遺傳形式的共同特征(Pipeleers等人，Novartis Found Symp.292:19-24，2008)。在I型或2型糖尿病的進展期間,胰腺β_細胞功能和團(mass)逐漸下降，最終導(dǎo)致胰島素缺乏和高血糖癥。最新研究成果表明“應(yīng)激的”胰腺β -細胞對功能紊亂和死亡敏感(Oslowski等人，Curr.0pin.Endocrinol.DiabetesObes.17:107-112, 2010 ；0slowski 等人，Curr.0pin.Cell B1l.23: 207-215，2011 ;Fonseca等人,Trends Endocrinol.Metab.22:266-274，2011)。輔助預(yù)測受試者對發(fā)展膜腺β-細胞功能紊亂和死亡的易感性的診斷標(biāo)記物將有助于治療或延緩受試者中胰腺β-細胞紊亂(例如，I型或2型糖尿病)的進展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明部分地基于如下發(fā)現(xiàn):應(yīng)激的胰腺β -細胞產(chǎn)生并分泌可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)，可溶性MANF保護胰腺β-細胞免于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡,且可溶性MANF保持胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原體內(nèi)平衡。
[0005]鑒于這些發(fā)現(xiàn)，本文提供診斷受試者中胰腺β -細胞紊亂、預(yù)測受試者發(fā)展胰腺細胞紊亂的風(fēng)險、監(jiān)測受試者(例如，處于發(fā)展胰腺細胞紊亂風(fēng)險的受試者)中胰腺細胞功能或胰腺細胞團、鑒別發(fā)展胰腺細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者、選擇治療胰腺細胞紊亂的受試者、選擇參加臨床研究的受試者和檢測胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法(例如體外方法)。這些方法包括確定可溶性MANF的至少一個水平(例如，可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中或培養(yǎng)基中的內(nèi)源水平)。
[0006]本文還提供診斷受試者的胰腺β -細胞紊亂的方法(例如，體外方法)，所述方法包括確定可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自受試者的生物樣品中的水平；將可溶性MANF在生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較；和將與參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平升高的受試者鑒定為患有胰腺β -細胞紊舌L。
[0007]本文還提供預(yù)測受試者發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險的方法(例如，體外方法)，所述方法包括:確定可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalicastrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)在來自受試者的生物樣品中的水平；將可溶性MANF在生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較；和將與參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平升高的受試者鑒定為發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險增加，或者將與參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平降低或沒有顯著差異的受試者鑒定為發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險正?；蚪档汀?br> [0008]本文還提供監(jiān)測受試者中胰腺細胞功能或胰腺細胞團的方法(例如，體外方法)，所述方法包括:確定在第一時間點時可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自受試者的生物樣品中的水平；確定在第二時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平；將第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比較；和將與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平升高的受試者鑒定為胰腺β-細胞功能下降或胰腺β-細胞減少，或者與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平降低或無顯著變化的受試者鑒定為受試者中胰腺β_細胞功能沒有變化或提高，或胰腺β_細胞團沒有變化或增加。
[0009]本文還提供監(jiān)測受試者中胰腺細胞紊亂的治療效力的方法(例如，體外方法)。這些方法包括確定在第一時間點時可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自受試者的生物樣品中的水平，確定在第二時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平，和將第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比較，其中(i)第一時間點為在治療之前，和第二時間點為在治療起始后的任意時間點，或(ii)第一時間點在治療起始之后(following theinitiat1n of treatment),和第二時間點為晚于治療期間或之后的時間點；和與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平降低表明該治療在受試者中是有效的。
[0010]本文還提供治療或延緩受試者中胰腺β-細胞紊亂發(fā)病(onset)的方法、減少胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法(例如，體外方法)、或減少或延緩在兩個以上的胰腺β-細胞群體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法(例如，體外方法)。這些方法包括向受試者施用有效量的可溶性MANF或阿樸嗎啡(apomorpine),或者使胰腺β _細胞或胰腺細胞群體與可溶性MANF或阿樸嗎啡接觸。在某些實施方案中，可溶性MANF包含與哺乳動物可溶性MANF蛋白序列(例如，SEQ ID N0S: 2和4_7任何之一)至少80% (例如，85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% )同一的序列。在某些實施方案中，例如其中所述方法包括施用阿樸嗎啡，受試者不患有勃起功能障礙或帕金森氏病。
[0011]本文還提供在制造用于治療或延緩受試者中胰腺β-細胞紊亂發(fā)病的醫(yī)藥品時使用本文記載的可溶性MANF(例如，包括與SEQ ID Ν0:2至少80%同一的序列的可溶性MANF)或阿樸嗎啡的任一種的方法。本文還提供在治療或延緩受試者中胰腺細胞紊亂發(fā)病中使用的分離的可溶性MANF(例如，包括含與SEQ ID Ν0:2至少80%同一的序列的分離的可溶性MANF)或阿樸嗎啡。
[0012]本文還提供篩選用于治療或延緩受試者中胰腺β -細胞紊亂發(fā)病的候選化合物的方法(例如，體外方法)、減少胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法(例如，體外方法)、和減少或延緩胰腺β -細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡(apoptotic cell death)的方法(例如，體外方法)。這些方法包括提供胰腺β_細胞，使胰腺β_細胞與候選化合物接觸，確定在候選化合物的存在下由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平，將由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平與可溶性MANF的參考水平相比較，和選擇與參考水平相比由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平升高相關(guān)的化合物作為用于治療或延緩受試者中胰腺β_細胞紊亂發(fā)病的候選化合物。在這些方法中，與參考水平相比由胰腺β_細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平升高表明該候選化合物可對治療或延緩受試者中胰腺β -細胞紊亂發(fā)病、減少胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、或者減少或延緩在胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡有用。
[0013]本文還提供篩選用于治療或延緩受試者中胰腺細胞紊亂發(fā)病的候選化合物的方法(例如，體外方法)、減少胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法、或減少或延緩胰腺細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法。這些方法包括提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感性熒光蛋白(例如氧化還原敏感性綠色熒光蛋白)和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞；使該細胞與試驗化合物接觸；確定細胞中氧化的報告蛋白的存在量；和將細胞中氧化的報告蛋白的存在量與參考水平相比較；其中與參考水平相比細胞中氧化的報告蛋白的水平升高表明候選化合物可對治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂發(fā)病有用。在某些實施方案中，參考水平為在不存在候選劑(candidateagent)下哺乳動物細胞中氧化的報告蛋白的存在量。在某些實施方案中，參考水平為氧化的報告蛋白的閾值水平。
[0014]本文還提供篩選用于治療或延緩受試者中胰腺細胞紊亂發(fā)病的候選化合物的方法(例如，體外方法)、減少胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法、或減少或延緩胰腺細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法。這些方法包括提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感性熒光蛋白(例如氧化還原敏感性綠色熒光蛋白)和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞；使該細胞與試驗化合物接觸；確定細胞中還原的報告蛋白的存在量；和將細胞中還原的報告蛋白的存在量與參考水平相比較；其中與參考水平相比細胞中還原的報告蛋白的水平降低表明候選化合物可對治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂發(fā)病有用。在某些實施方案中，參考水平為在不存在候選劑(candidateagent)下哺乳動物細胞中還原的報告蛋白的存在量。在某些實施方案中，參考水平為還原的報告蛋白的閾值水平。
[0015]還提供試劑盒，其包括特異性結(jié)合可溶性MANF (例如，人可溶性MANF)的抗體或抗原結(jié)合性抗體(antigen-binding antibody)片段,和結(jié)合至選自由胰島素、C-蛋白和胰島淀粉樣多肽(IAPP)組成的組的蛋白質(zhì)的至少一種抗體或抗原結(jié)合性抗體片段。還提供藥物組合物，其包含可溶性MANF蛋白(例如，包含與SEQ ID NO:2至少80%同一的序列的可溶性MANF蛋白)和/或阿樸嗎啡，和用于治療胰腺細胞紊亂的至少一種附加劑(addit1nal agent)(例如，卩比格列酮(p1glitazone)、TUDCA> GLP-1 或 DPP-4 抑制劑(例如，西他列汀(sitagliptin)、維達列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利拉列汀(Iinagliptin)、度格列汀(dutogliptin)，、吉格列汀(gemigliptin)和阿格列汀(alogliptin)))。
[0016]術(shù)語“胰腺細胞紊亂”意指包括胰腺細胞功能(例如胰島素分泌)下降或存在于受試者中的活的分泌胰島素的胰腺β-細胞數(shù)(胰腺β-細胞團)減少作為其發(fā)病機理的一部分的疾病。在某些實施方案中，胰腺β-細胞紊亂的進一步特征在于受試者的胰腺β-細胞群體(例如兩個以上的胰腺β-細胞)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增加。如本文所述，胰腺β-細胞功能的下降、活的胰腺β-細胞數(shù)(胰腺β-細胞團)的下降、或存在于受試者的胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增加可使用本文所述方法或本領(lǐng)域已知的其它方法間接檢測。胰腺β -細胞紊亂的非限制性實例包括I型糖尿病(糖尿病)、2型糖尿病和Wolfram綜合征。
[0017]術(shù)語“胰腺細胞功能”意指用于描述哺乳動物(例如，人)的胰腺細胞的生物活性(例如，胰腺β_細胞特別獨特的活性)。胰腺β_細胞功能的非限制性實例包括胰島素的合成和分泌、胰島淀粉樣多肽(IAPP)的合成和分泌以及C-肽的合成和分泌。檢測胰島素、IAPP和C-肽的合成和分泌是本領(lǐng)域已知的。胰腺β-細胞功能還可使用本文所述方法以及本領(lǐng)域已知方法(例如，確定血糖水平和確定糖化血紅蛋白AlC水平)間接檢測。
[0018]術(shù)語“胰腺β -細胞團”意指哺乳動物(例如，人)中活的分泌胰島素的胰腺β -細胞的總數(shù)。本文記載了用于間接確定受試者的胰腺β_細胞團的方法。用于間接確定受試者中胰腺細胞團的其它方法是本領(lǐng)域已知的(例如，確定血糖水平和確定糖化血紅蛋白AlC水平)。
[0019]胰腺β -細胞團可表示受試者的內(nèi)源活的胰腺β -細胞的總數(shù)或可表示受試者的內(nèi)源活的胰腺β_細胞的數(shù)量加上移植入受試者中的活的胰腺β_細胞(例如，自體移植、同種移植或異種移植的活的胰腺β_細胞)的數(shù)量的總和。
[0020]術(shù)語“可溶性MANF”意指包含與中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)的可溶性哺乳動物形式至少80 %同一的序列的蛋白質(zhì)。例如，可溶性MANF可為包含與SEQ IDN0S: 2和4-7任一種，即與SEQ ID N0S: 2和4_7的全長至少80%同一(例如，至少81 %、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%同一)的序列的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，可溶性MANF可為野生型哺乳動物可溶性MANF(例如，SEQ ID NO: 2和4-7)。
[0021]可溶性MANF蛋白可作為治療處理(例如，作為使用本文所述任一種方法的重組體或純化的內(nèi)源性蛋白)施用。純化的可溶性MANF蛋白可為例如干重純度至少80% (例如，至少85%、90%、95%或99% )。本文記載了可溶性MANF的其它修飾形式。
[0022]術(shù)語“增加”或“升高”意指與參考水平或同一受試者(例如，在來自同一受試者的生物樣品)在較早或較后的時間點時測量的水平相比，可觀察、可檢測或顯著的水平增加。
[0023]術(shù)語“減少(下降)”意指與參考水平或同一受試者(例如，在來自同一受試者的生物樣品)在較早或較后的時間點時測量的水平相比，可觀察、可檢測或顯著的水平減少(下降)。
[0024]術(shù)語“與可溶性MANF水平升高相關(guān)的化合物”意指誘導(dǎo)或?qū)е屡c該化合物接觸的哺乳動物細胞存在、產(chǎn)生或分泌的可溶性MANF (例如蛋白質(zhì)或mRNA)的水平與在不存在該化合物下對照哺乳動物細胞(例如，同一或相同類型的哺乳動物細胞)存在、產(chǎn)生或分泌的可溶性MANF(例如蛋白質(zhì)或mRNA)的水平相比升高的化合物。
[0025]短語“發(fā)展疾病的風(fēng)險”意指與對照受試者或群體(例如，健康受試者或群體、或沒有胰腺β-細胞紊亂家族史的受試者或群體)相比受試者在未來將發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的相對可能性。本文提供確定受試者發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險(在未來)的方法，所述方法包括確定可溶性MANF的水平。
[0026]術(shù)語“治療”包括減少受試者的疾病(例如，胰腺細胞紊亂)的癥狀的數(shù)量、或者減少受試者的疾病(例如，胰腺β_細胞紊亂)的一種或多種癥狀的嚴重性、持續(xù)時間或頻率。術(shù)語治療還可包括減少受試者發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險(在未來)或延緩受試者胰腺β_細胞紊亂的一種或多種癥狀的發(fā)生。
[0027]短語“延緩胰腺細胞紊亂發(fā)病”意指在受試者中觀察到胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀之前的時間長度增加。在某些實施方案中，受試者可預(yù)先鑒定為發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險增加。如本文所述，受試者可使用本文所述方法或通過觀察胰腺β -細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史鑒定為發(fā)展胰腺細胞紊亂的風(fēng)險增加。
[0028]術(shù)語“生物樣品”包括從受試者采集的包括生物流體(b1logical fluid)的任何樣品。在非限制性樣品中，生物樣品可包括血液、血清、血漿、尿、腦脊液、唾液、膽汁、胃液或母乳。
[0029]短語“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”意指反應(yīng)性氧類(助氧化劑類(pro-oxidant species))的產(chǎn)生、與細胞的或細胞器對反應(yīng)性氧類(或它們的中間體)的解毒(除去)的能力之間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失衡，該反應(yīng)性氧類導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化還原電位的移動和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊或未折疊蛋白的積累。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)獨特的應(yīng)激通路，稱為未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)(在本文中另外描述)。
[0030]胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可由許多分子事件(例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脂肪酸的水平增加、血胰島素增多(hyperinsulemia)、VEGF的過量產(chǎn)生、低氧、葡萄糖剝奪(glucosedeprivat1n)、胰島淀粉樣多肽突變體、胰島素突變體、IL-1的水平增加、IFN- Y的水平增加或病毒感染)引起。各種不同化學(xué)試劑也可用于誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(例如，毒胡蘿卜素或衣霉素)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已顯示將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從氧化環(huán)境向更加還原的環(huán)境移動。在某些實施方案中，具有將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在ER應(yīng)激條件下從還原向氧化環(huán)境移動的能力的試劑將幫助減少ER應(yīng)激和/或可減少或防止ER應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡。
[0031]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可使用本領(lǐng)域已知的各種不同方法檢測。本文記載了用于檢測、減少或延緩胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的示例性方法。
[0032]短語“胰腺β -細胞群體”意指兩種以上的胰腺β -細胞。在某些實施方案中，胰腺β_細胞群體可存在于哺乳動物(例如，人)受試者(例如，受試者的內(nèi)源胰腺β_細胞，胰腺β -細胞的自體移植物、同種移植物或異種移植物)。在某些實施方案中，胰腺β -細胞群體可在體外培養(yǎng)(組織培養(yǎng))。在某些實施方案中，胰腺細胞群體為胰腺細胞系(例如，本文記載的那些胰腺細胞系)。在某些實施方案中，胰腺細胞可源自任何哺乳動物物種(例如，人、猴(例如黑猩猩)、小鼠、豬、大鼠或猿)。在某些實施方案中，胰腺細胞群體可為原代細胞系或無限增殖化細胞系。
[0033]術(shù)語“胰腺β -細胞”意指通常存在于哺乳動物胰腺中的胰島中的胰島素-產(chǎn)生細胞。如本文所使用的，術(shù)語胰腺β -細胞包括存在于哺乳動物體內(nèi)的胰腺β -細胞(例如，內(nèi)源胰腺β_細胞，或胰腺β_細胞的自體移植物、同種移植物或異種移植物)或體外培養(yǎng)的胰腺β -細胞(例如，來自本文所記載的任意哺乳動物物種的胰腺β -細胞的先體外后體內(nèi)(ex vivo)(例如，原代)培養(yǎng)物或胰腺β_細胞系(例如，原代或無限增殖化細胞系)。在某些實施方案中，存在于哺乳動物中的胰腺細胞在胰腺中存在。在某些實施方案中，存在于哺乳動物中的胰腺β-細胞位于除胰腺以外的組織中(例如，在肝臟組織中)。在其它實施方案中，胰腺β_細胞包封在植入受試者中的裝置(例如，生物相容性聚合物)中。術(shù)語胰腺β_細胞還包括哺乳動物(例如，人、豬、大鼠和小鼠)細胞系或原代哺乳動物(例如，人、豬、大鼠和小鼠)細胞培養(yǎng)物中的胰腺細胞。在某些實施方案中，胰腺β_細胞可使用分子生物技術(shù)來遺傳操作以表達一種或多種重組蛋白(例如，胰島素)和/或減少一種或多種內(nèi)源蛋白的表達。
[0034]術(shù)語“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡”意指由細胞(例如,胰腺β -細胞)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的應(yīng)激觸發(fā)的程序性細胞死亡。在某些實施方案中,誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞(例如，胰腺細胞)中的未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)通路。本文記載了 UPR通路的典型成分。如本文所記載的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可由多種試劑(例如,生物和化學(xué)試劑)引發(fā)。本文記載了用于檢測、測量、降低和延緩胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡發(fā)生的方法。用于檢測和測量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的另外的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0035]術(shù)語“確定水平”意指使用一種或多種科學(xué)技術(shù)(例如，分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)和生物化學(xué)方法或試驗)來評價特定分子的水平(例如，在生物樣品或細胞培養(yǎng)基中)。短語確定水平包括與特定分子(例如，抗體或抗體的抗原結(jié)合性片段)特異性結(jié)合的一種或多種試劑與樣品(例如，生物樣品或細胞培養(yǎng)基)的物理接觸。
[0036]術(shù)語“第二時間點”一般意指在第一時間點(例如，入院時間(time ofadmiss1n))之后發(fā)生的任何時間點。第二時間點可發(fā)生在第一時間點后的例如至少6小時、12小時、24小時、I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、4周、6周、2個月、6個月、I年或2年發(fā)生。在某些實施方案中，受試者可在第一時間點和第二時間點之間實施治療。
[0037]術(shù)語“氧化還原敏感的熒光蛋白”為改變其熒光性質(zhì)(例如，在其氧化還原環(huán)境改變(例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原環(huán)境的改變)時激發(fā)和/或發(fā)射光譜(例如，峰激發(fā)或發(fā)射波長)改變)的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，該蛋白質(zhì)熒光性質(zhì)的改變可例如由于一個以上的二硫鍵的形成和/或斷裂而發(fā)生。氧化還原敏感的熒光蛋白非限制性實例包括氧化還原氧化敏感型綠色熒光蛋白(roGFP)和氧化還原敏感的黃色熒光蛋白(rxYFP)。另外的氧化還原敏感的熒光蛋白是本領(lǐng)域已知的。
[0038]其它定義貫穿本公開出現(xiàn)在上下文中。除非另有限定，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文記載了方法和材料用于在本發(fā)明中使用；還可使用本領(lǐng)域已知的其它適合的方法和材料。材料、方法和實例僅為說明性而不意欲限制。本文提及的所有公報、專利申請、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目(database entries)和其它文獻以其整體引入以作參考。在沖突的情況下，本說明書，包括定義在內(nèi)，將會調(diào)控。
[0039]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢從下列詳細描述和圖示中，以及從權(quán)利要求中將會是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為示出在不用或用毒胡蘿卜素(50nM)或衣霉素(0.5 μ g/mL)處理24小時后MANF蛋白在來自大鼠胰腺β-細胞系(INS-1 832/13)培養(yǎng)物的濃縮培養(yǎng)基中或在來自大鼠胰腺細胞系(INS-1 832/13)溶解產(chǎn)物中的水平的免疫印跡。
[0041]圖2為示出MANF mRNA在下述條件下培養(yǎng)的大鼠胰腺β -細胞系(INS-1832/13)中的相對表達的圖=IlmM葡萄糖(24小時)；25mM葡萄糖(24小時)；25mM葡萄糖(48小時)；25mM葡萄糖(72小時)；IImM葡萄糖和5 μ M衣霉素(TM) (24小時)；或IlmM葡萄糖和20ηΜ毒胡蘿卜素(Tg) (24小時)。示出的數(shù)據(jù)使用定量實時PCR產(chǎn)生(η = 3，S.D.)。
[0042]圖3 為示出 MANF、WFSl、TXNIP 和 CHOP mRNA 在用 5mM 葡萄糖(LG) UlmM 葡萄糖(MG)或25mM葡萄糖(HG)培養(yǎng)五天的，或用5mM葡萄糖(LG)培養(yǎng)五天和用0.5 μ M毒胡蘿卜素(TG)培養(yǎng)6小時的小鼠初級胰島(primary islets)中的相對表達的圖。示出的數(shù)據(jù)使用定量實時PCR產(chǎn)生(η = 3，S.D.)。
[0043]圖4為示出MANF mRNA在用5.5mM葡萄糖(UT)、25mM葡萄糖(HG)、0.25 μ M毒胡蘿卜素(TG)UO μ M胰島淀粉樣多肽(IAPP)或500 μ M含牛血清白蛋白的棕櫚酸鹽(酯)(Palmitate) 24小時處理后在來自兩個人類供體(HPl1139-01和HI 11-20)的人初級胰島(human primary islet)中的相對表達的圖。示出的數(shù)據(jù)使用定量實時PCR產(chǎn)生(η = 3，S.D.)。
[0044]圖5為示出可溶性MANF在人初級胰島的培養(yǎng)基中無另外的處理或用25mM葡萄糖(24小時)、0.25 μ M毒胡蘿卜素(24小時)或0.5mM棕櫚酸鹽(酯)(24小時)處理后的水平的免疫印跡。
[0045]圖6為示出從人初級胰島的培養(yǎng)基中無另外的處理或用25mM葡萄糖(24小時)、
0.25 μ M毒胡蘿卜素(24小時)或0.5mM棕櫚酸鹽(酯)(24小時)處理后的免疫沉淀的可溶性MANF的水平的免疫印跡。在該實驗中，人MANF使用兔抗人MANF抗體(Proteintech)免疫沉淀，和將相同的抗體用于進行免疫印跡。
[0046]圖7為示出BiP mRNA在轉(zhuǎn)染有陰性對照siRNA (NC)或靶向MANFmRNA的三種不同siRNA分子(siMANF#l、siMANF#2或siMANF#3)之一的鼠科胰腺β-細胞系(ΜΙΝ6)中在無另外的處理或用2μΜ衣霉素處理24小時后的相對表達的圖。這些數(shù)據(jù)用定量實時PCR產(chǎn)生(η = 3，S.D.)。
[0047]圖8為示出裂解的胱天蛋白酶(0&8?886)-3在未處理的或用14]?衣霉素或10011]\1毒胡蘿卜素處理24小時并進一步用0、40或200ηΜ可溶性MANF處理的鼠科胰腺β -細胞系(ΜΙΝ6)中的水平的免疫印跡。
[0048]圖9Α為哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-定位的氧化還原敏感的GFP(MER0S-GFP)的圖。
[0049]圖9Β為C0S7細胞的兩個共焦圖像。左圖示出MER0S-GFP的熒光，右圖中示出DsRed-ER示蹤劑(tracker)的突光。
[0050]圖1OA為一組MER0S-GFP在無處理或用不同濃度的DTT處理后的激發(fā)光譜(發(fā)射波長為51nM)。
[0051]圖1OB為氧化的MER0S-GFP在未處理NSC34細胞中的發(fā)射光譜(激發(fā)波長為394nM)。
[0052]圖1OC為還原的MER0S-GFP在用2mM DTT處理的NSC34細胞中發(fā)射光譜(激發(fā)波長為 473nM)。
[0053]圖11為一組四個使用476-nm激發(fā)波長(下面兩幅圖)或405_nm激發(fā)波長(上面兩幅圖)在用(右側(cè)兩幅圖)或沒用(左側(cè)兩幅圖)2mM DTT處理的INS-1832/13細胞中聚集的MER0S-GFP的共焦顯微圖像。
[0054]圖12為未加處理(無標(biāo)記)的或用H2O2 (I或0.1mM H2O2)或DTT (0.1,0.2,0.5、
1、2、5 或 1mM DTT)處理的 INS-1 832/13 細胞中的 MER0S-GFP 比的圖。MER0S-GFP 比使用酶標(biāo)儀(plate reader)確定。示出的數(shù)據(jù)為平均值土S.D.(η = 3)。
[0055]圖13為未加處理的(左圖)或用2mM DTT處理的(右圖)的細胞的溶解產(chǎn)物中的4-乙酰氨基-4’- 二苯乙烯馬來酰亞胺(maleimidylstilbene) -2, 2’- 二磺酸(AMS)-改性的MER0S-GFP的非還原性(non-reducing)聚丙烯酰胺凝膠電泳照片。溶解產(chǎn)物為在電泳前未加處理的(_ β ME)(上方)或用β -巰基乙醇(+ β ME)處理的(下方)。
[0056]圖14為示出用ImM DTT處理10分鐘然后洗滌的NSC34細胞中MER0S-GFP比的時程(time course)的圖。MER0S-GFP比在處理前一分鐘至洗滌后四分鐘之間的各分鐘間隔下計算。下方的線表示473nM的激發(fā)下觀察的熒光，黑色線表示MER0S-GFP比，淺灰色線表示394nM激發(fā)下的熒光(n = 3 ;S.D.)。
[0057]圖15為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有MER0S-GFP的在無處理或用DTT (0.2,0.5或1mM DTT)處理后的INS-1 832/13細胞的熒光輔助細胞分選(FACS)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)使用488nM和405nM的激發(fā)波長和510nM的發(fā)射光譜收集。從下方到上方來看，不同的數(shù)據(jù)集是未處理的、0.2mM DTT、0.5mM DTT和1mM DTT (表明在用增加濃度的DTT處理后向更加還原的狀態(tài)移動)。
[0058]圖16為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有MER0S-GFP的在無處理或用DTT (0.2mM、0.5mM或1mM DTT)處理后的INS-1 832/13細胞的FACS數(shù)據(jù)的直方圖。橫軸表示MER0S-GFP比，縱軸表示細胞數(shù)。從左至右的峰表示未處理的、0.2mM DTT-處理的、0.5mM DTT-處理的和1mM DTT處理的細胞。
[0059]圖17為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有MER0S-GFP的在無處理或用DTT (0.2，0.5，or 1mM DTT)處理后的INS-1 832/13細胞中的中值MER0S-GFP比的圖。示出的MER0S-GFP值標(biāo)準(zhǔn)化為未處理的值。
[0060]圖18為示出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有MER0S-GFP的在無處理或用ImM H2O2處理30分鐘后的INS-1 832/13細胞的FACS分析的數(shù)據(jù)的兩幅圖。右圖為未處理或用ImM H2O2處理的INS-1832/13細胞中MER0S-GFP比的柱狀圖。左圖示出未處理(左)或用ImM H2O2處理30分鐘的INS-1 832/13細胞中的中值MER0S-GFP比。
[0061]圖19為使用FACS分析的在無處理或用衣霉素(TM) (5 μ M ;24小時)、毒胡蘿卜素(TG) (1nM ；24 小時)、TG(lyM ;4 小時)、布雷菲德菌素 A(BreA) (100ng/mL ；24 小時)或MG132(100nM ；24小時)處理后的INS-1 832/13細胞中計算的中值MER0S-GFP比的圖。誤差線(error bars)表示土S.D.0p〈0.01)。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為計算的未處理細胞的中值MER0S-GFP 比。
[0062]圖20為示出未加處理的或用I μ M毒胡蘿卜素(TG)處理4小時的INS-1832/13細胞中的MER0S-GFP比的直方圖。
[0063]圖21為使用FACS分析的在用IImM葡萄糖(24小時)處理或25mM葡萄糖處理24、48或72小時后的INS-1 832/13細胞中計算的中值MER0S-GFP比的圖。誤差線表示土S.D。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為計算的用IlmM葡萄糖處理24小時的細胞的中值MEROS-GFP比。
[0064]圖22為使用FACS分析的在無處理的、血清消耗或葡萄糖消耗后的INS-1832/13細胞中計算的中值MER0S-GFP比的圖。誤差線表示土S.D.(*p〈0.01)。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為計算的未處理細胞的中值MER0S-GFP比。
[0065]圖23為未加處理的或用棕櫚酸(0.2mM ；24小時)、棕櫚酸(0.2mM)和高葡萄糖(25mM) (24小時)、棕櫚酸(0.5mM ；24小時)、油酸(0.5mM ；24小時)或亞油酸(0.5mM ；24小時)處理的INS-1 832/13細胞中的中值MER0S-GFP比的圖。誤差線表示土S.D.數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為計算的未處理細胞的中值MER0S-GFP比。
[0066]圖24為未加處理的或用人胰島淀粉樣多肽(IAPP) (10μΜ；24小時)、小鼠IAPP (10 μ M ;24 小時)或細胞因子(白細胞介素-1 β (5ng/mL)、IFN y (100ng/mL)和TNFa (25ng/mL) ;24小時)處理的INS-1 832/13細胞中的中值MER0S-GFP比的圖。誤差線表示土S.D.數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為計算的未處理細胞的中值MEROS-GFP比。
[0067]圖25為來自未加處理的(左)或用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)(PA)處理24小時的INS-1 832/13細胞的FACS數(shù)據(jù)的兩幅圖。y軸表示使用488nM激發(fā)后的熒光，x軸表示使用405nM激發(fā)后的熒光。
[0068]圖26為示出使用FACS分析在無處理或用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)(PA)或0.5mM油酸(OA)處理24小時后的INS-1 832/13細胞中計算的MEROS-GFP比的圖。用棕櫚酸鹽(酯)處理的細胞的數(shù)據(jù)向右移動。
[0069]圖27為示出還原的細胞在用IlmM葡萄糖處理24小時或用25mM葡萄糖處理
24、48或72小時后的INS-1 832/13細胞群體中的百分比的圖。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差(**ρ〈0.01)。
[0070]圖28為示出還原的細胞在無處理、血清消耗24小時或葡萄糖消耗24小時后的INS-1 832/13細胞群體中的百分比的圖。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差(#ρ〈0.01)。
[0071]圖29為示出還原的細胞在無處理，或用10 μ M人IAPP，10 μ M小鼠ΙΑΡΡ，或白細胞介素-1 β (5ng/mL)、IFNy (100ng/mL)和 TNFa (25ng/mL)的組合處理 24 小時后的 INS-1832/13細胞群體中的百分比的圖。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差(**p〈0.01)。
[0072]圖30為示出還原的細胞在無處理，用0.2mM棕櫚酸鹽(酯)、0.2mM棕櫚酸鹽(酯)和25mM葡萄糖、0.5mM棕櫚酸鹽(酯)、0.5mM油酸、0.5mM亞油酸、牛血清白蛋白和0.5mM棕櫚酸鹽(酯)、0.5mM棕櫚酸鹽(酯)和0.5mM油酸、以及0.5mM棕櫚酸鹽(酯)和0.5mM亞油酸處理24小時后的INS-1 832/13細胞群體中的百分比的圖。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差(**ρ〈0.01)。
[0073]圖31為轉(zhuǎn)染有BiP-P-mCherry的細胞的圖和示出流式細胞儀激光線和濾波器的構(gòu)造的圖。
[0074]圖32為氧化或還原的INS-1 832/13細胞中的中值BiP-PiCherry表達的圖。細胞為未加處理的或為用1nM毒胡蘿卜素,5 μ M衣霉素，25mM葡萄糖,血清剝奪(serumdeprivat1n)，葡萄糖剝奪(glucose deprivat1n)，0.5mM 掠櫚酸鹽(酯)，10 μ M 人 IAP,或白細胞介素-1 β (5ng/mL)、IFNy (100ng/mL)和TNF a (25ng/mL)的組合處理24小時。BiP-P-mCherry表達使用FACS分析確定。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0075]圖33為示出用5 μ M衣霉素(TM，上方直方圖)或葡萄糖剝奪(下方直方圖)處理24小時的氧化和還原的INS-1 832/13細胞的兩幅直方圖。x軸表示表達由人BiP啟動子驅(qū)動的mCherry的水平。
[0076]圖34為來自用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)處理24小時的INS-1 832/13細胞的FACS數(shù)據(jù)的直方圖。
[0077]圖35為示出FACS-分離的氧化和還原的INS-1 832/13細胞的純度的直方圖。
[0078]圖36為示出BiP (左圖)和剪接的XBPl (sXBP)(右圖)在用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)處理24小時的INS-1 832/13細胞中的表達水平的兩幅圖。BiP和sXBP的表達水平使用實時PCR測量。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0079]圖37為示出Derlin3、BiP, Herp和H)la5在從氧化的或還原的INS-1 832/13細胞中純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達水平的表格。表達數(shù)據(jù)使用DNA微陣列分析收集。
[0080]圖38為示出用單獨DMSOUOnM毒胡蘿卜素(Tg)、10nM Tg和10 μ M吡格列酮、或者 1nM Tg 和 500 μ g/mL 牛黃熊脫氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)處理的INS-1 832/13細胞的死亡細胞的百分比(左圖)或中值MEROS-GFP比(右圖)的兩幅圖。
[0081]圖39為示出使用MER0S-GFP體系的篩選體系的圖。
[0082]圖40為示出從在不存在(左上圖)或存在(右上圖)10 μ M阿樸嗎啡(Apo)下用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)處理后的INS-1 832/13-MER0S-GFP細胞收集的FACS數(shù)據(jù)的兩幅直方圖，和示出在無處理，或在存在或不存在10 μ M阿樸嗎啡下用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)處理后的INS-1 832/13 MER0S-GFP細胞中還原的細胞的百分比的圖。誤差線表示土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0083]圖41為從用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)(PA)與1nM或50nM阿樸嗎啡(Apo)、或不與1nM或50nM阿樸嗎啡(Apo)處理后的用Mitoprobe染料染色的INS-1832/13-MER0S-GFP細胞收集的FACS數(shù)據(jù)的直方圖。
[0084]圖42為示出在不處理、或用單獨0.5mM棕櫚酸鹽(酯)、或0.5mM棕櫚酸鹽(酯)和1nM阿樸嗎啡處理后的通過FACS分析分級的低Λ ψ細胞的百分比(左圖)和死亡細胞的百分比的兩幅圖。
[0085]圖43為在不處理、或用1nM毒胡蘿卜素(Tg)處理、或用1nM Tg和1nM阿樸嗎啡處理后的死亡細胞的百分比的圖。
[0086]圖44為示出存在于1nM毒胡蘿卜素-處理的初級人胰島(右側(cè)免疫印跡)、和用1nM阿樸嗎啡或10 μ M卩比格列酮處理的2 μ M多西環(huán)素(doxycycline)-處理的WFSl敲除的INS-1 832/13細胞(shWFSl)(左側(cè)免疫印跡)中的裂解的胱天蛋白酶3 (c_胱天蛋白酶3)和裂解的PARP(c-PARP)的量的兩個免疫印跡。
[0087]圖45為示出在IlmM葡萄糖或25mM葡萄糖中培養(yǎng)后(24小時)(分別為上圖和下圖)，以及用O或0.5 μ g/mL可溶性MANF處理48小時(分別為左圖和右圖)后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有還原形式EroGFP的INSl 832/13細胞(胰腺β細胞系)的百分比的熒光輔助細胞分選數(shù)據(jù)的圖。細胞使用473ηΜ的波長和51nM的發(fā)射光譜激發(fā)。

【具體實施方式】
[0088]本發(fā)明基于，至少部分地基于如下發(fā)現(xiàn)，可溶性MANF由應(yīng)激的胰腺β -細胞分泌，并且可溶性MANF延緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的胰腺β -細胞凋亡性細胞死亡并減少暴露于誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑或條件的胰腺β-細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原狀態(tài)的波動。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，提供用于診斷胰腺β-細胞紊亂、預(yù)測受試者發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險、監(jiān)測受試者(例如，處于發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險的受試者)中胰腺β-細胞功能和胰腺β-細胞團、監(jiān)控受試者中胰腺β-細胞紊亂的治療效力、鑒別發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者、選擇治療胰腺β -細胞紊亂的受試者、選擇參加臨床研究的受試者和檢測胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。這些方法包括確定可溶性MANF的至少一個水平(例如，在來自受試者的生物樣品中或在培養(yǎng)基中)。
[0089]還提供治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂發(fā)病、減少胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、或者減少或延緩在兩個以上的胰腺β-細胞群體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法。這些方法包括向受試者施用有效量的可溶性MANF或阿樸嗎啡，或者使胰腺β-細胞或胰腺細胞群體與可溶性MANF接觸。在某些實施方案中，例如其中所述方法包括施用阿樸嗎啡，受試者不患有勃起功能障礙或帕金森氏病。
[0090]還提供篩選用于治療或延緩受試者的胰腺β -細胞紊亂發(fā)病的候選化合物、減少胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、或者減少或延緩胰腺細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法。在某些實施方案中，這些方法包括提供胰腺細胞，使胰腺細胞與候選化合物接觸，確定在候選化合物的存在下由胰腺細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平，將由胰腺細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平與可溶性MANF的參考水平相比較。在某些實施方案中，這些方法包括提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白(例如，氧化還原敏感的綠色熒光蛋白或氧化還原敏感的黃色熒光蛋白)和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞(例如，胰腺細胞)；使該細胞與試驗化合物接觸；確定細胞中氧化的報告蛋白的存在量；和將細胞中氧化的報告蛋白的存在量與參考水平相比較；其中與參考水平相比細胞中氧化的報告蛋白的水平升高表明候選化合物可對治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂發(fā)病、減少胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和/或減少或延緩在胰腺β -細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡有用。在某些實施方案中，這些方法包括提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白(例如，氧化還原敏感的綠色熒光蛋白或氧化還原敏感的黃色熒光蛋白)和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞(例如，胰腺細胞)；使該細胞與試驗化合物接觸；確定細胞中還原的報告蛋白的存在量；和將細胞中還原的報告蛋白的存在量與參考水平相比較；其中與參考水平相比細胞中還原的報告蛋白的水平降低表明候選化合物可對治療或延緩受試者的胰腺β-細胞紊亂發(fā)病、減少胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和/或減少或延緩在胰腺β-細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡有用。
[0091]胰腺細胞紊亂
[0092]胰腺β -細胞紊亂為特征在于受試者的胰腺β -細胞功能紊亂或胰腺β -細胞團遞減的一類疾病。可在患有胰腺細胞紊亂的受試者中下降的胰腺細胞功能包括，但不限于，胰島素產(chǎn)生和分泌、C-肽產(chǎn)生和分泌、和胰島淀粉樣多肽(IAPP)產(chǎn)生和分泌。胰腺β -細胞紊亂的非限制性實例包括I型糖尿病(糖尿病)、2型糖尿病和Wolfram綜合征。胰腺細胞紊亂可發(fā)生在任何年齡的人類中，例如，在嬰幼兒、兒童、成年和老年受試者中。例如，胰腺0-細胞紊亂可發(fā)生在年齡大于35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90的受試者中。
[0093]醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、醫(yī)師助手或化驗員(laboratorytechnician))可通過評定受試者的胰腺β_細胞紊亂的一種或多種(例如，兩種、三種、四種或五種)癥狀來診斷受試者為患有胰腺β-細胞紊亂。受試者的胰腺β-細胞紊亂的非限制性癥狀包括與健康個體或群體(例如，空腹血糖水平大于100mg/dL或大于120mg/dL)相比血糖水平(例如，空腹血糖水平)顯著增加，與健康個體或群體(例如，血紅蛋白AlC水平大于6.5%，大于7.0%，或大于8.0% )相比糖化血紅蛋白水平(血紅蛋白AlC水平)顯著增加，口渴增加，尿頻，極度饑餓，無法解釋的體重減輕，存在尿酮，疲勞，視力模糊，瘡愈合緩慢，輕度高血壓，和頻繁感染。醫(yī)療保健專業(yè)人員還可在某種程度上基于受試者的胰腺β_細胞紊亂家族史來診斷。醫(yī)療保健專業(yè)人員可在將受試者送往醫(yī)療機構(gòu)(例如，診所或醫(yī)院)時診斷患有胰腺β_細胞紊亂的受試者。在某些情況下，醫(yī)療保健專業(yè)人員可在將受試者收入輔助醫(yī)療機構(gòu)的同時診斷受試者為患有胰腺細胞紊亂。典型地，醫(yī)師在觀察或檢測受試者的一種或多種癥狀后診斷受試者的胰腺β-細胞紊亂。
[0094]醫(yī)療保健專業(yè)人員還可基于以下因素中的一種或多種來鑒別受試者為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加:體重增加(例如，體質(zhì)指數(shù)(body mass index) >25或>30),遲鈍，胰腺β -細胞紊亂的家族史，種族，年齡，診斷患有多囊卵巢綜合征，高血壓，高密度脂蛋白水平下降(例如，低于35mg/dL)，和高水平甘油三酯(例如，超過250mg/dL)。
[0095]本文提供有用于診斷胰腺β -細胞紊亂的受試者(例如，表現(xiàn)胰腺β -細胞紊亂的一種或多種癥狀的受試者或不表現(xiàn)胰腺細胞紊亂癥狀的受試者(例如，未確診和/或無癥狀受試者)的其它方法。還提供鑒別發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者的其它方法。本文還提供治療受試者的胰腺β_細胞紊亂的方法。
[0096]中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)
[0097]可溶性MANF蛋白的內(nèi)源水平，如本文所述，可在本文記載的任一種方法中檢測，例如作為診斷胰腺β_細胞紊亂、預(yù)測受試者發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險、監(jiān)測受試者(例如，處于發(fā)展胰腺細胞紊亂的風(fēng)險的受試者)中胰腺細胞功能和胰腺細胞團，鑒別發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者，選擇治療胰腺β-細胞紊亂的受試者，選擇參加臨床研究的受試者，和檢測胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記物。純化的、分離的和/或重組的可溶性MANF蛋白也可用于治療或延緩受試者的胰腺β -細胞紊亂的發(fā)病、減少胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和減少或延緩兩個以上的胰腺β_細胞群體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法。
[0098]MANF蛋白翻譯為前體蛋白，前體蛋白隨后從細胞(例如，胰腺β-細胞)裂解并釋放為可溶性蛋白。下面示出全長(前體)人MANF蛋白和人可溶性MANF蛋白。下面加下劃線的為前體人MANF蛋白中的25個氨基酸信號序列。下面還示出編碼人前體MANF蛋白的mRNA ο
[0099]人前體MANF 蛋白(SEQ ID NO:1)
[0100]MRRMWATQGLAVALALSVLPGSRALRP⑶CEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
[0101]人可溶性MANF 蛋白(SEQ ID NO: 2)
[0102]LRP⑶CEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATK11NEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDffGETCKGCAEKSDYIRKINELML Y
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[0118]哺乳動物可溶性MANF蛋白高度保守，其中人和?？扇苄訫ANF蛋白具有96 %的同一性，人和小鼠可溶性MANF蛋白具有99 %的同一性，人和豬可溶性MANF蛋白具有97 %的同一性。人可溶性MANF蛋白液與斑馬魚可溶性MANF蛋白共享72%的同一性和88%的相似性。
[0119]診斷方法
[0120]本文提供診斷受試者的胰腺β -細胞紊亂的方法。這些方法包括確定(分析)可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平，并將可溶性MANF在生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較。在這些方法中，與可溶性MANF的參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平升高表明受試者患有胰腺β -細胞紊亂，與可溶性MANF的參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平降低或無顯著變化表明受試者不患有胰腺β -細胞紊舌L。
[0121]如本文任一處所提到的，“可溶性MANF的參考水平”可為可溶性MANF的閾值水平，可溶性MANF存在于對照受試者或群體(例如，未診斷為患有疾病的受試者或群體(健康受試者或群體)，不具有胰腺β_細胞紊亂的一種或多種癥狀，和/或不具有胰腺β_細胞紊亂的家族史)中的水平，或可溶性MANF在同一受試者的較早時間點時的水平。
[0122]可溶性MANF的水平可使用本領(lǐng)域已知的方法確定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用與可溶性MANF特異性結(jié)合的抗體的本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測。與人可溶性MANF特異性結(jié)合的多種抗體是商購可得的(例如，兔抗人可溶性MANF 抗體，可購自 Sigma-Aldrich 和 Proteintech)。
[0123]本文記載的任一種方法可進一步包括從受試者獲得或收集樣品(例如，包含生物流體例如尿、血液、血漿、血清或腦脊液的生物樣品)。在本文記載的任一種方法中，生物樣品可在確定可溶性MANF的水平之前保存一段時間(例如，至少I小時或至少24小時)(例如，在10°C或低于10°C下保存)。
[0124]本文記載的任一種方法可對送往醫(yī)療機構(gòu)(例如，醫(yī)院、診所或輔助醫(yī)療機構(gòu))的患者進行。受試者可表現(xiàn)出胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺
細胞紊亂的任一種癥狀)。受試者可被懷疑患有胰腺細胞紊亂。受試者還可表現(xiàn)出無胰腺細胞紊亂癥狀(無癥狀受試者)或只有一種胰腺細胞紊亂癥狀。受試者可具有胰腺β-細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史。受試者還可具有發(fā)展胰腺細胞紊亂的風(fēng)險增加。受試者可為嬰幼兒、兒童、青少年、成年人或老年人。
[0125]在某些實施方案中，所述方法對具有可檢測或可觀察的胰腺β -細胞團和/或具有可檢測或可觀察量的胰腺β_細胞功能的受試者(例如，不具有完全喪失的胰腺β_細胞團或胰腺β_細胞功能的受試者)進行。本文記載了檢測胰腺β_細胞功能的方法。胰腺β_細胞團可通過觀察受試者的胰腺β_細胞功能或使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，美國專利申請20110123443號公報中記載的方法)直接檢測。
[0126]本文記載的診斷方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、化驗員、護士、醫(yī)師助理和護士助理)進行。本文記載的診斷方法可與一種或多種本領(lǐng)域已知的或本文記載的其它診斷試驗方法組合使用(例如，觀察或評定受試者的胰腺β_細胞紊亂的一種或多種癥狀，例如，血糖監(jiān)測、糖化血紅蛋白分析、胰島素水平、IAPP水平、C-肽水平或尿中酮類的水平)。本文記載的診斷方法可對鑒別為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者(例如，使用本文記載的任一種方法鑒別為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者)進行。在某些實施方案中，本文記載的診斷方法可對已鑒別為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者定期進行(例如，至少每月、每兩個月、每六個月或每年一次)。某些實施方案進一步包括從受試者收集生物樣品。
[0127]某些實施方案另外包括向鑒別為患有胰腺β -細胞紊亂或處于發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險的受試者施以針對胰腺β_細胞紊亂的治療(例如，分離、純化或重組的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制劑(例如，西他列汀、維達列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文記載的任意組合物，例如治療有效劑量的含有與SEQ ID Ν0:2至少90%同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿樸嗎啡)。某些實施方案另外包括進行附加試驗來證實胰腺β_細胞紊亂在受試者中的診斷。某些實施方案包括選擇受試者用于周期性葡萄糖監(jiān)測(例如，使用血糖儀的周期性自體葡萄糖(self-glucose)監(jiān)測)或本文記載的任一種監(jiān)測方法。某些實施方案另外包括選擇受試者用于由醫(yī)師或醫(yī)療保健專業(yè)人員進行的周期性醫(yī)學(xué)評定(例如，至少每年一次、至少每六個月一次、至少每三個月一次、至少每兩個月一次或至少每個月一次的周期性探訪)。某些實施方案包括記錄受試者醫(yī)療記錄中診斷試驗的結(jié)果，或者使用本文所述方法對診斷為患有胰腺細胞紊亂的受試者的一名以上的直系家庭(lineal family)成員進行胰腺β-細胞紊亂的診斷試驗。
[0128]預(yù)測發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險的方法
[0129]還提供預(yù)測受試者發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險的方法。這些方法包括確定(試驗)可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平并將可溶性MANF在生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較。與可溶性MANF的參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平升高表明受試者發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險增加，和與參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平降低或沒有顯著差異表明受試者發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險降低或不顯著。本文記載的可溶性MANF的任何參考水平可用于這些方法中。某些實施方案另外包括從受試者獲得生物樣品。
[0130]可溶性MANF的水平可使用本領(lǐng)域已知的方法確定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用與可溶性MANF特異性結(jié)合的抗體的本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測。在某些實施方案中，所述方法另外包括從受試者獲得或收集樣品(例如，包含生物流體例如尿、血液、血漿、血清或腦脊液的生物樣品)。
[0131]本文記載的任一種方法可對送往醫(yī)療機構(gòu)(例如，醫(yī)院、診所或輔助醫(yī)療機構(gòu))的患者進行。在某些實施方案中，所述方法作為由醫(yī)療保健專業(yè)人員進行的周期性物理檢查的一部分對受試者進行。受試者可表現(xiàn)出胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺細胞紊亂的任一種癥狀)。受試者可被懷疑患有胰腺細胞紊亂。受試者還可表現(xiàn)出無胰腺β-細胞紊亂癥狀(無癥狀受試者)或只有一種胰腺細胞紊亂癥狀。受試者可具有胰腺細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史。受試者可為嬰幼兒、兒童、青少年、成年人或老年人。
[0132]本文記載的這些診斷方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、化驗員、護士、醫(yī)師助理和護士助理)進行。這些方法可與用于鑒別處于發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險的受試者的本領(lǐng)域已知的任何其它方法(例如，評定下列一個或多個因素:體重增加、遲鈍、胰腺β -細胞紊亂的家族史、種族、年齡、診斷患有多囊卵巢綜合征、高血壓、高密度脂蛋白水平下降(例如，低于35mg/dL)和高水平的三酸甘油酯(例如，高于250mg/dL))組合使用。鑒別為發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者可使用本文記載的任何方法監(jiān)測(參見，例如下一部分)。
[0133]某些實施方案另外包括向鑒別為發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者施以針對胰腺細胞紊亂的治療(例如，分離、純化或重組的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制劑(例如，西他列汀、維達列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文記載的任意組合物，例如治療有效劑量的含有與SEQ ID NO: 2至少90%同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿樸嗎啡)。某些實施方案包括選擇鑒別為發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者用于周期性葡萄糖監(jiān)測(例如，使用血糖儀的周期性自體葡萄糖監(jiān)測)。某些實施方案另外包括選擇鑒別為具有發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者用于由醫(yī)師或醫(yī)療保健專業(yè)人員進行的周期性醫(yī)學(xué)評定(例如，至少每年一次、至少每六個月一次、至少每三個月一次、至少每兩個月一次或至少每個月一次的周期性探訪)。某些實施方案另外包括記錄受試者醫(yī)療記錄中的試驗結(jié)果，或者使用本文記載的方法對鑒別為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者的一名以上的直系家庭成員進行類似的試驗或任何本領(lǐng)域已知的試驗來確定發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險。
[0134]監(jiān)測胰腺β -細胞功能紊亂和胰腺β -細胞團的方法
[0135]還提供監(jiān)測受試者(例如，處于發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險的受試者，患有胰腺β_細胞紊亂的受試者或具有接收的胰腺β_細胞移植物的受試者)的胰腺β_細胞功能紊亂的方法。這些方法包括確定(試驗)在第一時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平，確定(試驗)在第二時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平，和將第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比較。與第一時間點時可溶性MANF的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平升高表明受試者的胰腺β-細胞功能下降(例如，顯著的、可觀察的或可檢測的下降)或胰腺細胞團減少。與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平降低或無顯著變化表明受試者胰腺細胞功能或胰腺細胞團沒有變化或增加。
[0136]在某些實施方案中，所述方法對在第一時間點和第二時間點具有可檢測的或可觀察的胰腺β_細胞團和/或具有可檢測的或可觀察的量的胰腺β_細胞功能的受試者(例如，在第一和第二時間點不具有完全喪失的胰腺β-細胞團或胰腺β-細胞功能的受試者)進行。
[0137]在某些實施方案中，第二時間點可為第一時間點之后的至少6小時(例如，至少12小時、18小時、24小時、I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、I個月、2個月、3個月、6個月、I年、2年、3年、4年或5年)。在某些實施方案中，第一時間點可為進入醫(yī)療機構(gòu)的入院時間或首次出現(xiàn)胰腺細胞紊亂的至少一種癥狀的I周內(nèi)。
[0138]在某些實施方案中，所述方法可另外包括確定(試驗)在一個以上的其它的稍遲時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平。在這些方法中，與可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)樣品(按時間順序(chronological time)稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍遲樣品(按時間順序稍后收集的)中的水平升高表明受試者的胰腺細胞功能下降(例如，顯著的、可觀察的、或可檢測的下降)或胰腺細胞團減少。同樣地，與可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)樣品(按時間順序稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍遲樣品(按時間順序稍后收集的)中的水平的下降或無顯著變化表明受試者的胰腺β-細胞功能或胰腺β-細胞團沒有變化或增加。在某些實施方案中，這些方法對在第一、第二和一個以上的其它時間點時具有可檢測的或可觀察的胰腺β_細胞團和/或具有可檢測的或可觀察的量的胰腺β_細胞功能的受試者(例如，在第一、第二和一個以上的其它時間點時不具有完全喪失的胰腺β_細胞團或胰腺β_細胞功能的受試者)進行。
[0139]在某些實施方案中，受試者可預(yù)先接受了胰腺細胞移植物，以便這些方法在某種程度上監(jiān)測移植入受試者中的胰腺細胞的胰腺細胞功能和胰腺細胞團。在某些實施方案中，移植的胰腺細胞是自體移植、同種移植或異種移植的胰腺細胞。在某些實施方案中，移植的胰腺細胞存在于裝置中，或被生物相容性聚合物包圍或置于生物相容性聚合物中。在某些實施方案中，移植的胰腺β_細胞存在于除胰腺以外的組織(例如，肝組織)中。在某些實施方案中，這些方法在胰腺β_細胞移植I周、2周、3周、I個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或I年內(nèi)的受試者中進行。在某些實施方案中，第一時間點在移植操作后不久(例如，在I周或2周內(nèi))。
[0140]可溶性MANF的水平可使用本領(lǐng)域已知的方法確定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用與可溶性MANF特異性結(jié)合的抗體的本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測。在某些實施方案中，所述方法另外包括從受試者獲得或收集樣品或至少兩個樣品(例如，包含生物流體例如尿、血液、血漿、血清或腦脊液的生物樣品)。
[0141]本文記載的任一種方法可對送往醫(yī)療機構(gòu)(例如，醫(yī)院、診所或輔助醫(yī)療機構(gòu))的患者進行。在某些實施方案中，所述方法對受試者進行作為由醫(yī)療保健專業(yè)人員進行的周期性檢查的一部分。受試者可表現(xiàn)出胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺β-細胞紊亂的任一種癥狀)。受試者還可表現(xiàn)出無胰腺β-細胞紊亂癥狀(無癥狀受試者)或只有一種胰腺細胞紊亂癥狀。受試者可具有胰腺細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史。受試者可為嬰幼兒、兒童、青少年、成年人或老年人。
[0142]本文記載的這些方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、化驗員、護士、醫(yī)師助理和護士助理)進行。鑒別為具有胰腺β_細胞功能下降(例如，顯著的、可觀察的或可檢測的下降)或胰腺β_細胞團減少的受試者可施以針對胰腺β_細胞紊亂的治療(例如，分離、純化或重組的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制劑(例如，西他列汀、維達列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文記載的任意組合物，例如治療有效劑量的含有與SEQ ID Ν0:2至少90%同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿樸嗎啡)。在某些實施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿樸嗎啡，受試者不具有勃起功能障礙或帕金森氏病。
[0143]某些實施方案另外包括受試者的一種或多種(例如兩種、三種或四種)胰腺β -細胞功能障礙的其它標(biāo)記物的附加檢測或評定(例如，降低的C-肽產(chǎn)生和分泌、降低的胰島素產(chǎn)生和分泌、降低的IAPP產(chǎn)生和分泌、增加的血糖水平、增加的糖化血紅蛋白水平和受試者生物流體中(例如，在尿中)酮類的存在)。用于檢測胰腺β_細胞的一種或多種其它標(biāo)記物的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0144]某些實施方案另外包括向鑒別為具有胰腺β -細胞功能下降或胰腺β -細胞團減少的受試者施以針對胰腺β -細胞紊亂的治療(例如，分離、純化或重組的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制劑(例如，西他列汀、維達列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文記載的任意組合物，例如治療有效劑量的含有與SEQID NO: 2至少90%同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿樸嗎啡)。某些實施方案包括選擇鑒別為具有胰腺β_細胞功能下降或胰腺β_細胞團減少的受試者用于周期性葡萄糖監(jiān)測(例如，使用血糖儀的周期性自體葡萄糖監(jiān)測)。某些實施方案另外包括選擇鑒別為具有胰腺β_細胞功能下降或胰腺β_細胞團減少的受試者用于由醫(yī)師或保健專業(yè)人員的周期性醫(yī)學(xué)評定(例如，至少每年一次、至少每六個月一次、至少每三個月一次、至少每兩個月一次、至少每個月一次或至少每周一次的周期性探訪)。某些實施方案另外包括記錄受試者醫(yī)療記錄中的試驗結(jié)果，或者對鑒別為具有胰腺β_細胞功能下降或胰腺β_細胞團減少的受試者的一名以上的直系家庭成員進行類似的試驗或任何本領(lǐng)域已知的試驗來監(jiān)測胰腺β_細胞功能或胰腺β_細胞團。某些實施方案另外包括選擇具有胰腺β_細胞功能下降或胰腺細胞團減少的受試者用于胰腺細胞移植。
[0145]監(jiān)測胰腺β -細胞紊亂的治療效力的方法
[0146]還提供監(jiān)測受試者(例如，診斷為患有胰腺β -細胞紊亂的受試者)胰腺β -細胞功能紊亂的治療效力的方法。這些方法包括確定(試驗)在第一時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平，確定(試驗)在第二時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平，和將第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比較，其中(i)第一時間點為在治療之前，和第二時間點為在治療起始后的任意時間點，或(ii)第一時間點在治療起始之后，和第二時間點為晚于治療期間或之后的時間點；和與第一時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平降低表明該治療在受試者中是有效的。在某些實施方案中，胰腺β-細胞紊亂的治療是施用胰島素(例如，本文記載的任意形式的胰島素)、吡格列酮和TUDCA中的一種或多種。在某些實施方案中，治療為將胰腺β -細胞移植入受試者(例如，如本文記載的)。
[0147]與第一時間點時可溶性MANF的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平降低表明在受試者中治療有效。與第一時間點時可溶性MANF的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平增加或無顯著變化表明治療無效和/或本治療應(yīng)終止和/或應(yīng)向受試者施用替代療法。在某些實施方案中，與第一時間點時可溶性MANF的水平相比第二時間點時可溶性MANF在生物樣品中的水平增加或無顯著變化表明應(yīng)向受試者施用增加治療劑量或應(yīng)以提高的頻率和/或持續(xù)時間施用治療。
[0148]在某些實施方案中，所述方法對在第一和第二時間點時具有可檢測的或可觀察的胰腺β-細胞團和/或具有可檢測的或可觀察的量的胰腺β-細胞功能的受試者(例如，在第一和第二時間點不具有完全喪失的胰腺β_細胞團或胰腺β_細胞功能的受試者)進行。在某些實施方案中，所述方法對預(yù)先已鑒別或診斷為患有胰腺β_細胞紊亂的受試者進行。某些實施方案另外包括選擇患有胰腺β_細胞紊亂的受試者。某些實施方案另外包括從受試者獲得樣品。某些實施方案另外包括向受試者施用一種或多種劑量的治療。
[0149]在某些實施方案中，第二時間點可為第一時間點之后的至少6小時(例如，至少12小時、18小時、24小時、I天、2天、3天、4天、5天、6天、I周、2周、3周、I個月、2個月、3個月、6個月、I年、2年、3年、4年或5年)。在某些實施方案中，第一時間點可為進入醫(yī)療機構(gòu)的入院時間或首次出現(xiàn)胰腺細胞紊亂的至少一種癥狀的I周內(nèi)。
[0150]在某些實施方案中，所述方法可進一步包括確定(試驗)在一個以上的另外的稍遲時間點時可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平。在這些方法中，與可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)樣品(按時間順序稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍遲樣品(按時間順序稍后收集的)中的水平降低表明受試者中的治療效力。同樣地，與可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)樣品(按時間順序稍早收集的)中的水平相t匕，可溶性MANF在稍遲樣品(按時間順序稍后收集的)中的水平的升高或無顯著變化表明治療在受試者中無效。在某些實施方案中，這些方法對在第一、第二和一個以上的其它時間點時具有可檢測的或可觀察的胰腺β-細胞團和/或具有可檢測的或可觀察的量的胰腺β-細胞功能的受試者(例如，在第一、第二和一個以上的其它時間點時不具有完全喪失的胰腺β_細胞團或胰腺β_細胞功能的受試者)進行。
[0151]在某些實施方案中，受試者可預(yù)先接受了胰腺細胞移植物，以便這些方法在某種程度上監(jiān)測胰腺細胞移植在受試者中的效力。在某些實施方案中，移植的胰腺β_細胞是自體移植、同種移植或異種移植的胰腺β_細胞。在某些實施方案中，移植的胰腺細胞存在于裝置中，或被生物相容性聚合物包圍或置于生物相容性聚合物中。在某些實施方案中，移植的胰腺β_細胞存在于除胰腺以外的組織(例如，肝組織)中。在某些實施方案中，這些方法在胰腺β -細胞移植I周、2周、3周、I個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或I年內(nèi)的受試者中進行。在某些實施方案中，第一時間點在移植操作后不久(例如，在I周或2周內(nèi))。
[0152]可溶性MANF的水平可使用本領(lǐng)域已知的方法確定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用與可溶性MANF特異性結(jié)合的抗體的本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測。在某些實施方案中，所述方法另外包括從受試者獲得或收集樣品或至少兩個樣品(例如，包含生物流體例如尿、血液、血漿、血清或腦脊液的生物樣品)。
[0153]本文記載的任一種方法可對送往醫(yī)療機構(gòu)(例如，醫(yī)院、診所或輔助醫(yī)療機構(gòu))的患者進行。在某些實施方案中，所述方法作為由醫(yī)療保健專業(yè)人員進行的周期性物理檢查的一部分對受試者進行。受試者可預(yù)先診斷有胰腺細胞紊亂和/或可表現(xiàn)出胰腺
細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺細胞紊亂的任一種癥狀)。受試者可為嬰幼兒、兒童、青少年、成年人或老年人。
[0154]這些方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、化驗員、護士、醫(yī)師助理和護士助理)進行。某些實施方案另外包括受試者的一種或多種(例如兩種、三種或四種)胰腺β_細胞紊亂的其它標(biāo)記物的附加檢測或評定(例如，增加的C-肽產(chǎn)生和分泌、增加的胰島素產(chǎn)生和分泌、增加的IAPP產(chǎn)生和分泌、降低的血糖水平、降低的糖化血紅蛋白水平、和受試者生物流體中(例如，在尿中)在第二時間點的缺乏或無顯著水平的酮類(相對于第一時間點時的相應(yīng)水平)另外表明治療是有效的)。用于檢測胰腺β_細胞的一種或多種其它標(biāo)記物的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0155]選擇用于治療的受試者的方法
[0156]還提供選擇治療胰腺β -細胞紊亂的受試者的方法。這些方法包括確定(試驗)可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平；將可溶性MANF在生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較；選擇具有與參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平升高的受試者用于治療胰腺細胞紊亂。在這些方法中，不選擇具有與參考水平相比可溶性MANF在生物樣品中的水平降低或無顯著變化的受試者用于胰腺β -細胞紊亂的治療。
[0157]某些實施方案可另外包括試驗或確定胰腺β -細胞紊亂的一種或多種其它標(biāo)記物的水平，其中胰腺β-細胞紊亂的一種或多種其它標(biāo)記物的檢測另外表明應(yīng)選擇受試者用于治療胰腺β_細胞紊亂。這些胰腺β_細胞紊亂的一種或多種其它標(biāo)記物包括C肽在來自受試者的生物樣品中的水平降低、IAPP在來自受試者的生物樣品中的水平降低、胰島素在來自受試者的生物樣品中的水平降低、受試者的一種或多種血糖水平增加、受試者的糖化血紅蛋白水平增加或在來自受試者的生物樣品中(例如，在尿中)檢測到酮類。用于檢測C-肽、ΙΑΡΡ、胰島素、血糖、糖化血紅蛋白和酮類在來自受試者的生物樣品中的水平的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0158]可溶性MANF的水平可使用本領(lǐng)域已知的方法確定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用與可溶性MANF特異性結(jié)合的抗體的本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測。在某些實施方案中，所述方法另外包括從受試者獲得或收集樣品(例如，包含生物流體例如尿、血液、血漿、血清或腦脊液的生物樣品)。所述方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、醫(yī)師助理、化驗員、或護士助理)進行。
[0159]受試者可表現(xiàn)出胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺細胞紊亂的任一種癥狀)。受試者還可表現(xiàn)出無胰腺細胞紊亂癥狀或只有一種胰腺細胞紊亂癥狀。受試者可被懷疑患有胰腺細胞紊亂或受試者可具有發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加。受試者可具有胰腺細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史。受試者可預(yù)先診斷為患有胰腺細胞紊亂。
[0160]在某些實施方案中，所述方法對具有可檢測的或可觀察的胰腺β -細胞團和/或具有可檢測的或可觀察的量的胰腺β_細胞功能的受試者(例如，不具有完全喪失的胰腺β-細胞團或胰腺β-細胞功能的受試者)進行。
[0161]可向受試者施用的胰腺細胞紊亂的治療包括，但不限于:可溶性MANF(例如，含有與SEQ ID Ν0:2(即與SEQ ID Ν0:2全長)至少80%同一的序列的可溶性MANF蛋白)、阿樸嗎啡、速效胰島素(例如，天冬(aspart)或賴脯(lispro)胰島素)、短效(例如，常規(guī)胰島素)、中效胰島素(例如，中效低精蛋白鋅胰島素(neutral protamineHagedorn)或NPH胰島素)、長效胰島素(例如，超慢(ultralente)胰島素)、甘精胰島素(insulin glargine)、地特膜島素(insulin detemir)、普蘭林妝(pramlintide)、腸降糖素模擬物(incretin mimetics)(例如，艾塞那肽(exenatide))、磺酰脲類(例如，氯磺丙脲(chorpropamide)、格列卩比嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)和格列美脲(glimepiride))、氯茴苯酸類(meglitinides)(例如，瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide))、雙胍類(例如，二甲雙胍)、噻唑烷二酮類(例如，羅格列酮(rosiglitazone)和批格列酮)、a -葡萄糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖(acarbose)和米格列醇(meglitol))和DPP-4抑制劑(例如，西他列汀和沙格列汀)。胰腺細胞紊亂的治療可包括以任意組合使用的一種或多種(例如，兩種、三種或四種)上述試劑。在某些實施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿樸嗎啡，受試者不患有勃起功能障礙或帕金森氏病。
[0162]這些方法中的某些實施方案另外包括向受試者施用至少一種(例如，兩種、三種或四種)胰腺細胞紊亂用的治療(例如，本文記載的或本領(lǐng)域已知的胰腺細胞紊亂的一種或多種治療)。例如這些方法中的某些實施方案另外包括施用本文記載的任意藥物組合物的至少一劑(例如，至少兩劑、四劑、六劑、八劑或十劑)。胰腺細胞紊亂的治療可持續(xù)一段時間，至少I周、I個月、6個月、I年、2年、3年、4年、5年或10年。治療可周期性施用至受試者(例如，每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次、每周一次、每周兩次、每周三次、每周四次、每個月一次、每個月兩次、每個月三次或每個月四次)。
[0163]在某些實施方案中，選擇具有與參考水平相比可溶性MANF的水平升高的受試者用于由醫(yī)師或保健專業(yè)人員進行的周期性醫(yī)學(xué)評定(例如，至少每年一次、至少每六個月一次、至少每三個月一次、至少每兩個月一次、至少每個月一次或至少一周一次的周期性探訪)。某些實施方案另外包括記錄受試者的醫(yī)療記錄，受試者應(yīng)施用或開處方(prescribed)的胰腺β _細胞紊亂的一種或多種治療(例如，本文記載的任一種示例性治療)。在某些實施方案中，選擇具有與參考水平相比可溶性MANF水平升高的受試者用于胰腺細胞移植。
[0164]鑒別受試者處于發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險的方法
[0165]還提供鑒別受試者處于發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險的方法。這些方法包括確定可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平；將可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較。如果與參考水平相比可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平升高，則受試者鑒別為發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加。如果與參考水平相比可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平降低或無顯著變化，則受試者鑒別為發(fā)展胰腺細胞紊亂的風(fēng)險降低。
[0166]在本文記載的任一種方法中，增加的風(fēng)險是相對于不具有可溶性MANF水平的顯著的或可觀察的升高的受試者(例如，使用本文記載的任一種方法未診斷為患有胰腺β -細胞紊亂的受試者，未診斷為患有疾病的健康受試者，或不具有胰腺β -細胞紊亂的癥狀或胰腺β-細胞紊亂的家族史的受試者)的。
[0167]可溶性MANF的水平可使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如,本領(lǐng)域已知的任一種基于抗體的方法)確定。所述方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、醫(yī)師助理、化驗員、或護士助理)進行。
[0168]受試者可表現(xiàn)出胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺β-細胞紊亂的任一種癥狀)。受試者還可被懷疑患有胰腺β-細胞紊亂。受試者還可表現(xiàn)出無胰腺細胞紊亂癥狀或只有一種胰腺細胞紊亂癥狀。受試者可具有胰腺細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史。
[0169]在某些實施方案中，所述方法對具有可檢測的或可觀察的胰腺細胞團和/或可檢測的或可觀察的量的胰腺β_細胞功能的受試者(例如，不具有完全喪失的胰腺β-細胞團或胰腺β-細胞功能的受試者)進行。
[0170]鑒別為發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者可施以胰腺β -細胞紊亂的治療(例如，本文記載的任一種治療)或可施以新的或替代的胰腺β_細胞紊亂治療。鑒別為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者還可進行更加積極的治療處理(例如，增加的探訪診所或醫(yī)院的周期)。
[0171]某些實施方案另外包括向鑒別為發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者施以針對胰腺細胞紊亂的治療(例如，分離、純化或重組的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制劑(例如，西他列汀、維達列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文記載的任意組合物，例如治療有效劑量的含有與SEQ ID NO: 2至少90%同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿樸嗎啡)。某些實施方案包括選擇鑒別為發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者用于葡萄糖監(jiān)測(例如，使用血糖儀的自體葡萄糖監(jiān)測)。某些實施方案另外包括選擇受試者用于由醫(yī)師或醫(yī)療保健專業(yè)人員進行的周期性醫(yī)學(xué)評定(例如，至少每年一次、至少每六個月一次、至少每三個月一次、至少每兩個月一次或至少每個月一次的周期性探訪)。某些實施方案另外包括記錄受試者醫(yī)療記錄中的試驗結(jié)果，或者使用本文記載的方法對鑒別為發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險增加的受試者的一名以上的直系家庭成員進行類似的試驗或任何本領(lǐng)域已知的試驗來確定發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險。
[0172]選擇參與臨床研究的受試者的方法
[0173]還提供選擇參與臨床研究的受試者的方法。這些方法包括確定可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平；將可溶性MANF在來自受試者的生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較，和選擇具有與參考水平(例如，本文記載的可溶性MANF的任意參考水平)相比可溶性MANF在生物樣品中的水平升高、或者降低或無顯著變化的受試者用于參與臨床研究。
[0174]可溶性MANF的水平可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法確定(例如，本文記載的任一種基于抗體的方法)。所述方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、醫(yī)師助理、化驗員、或護士助理)進行。
[0175]在某些實施方案中，受試者可表現(xiàn)出胰腺細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的胰腺β -細胞紊亂的任一種癥狀)。在某些實施方案中，受試者還可表現(xiàn)出無胰腺細胞紊亂癥狀或只有一種胰腺細胞紊亂癥狀。在某些實施方案中，受試者可具有胰腺細胞紊亂(例如，2型糖尿病)的家族史。在某些實施方案中，受試者可已經(jīng)診斷為患有胰腺細胞紊亂。在某些實施方案中，受試者正采取胰腺細胞紊亂的治療。在某些實施方案中，受試者在臨床研究期間施以新的或替代的胰腺β -細胞紊亂治療。
[0176]檢測胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法
[0177]還提供檢測胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法，所述方法包括確定由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平，并將產(chǎn)生的可溶性MANF的水平與可溶性MANF的參考水平(例如，本文記載的任意參考水平)相比較。與可溶性MANF的參考水平相比由胰腺β-細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平升高表明胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加。與可溶性MANF的參考水平相比由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平降低或無顯著變化表明胰腺細胞未經(jīng)歷可檢測水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
[0178]可溶性MANF的水平可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法確定(例如，本文記載的任一種基于抗體的方法)。所述方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、醫(yī)師助理、化驗員、或護士助理)或科學(xué)家進行。
[0179]在某些實施方案中，胰腺β_細胞在哺乳動物(例如，人)中，并且由胰腺細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平可從來自哺乳動物的生物樣品(例如，包含血液、血清或血漿的樣品)中確定。在某些實施方案中，胰腺細胞可為內(nèi)源胰腺細胞或移植的胰腺β-細胞(例如，自體移植、同種移植或異種移植的胰腺β-細胞)。在某些實施方案中，胰腺細胞為已遺傳修飾的自體移植的胰腺細。在某些實施方案中，胰腺細胞可存在于哺乳動物胰腺內(nèi)或可存在于除胰腺以外的組織中(例如，肝)。在某些實施方案中，胰腺β -細胞可存在于裝置、生物相容性材料或聚合物中。
[0180]在某些實施方案中，胰腺細胞存在于體外(例如，組織培養(yǎng)物中)。例如，從哺乳動物采集的初級胰腺細胞可先體外再體內(nèi)培養(yǎng)。在某些實施方案中，培養(yǎng)的胰腺
細胞為初級哺乳動物(例如，人、大鼠、猴、牛或豬)胰腺細胞系。在某些實施方案中，培養(yǎng)的哺乳動物胰腺β_細胞可遺傳操作(例如，遺傳修飾為表達一種或多種蛋白質(zhì)、或遺傳修飾為減少一種或多種蛋白質(zhì)的表達)或化學(xué)處理(例如，利用一種或多種生長因子)。在某些實施方案中，胰腺細胞可在一種或多種生物相容性聚合物或生物合成材料(例如，輔助胰腺β_細胞移植入哺乳動物(例如，人)中的聚合物或材料)的存在下培養(yǎng)。各種生物相容性聚合物和生物合成材料是本領(lǐng)域已知的。
[0181]在某些實施方案中，受試者體內(nèi)的胰腺細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的檢測接著一個或多個以下過程:鑒別在他或她的胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平增加的受試者，施用治療劑(例如，將降低胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑，例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白和/或阿樸嗎啡)；監(jiān)測受試者的胰腺β_細胞功能(例如，本文記載的監(jiān)測胰腺β_細胞功能的任一種方法)；和增加受試者的臨床探訪的頻率或健康水平的監(jiān)測(例如，增加血糖試驗的頻率)。在某些實施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿樸嗎啡，受試者不患有勃起功能障礙或帕金森氏病。
[0182]在某些實施方案中，體外檢測胰腺細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增加接著使胰腺β_細胞與治療劑(例如，將減少胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑，例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白或阿樸嗎啡)相接觸和/或監(jiān)測胰腺β -細胞功能(例如，本文記載的任一種監(jiān)測胰腺β_細胞功能的方法)。在本文記載的任一種方法中，胰腺β_細胞可利用至少一種其它細胞類型或至少一種其它細胞系體外培養(yǎng)(例如，共培養(yǎng)或飼喂培養(yǎng)(feeder culture))。
[0183]治療方法
[0184]還提供治療或延緩受試者的胰腺β -細胞紊亂發(fā)病的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的可溶性MANF (例如，純化、分離或重組的可溶性MANF蛋白(例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白))和/或阿樸嗎啡。在某些實施方案中，治療可導(dǎo)致受試者中胰腺β_細胞紊亂的癥狀(例如，本文記載的癥狀中的任一種)的數(shù)量降低，或胰腺β_細胞紊亂的一種或多種癥狀(例如，本文記載的癥狀中的任一種)的嚴重程度、強度或頻率降低。在某些實施方案中，治療可導(dǎo)致發(fā)病或者一種或多種癥狀的延緩(與接受治療的受試者相比，未接受治療的受試者中一種或多種癥狀的實際發(fā)生的時間增加)。例如，治療可導(dǎo)致一種或多種下列結(jié)果:受試者的血糖水平降低、受試者的糖化血紅蛋白水平降低、受試者的胰島素生產(chǎn)的損失比例降低、受試者的胰腺β -細胞功能喪失的比例降低和受試者的胰腺β_細胞團的損失比例降低。在某些實施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿樸嗎啡，受試者不患有勃起功能障礙或帕金森氏病。
[0185]可溶性MANF
[0186]例如，在某些實施方案中，向受試者施用的可溶性MANF包含與SEQ ID N0S:2和4-7任一種，即與SEQ ID N0S:2和4-7的全長至少80%同一(例如，至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一)的序列，并任選地具有可溶性MANF蛋白的生物活性(本文記載)。在某些實施方案中，向受試者施用的可溶性MANF包含與SEQ ID N0:2(人可溶性MANF)，即與SEQ ID NO: 2的全長至少95%同一(例如，至少96%、97%、98%、99%或100%同一)的序列，并任選地具有可溶性MANF的生物活性(本文記載)。在某些實施方案中，向受試者施用的可溶性MANF為SEQ ID NO: 2或內(nèi)源(野生型)形式的可溶性MANF。在這些實施方案的任一個中，可溶性MANF可被純化或分離。在這些實施方案的任一個中，可溶性MANF可為重組蛋白。
[0187]序列的比較和兩個序列之間的同一性百分比的確定使用數(shù)學(xué)算法完成。兩個氨基酸序列之間的同一性百分比使用Needleman和Wunsch, J.Mol.B1l., 48:444-453，1970)算法確定，其已并入GCG軟件包中的GAP程序(可在互聯(lián)網(wǎng)gcg.com上獲得)，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，空位權(quán)重(gap weight)為16，長度權(quán)重為I。兩個核苷酸序列之間的同一性百分比使用GCG軟件包中的GAP程序(也可在互聯(lián)網(wǎng)gcg.com上獲得)確定，使用NWSgapdna.CMP矩陣，空位權(quán)重為40，長度權(quán)重為I。
[0188]一般而言，本文所指的氨基酸序列之間的同一性百分比使用BLAST 2.0程序確定，該程序可在對國家生物技術(shù)信息中心(Nat1nal Center for B1technologyInformat1n, NCBI)網(wǎng)站向公眾開放。序列比較使用無空位的比對并使用缺省參數(shù)(Blossum 62矩陣、空位存在罰分(gap existence cost)為11、每個殘基的空位罰分為1，λ比率為0.85)進行。用于BLAST程序的數(shù)學(xué)算法記載于Altschul等人,Nucleic AcidsResearch 25:3389-3402，1997 中。
[0189]如本文所決定的，可溶性MANF的哺乳動物形式具有高度的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，一般而言，為了獲得具有生物學(xué)活性(例如，治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂發(fā)病、減少胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、或者減少或延緩兩種以上的胰腺β_細胞群體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的能力)的可溶性MANF變體，在各種哺乳動物物種的可溶性MANF之間不保守的殘基可改變或除去，同時那些高度保守的殘基不應(yīng)改變或除去。如本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可比對本文提供的哺乳動物可溶性MANF蛋白的各種序列，從而鑒別那些高度保守的殘基和那些不保守的殘基。
[0190]各種形式的可溶性MANF的生物學(xué)活性可通過進行本文記載的各種生物活性試驗或本領(lǐng)域已知的那些來測試。例如,可溶性MANF蛋白(例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白)的生物活性可通過處理在可溶性MANF存在或缺乏下培養(yǎng)的胰腺β-細胞來測試、并用誘導(dǎo)胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑刺激胰腺細胞。相對于不與可溶性MANF接觸和用試劑處理的細胞，具有生物活性的可溶性MANF將減少與可溶性MANF和試劑相接觸的細胞中觀察到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡的量。例如，相對于不用可溶性MANF處理和用試劑處理的細胞，具有生物活性的可溶性MANF可減少用誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑處理的細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種或多種標(biāo)記物(例如，減少葡萄糖調(diào)控蛋白_78(也稱作grp78或BiP)或bcl_2_相關(guān)的抗死亡基因(athanogene)-1 (bag-1)表達的誘導(dǎo)；減少激活，高爾基體轉(zhuǎn)位(Golgi translocat1n),蛋白酶裂解或轉(zhuǎn)錄激活因子6 (ATF6)的核轉(zhuǎn)位；減少蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)激活、低聚或自體磷酸化；減少IREl的激活；減少eIF2 α的磷酸化；減少XBPl mRNA的內(nèi)含子加工；減少JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活；防止胱天蛋白酶原(procaspase)4的激活和裂解；和防止或減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原環(huán)境的變化(例如，實施例中記載的使用氧化還原敏感型eroGFP蛋白測量))。
[0191]向受試者施用的可溶性MANF還可包含一種或多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14或15)插入、增加、刪除或修飾。例如，可溶性MANF可共價結(jié)合至化學(xué)部分(例如，蛋白質(zhì)(例如，白蛋白)、糖(例如，N-連接的聚糖或O-連接的聚糖，例如甘露糖)(參見，例如Sola等人，J.Pharm.Sc1.98:1123-1245，2009)、或顯著增加可溶性MANF在受試者中的半衰期或增加可溶性MANF(例如，在貯藏期間)的熱穩(wěn)定性的聚合物(例如，聚乙二醇))。用于這些方法的可溶性MANF蛋白還可包括HIV tat蛋白或增加可溶性MANF蛋白的細胞滲透性的任何其它部分。
[0192]使用分子生物學(xué)和細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白(例如，重組可溶性MANF)的幾種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，由mRNA序列(例如，含有與SEQ ID NO: 3至少80%同一(例如，至少 85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一的序列的mRNA)編碼的可溶性MANF可轉(zhuǎn)染至允許可溶性MANF被轉(zhuǎn)染細胞表達的細菌、酵母或哺乳動物細胞(使用蛋白表達質(zhì)?；虿《据d體)中?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來收集轉(zhuǎn)染細胞或培養(yǎng)基、并將重組可溶性MANF蛋白純化。多種編碼其它哺乳動物可溶性MANF蛋白的其它核酸(mRNA)是本領(lǐng)域已知的。
[0193]在某些實施方案中，首先使用本文記載的任一種診斷方法、或者本文記載的或本領(lǐng)域已知的預(yù)測受試者處于發(fā)展胰腺β-細胞紊亂的風(fēng)險的任一種方法來鑒別或選擇受試者用于治療。
[0194]受試者可施用至少一劑(例如，至少2、3、4或5劑)的可溶性MANF (例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白)和/或阿樸嗎啡?？扇苄訫ANF和/或阿樸嗎啡可至少每天一次(例如，每天兩次、每天三次和每天四次)、至少每周一次(例如，每周兩次、每周三次、每周四次)和/或至少每個月一次施用至受試者。受試者可被長時間(例如，至少一個月、兩個月、六個月、一年、兩年、三年、四年或五年)治療(例如，周期性施用可溶性MANF)。如本文詳細記載的，施用至受試者的可溶性MANF和/或阿樸嗎啡的劑量可由醫(yī)師通過考慮多種生理因素，包括但不限于，受試者的性別、受試者的體重、受試者的年齡和其它醫(yī)療狀況的存在來確定?？扇苄訫ANF和/或阿樸嗎啡可口服、靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、顱內(nèi)注射或經(jīng)注射入腦脊液而施用至受試者。同樣地，試劑可制成固體(例如，用于口服)或生理上可接受的液體載體(例如，鹽水)(例如，用于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、肌肉或腦脊給藥)。
[0195]在某些實施方案中，受試者另外施用至少一種(例如，兩種、三種、四種或五種)其它胰腺β-細胞紊亂治療(例如，本文記載的胰腺細胞紊亂的任一種治療，如本文記載的任一種胰島素)。在某些實施方案中，可溶性MANF和/或阿樸嗎啡與至少一種(例如，兩種、三種或四種)其它胰腺β-細胞紊亂治療一起配制(例如，在全身給藥用生理上可接受的緩沖液或培養(yǎng)基中配制)(如，本文記載的任一種藥物組合物)。
[0196]減少胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法
[0197]還提供減少胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。這些方法包括使胰腺β -細胞與有效量的一種或多種(例如，兩種或三種)可溶性MANF (例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白，如包含與SEQ ID NO: 2至少80%同一的序列的重組、純化或分離的可溶性MANF蛋白)、阿樸嗎啡和吡格列酮。在某些實施方案中，胰腺β_細胞在體外(組織培養(yǎng))。在某些實施方案中，胰腺細胞可在受試者中。用于這些實驗的胰腺細胞可為本文記載的任一種胰腺β-細胞。
[0198]在某些實施方案中，胰腺細胞可與可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)接觸較長的一段時間(例如，至少15分鐘、30分鐘、I小時、2小時、6小時、8小時、10小時、12小時或24小時)。在某些實施方案中，胰腺細胞與幾劑(例如，至少兩劑、三劑、四劑或五劑)的可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)以例如有規(guī)律的時間間隔(約每天一次、每周一次或每個月一次)相接觸。
[0199]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的減少可使用本領(lǐng)域已知的任意方法用于檢測細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來確定(例如,檢測或分析本文記載的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的任一種標(biāo)記物)。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的減少可通過細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種或多種標(biāo)記物的減少來檢測。在某些實施方案中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的減少可通過一個或多個下列事件觀察:grp78 (BiP)的誘導(dǎo)或bag-1表達的減少；激活、高爾基體轉(zhuǎn)位、蛋白酶裂解或ATF6核轉(zhuǎn)位的減少；PERK激活、寡聚或自體磷酸化的減少；IRE1的激活的減少；eIF2a磷酸化的減少；XBP1 mRNA的內(nèi)含子加工的減少；JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活的減少；胱天蛋白酶原4的激活和裂解的減少；以及通過暴露至ER-應(yīng)激誘導(dǎo)劑而誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原環(huán)境移動的減少(例如，與暴露于ER-應(yīng)激誘導(dǎo)劑但不用可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)處理的對照胰腺β-細胞相比)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原環(huán)境移動的減少可使用氧化還原敏感型染料或蛋白質(zhì)，例如實施例中記載的報告蛋白來測量。在某些實施方案中，胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的減少可相對于不與可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種相接觸的胰腺β-細胞中觀察或檢測的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的量分別相比較(例如，在體外或在受試者中)。在某些實施方案中，胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的減少，是相對于不與可溶性MANF蛋白、阿樸嗎啡或吡格列酮相接觸但與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑(如毒胡蘿卜素)相接觸的對照胰腺β-細胞的。
[0200]這些方法可由醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，本文記載的任一類醫(yī)療保健專業(yè)人員)或科學(xué)家進行。
[0201]減少或延緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡的方法
[0202]具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的胰腺細胞可激活細胞內(nèi)的凋亡通路。本文還提供減少或延緩兩個或多個胰腺β -細胞群體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡的方法，所述方法包括使胰腺β -細胞的群體與有效量的可溶性MANF (例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白)、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)相接觸。
[0203]在某些實施方案中，胰腺β -細胞是在體外的(組織培養(yǎng))。在某些實施方案中，胰腺β_細胞可在受試者中(例如，在移植的生物相容性材料或聚合物中)。用于這些方法的胰腺細胞可為本文記載的任意胰腺細胞。在某些實施方案中，胰腺細胞可與可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)接觸較長的一段時間(例如，至少15分鐘、30分鐘、I小時、2小時、6小時、8小時、10小時、12小時或24小時)。在某些實施方案中，胰腺細胞與幾劑(例如，至少兩劑、三劑、四劑或五劑)可溶性MANF、吡格列酮和阿樸嗎啡例的一種或多種(例如,兩種或三種)例如以有規(guī)律的時間間隔相接觸。
[0204]胰腺細胞群體中凋亡的發(fā)生和時機可使用本文記載的任一種方法或本領(lǐng)域已知的那些方法確定。使胰腺細胞群體與可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)相接觸可調(diào)節(jié)胰腺細胞在經(jīng)受凋亡(例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡)的群體中的百分比下降或延緩在胰腺β_細胞群體內(nèi)凋亡的發(fā)生。在某些實施方案中，用可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)處理的細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡的降低或延緩可與不用可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)處理的胰腺細胞群體相比較。在某些實施方案中，在用可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)處理的細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡的降低或延緩可與不用可溶性MANF、阿樸嗎啡和吡格列酮的一種或多種(例如，兩種或三種)處理但與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑(例如毒胡蘿卜素)接觸的對照胰腺細胞群體相比較。
[0205]檢測凋亡性細胞死亡的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，細胞胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶原_3和胱天蛋白酶原-4)的裂解,Hoescht和7_氨基-放線菌素攝取，TdT-介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記試驗(dUTP nick end labeling assay),和膜聯(lián)蛋白膜染色。各種用于檢測凋亡性細胞死亡的試劑盒是商購可得的。
[0206]藥物組合物
[0207]本文還提供包含至少一種可溶性MANF(例如，本文記載的任一種可溶性MANF蛋白，如，純化、分離或重組的可溶性MANF)和/或阿樸嗎啡，以及至少一種針對胰腺β -細胞紊亂的其它處理(例如，一種或多種本文記載的胰腺β -細胞紊亂的任意處理，例如，吡格列酮、TUDCA和本文記載的任一種胰島素)的藥物組合物。
[0208]在某些實施方案中，組合物配制有藥學(xué)可接受載體。藥物組合物和制劑可腸胃外、口服或例如通過氣溶膠或透皮等的通過局部給藥來施用。藥物組合物可以任何方式配制并可以各種單位劑型施用，依賴于病況或疾病以及患病程度、各患者的總體醫(yī)療狀況和所得優(yōu)選使用方法等。藥物配制和施用的技術(shù)細節(jié)在科學(xué)文獻和專利文獻中很好地記載，參見例如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，2005。
[0209]本文提供的藥物組合物可以任何用于人類醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)的常規(guī)方式為施用而配制。濕潤劑、乳化劑和潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑，釋放劑(release agents),涂布劑,甜味、風(fēng)味和芳香劑,防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。
[0210]本發(fā)明的組合物的制劑包括那些適用于皮內(nèi)給藥、吸入給藥、口服/鼻腔給藥、局部給藥和/或腸胃外給藥。制劑可以單位劑型方便地呈遞并可通過藥物領(lǐng)域公知的任何方法制備?？膳c載體材料結(jié)合產(chǎn)生單一劑型的活性成分(例如，可溶性MANF和/或阿樸嗎啡，以及胰腺β_細胞紊亂的一種或多種附加治療劑)的量將根據(jù)待治療的宿主、特定的施用模式如皮內(nèi)或吸入而變化。可與載體材料結(jié)合產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量一般將是產(chǎn)生治療效果(例如，本文記載的一種或多種任意的治療效果)的化合物的量。
[0211]本發(fā)明的藥物制劑可根據(jù)藥物制造領(lǐng)域已知的任何方法來制備。此類藥物可包含甜味劑、風(fēng)味劑、著色劑和防腐劑。制劑可與適用于制造的無毒藥學(xué)可接受賦形劑混合。制齊阿包括一種或多種稀釋劑、乳化劑、防腐劑、緩沖劑、賦形劑等，并可以諸如液劑、粉劑、乳液、凍干粉、噴霧劑、霜劑、洗劑(lot1ns)、控釋制劑、片劑、丸劑、凝膠、在貼劑上、在移植物中等的形式提供。
[0212]口服用藥物制劑可使用本領(lǐng)域公知的藥學(xué)可接受載體以適當(dāng)且適合的劑量配制。此類載體使得藥物能夠以單位劑型配制為適用于被患者攝取的片劑、丸劑、粉劑、糖衣劑(dragees)、膠囊、液劑、錠劑(lozenges)、凝膠、糖衆(zhòng)劑、衆(zhòng)液、混懸劑等?？诜盟幬镏苿┛膳渲茷楣腆w賦形劑，任選地研磨所得混合物，并根據(jù)需要在添加適當(dāng)?shù)母郊踊衔锖蠹庸ゎw粒的混合物，從而獲得片劑或糖衣劑核(dragee cores)。適合的固體賦形劑為碳水化合物(carbohydrate)或蛋白質(zhì)填料,包括,例如包括乳糖、鹿糖、甘露醇或山梨醇等的糖類；來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；和包括阿拉伯樹膠和西黃耆膠等的膠類；以及例如明膠和膠原等的蛋白質(zhì)?？商砑颖澜鈩┗蛟鋈軇?solubilizing agents)如交聯(lián)聚乙烯卩比咯燒酮,瓊脂,海藻酸、或其鹽如海藻酸鈉。推入配合膠囊(Push-fit capsules)可包含與填料或粘結(jié)劑混合的活性劑如乳糖或淀粉，潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及任選地穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性劑可在有或沒有穩(wěn)定劑的情況下溶解或懸浮在適合的液體如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。
[0213]水性懸浮液可在與適用于制造水性懸浮液的例如適用于水性皮內(nèi)注射的賦形劑的混合物中包含活性劑(例如，可溶性MANF和/或阿樸嗎啡，以及胰腺β -細胞紊亂的一種或多種附加處理)。此類賦形劑包括懸浮劑如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃耆膠和阿拉伯樹膠，以及分散劑或濕潤劑如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、環(huán)氧烷(alkylene oxide)與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物(例如，十七碳亞乙基氧基鯨蠟醇(heptadecaethylene oxycetanol))、環(huán)氧乙燒與源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)、或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。水性懸浮液還可包含一種或多種防腐劑如乙基或正丙基對羥基苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種風(fēng)味劑，和一種或多種甜味劑如鹿糖、阿斯巴甜或糖精。可按重量克分子滲透濃度(osmolarity)調(diào)節(jié)制劑。
[0214]在某些實施方案中，油基藥物(oil-based pharmaceutical)用于施用。油基懸浮液可通過在植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或在礦物油如液體石蠟中；或這些的混合物中懸浮活性劑來配制。參見，例如美國專利5，716，928號，其記載了使用精油或精油組分用于增加生物利用度并減少口服疏水性藥物化合物的個體間和個體內(nèi)的變異性(還參見美國專利5，858，401號)。油性懸浮液可包含增稠劑如蜂蠟、固體石蠟(hardparaffin)或鯨蠟醇?？商砑犹鹞秳┮蕴峁┛煽诘目诜苿绺视?、山梨糖醇或蔗糖。這些制劑可通過添加抗氧化劑如抗環(huán)血酸來保藏。作為可注射的油性載體的實例，參見Mintoj J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102，1997。
[0215]藥物制劑還可為水包油型乳液的形式。油相可為上述植物油或礦物油，或者這些的混合物。適合的乳化劑包括天然存在的膠類如阿拉伯樹膠和西黃耆膠、天然存在的磷脂如大豆卵磷脂、源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯如山梨糖醇酐單油酸酯、和這些偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。乳液還可如糖漿劑和酏劑(elixirs)的制劑包含甜味劑和風(fēng)味劑。此類制劑還可包含緩和劑(demulcent)、防腐劑或著色劑。在替代的實施方案中，本發(fā)明的這些可注射的水包油型乳液包括石蠟油、山梨糖醇酐單硬脂酸酯、乙氧基化山梨糖醇酐單油酸酯和/或乙氧基化山梨糖醇酐三油酸酯。
[0216]藥物化合物還可通過鼻內(nèi)或眼內(nèi)途徑施用，包括吹入劑(insufflat1n)、粉劑和氣溶膠制劑(對于甾類吸入劑(inhalant)的實例，參見例如Rohatagi, J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193, 1995 ；Tjwa, Ann.Allergy Asthma Immunol.75:107-111，1995)。
[0217]在某些實施方案中，藥物化合物可通過局部途徑透皮給藥，制成敷藥棒、溶液、懸浮液、乳液、凝膠、霜劑、膏劑、糊劑、凝膠劑、涂料、粉劑和氣溶膠。
[0218]在某些實施方案中，藥物化合物還可作為微球給藥用于體內(nèi)緩釋。例如，微球可經(jīng)透皮注射皮下緩釋的藥物來施用；參見Rao，J.B1mater Sc1.Polym.Ed.7:623-645，1995 ；作為生物可降解和可注射的凝膠制劑，參見例如Gao，Pharm.Res.12:857-863, 1995 ;或者作為口服用微球,參見,例如 Eyles, J.Pharm.Pharmacol.49:669-674，1997。
[0219]在某些實施方案中，藥物化合物可腸胃外施用，例如通過靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用，或施用于受試者的體腔、器官內(nèi)腔內(nèi)，或施用于受試者的腦脊液內(nèi)。這些制劑可包括溶解在藥學(xué)可接受載體中的活性劑的溶液。可采用的可接受載體和溶劑為水和林格氏溶液(Ringer’s solut1n),或者等滲氯化鈉。另外,無菌固定油可用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于該目的，可使用包括合成單-或雙甘油酯等的任何溫和(bland)的固定油(fixed
oil)。另外，脂肪酸如油酸可類似地用于可注射制劑中。這些溶液為無菌的，且通常不含不期望的物質(zhì)。這些制劑可通過常規(guī)公知的滅菌技術(shù)滅菌。制劑可根據(jù)為接近生理條件的需要包含藥學(xué)可接受佐劑物質(zhì)，例如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑，如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、和乳酸鈉等。這些制劑中的活性劑的濃度可廣泛變化，并將主要基于流體體積、粘度和體重等，按照所選擇的或患者需要的特定施用模式來選擇。對于IV施用，制劑可為無菌可注射制劑，如無菌可注射水性或油質(zhì)懸浮液。該懸浮液可使用那些適合的分散或濕潤劑和懸浮劑來配制。無菌可注射制劑還可為非毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑的懸浮液如1，3-丁二醇的溶液中。施用可為快速濃注的(by bolus)或連續(xù)的(例如，基本上不間斷地導(dǎo)入血管中特定的一段時間)。
[0220]在某些實施方案中，藥物化合物和制劑可凍干。包括可溶性MANF和/或阿樸嗎啡以及胰腺β-細胞紊亂的一種或多種附加處理的穩(wěn)定的凍干制劑可通過將包括可溶性MANF和/或阿樸嗎啡以及一種或多種附加處理和填充劑(bulking agent)例如甘露醇、海藻糖、棉籽糖和蔗糖，或其混合物的溶液凍干來制備。制備穩(wěn)定的凍干制劑的過程可包括凍干約2.5mg/mL蛋白質(zhì)、約15mg/mL鹿糖、約19mg/mL NaCl和pH大于5.5且小于6.5的梓檬酸鈉緩沖液的溶液。參見例如US2004/0028670。
[0221]組合物和制劑可通過使用脂質(zhì)體來給藥。通過使用脂質(zhì)體，特別是對靶細胞特異的、或者是另外優(yōu)選針對特定器官的脂質(zhì)體表面載體配體，技術(shù)人員可聚焦于在體內(nèi)活性劑向靶細胞內(nèi)的遞送。參見例如，美國專利6，063，400和6，007，839號；A1-Muhammed, J.Microencapsul.13:293-306，1996 ；Chonn, Curr.0pin.B1technol.6:698-708，1995 ；和Ostro, Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587，1989。
[0222]本發(fā)明的制劑可用于預(yù)防性和/或治療性處理而施用。在某些實施方案中，對于治療性應(yīng)用，組合物以足以治愈、減輕或部分阻止紊亂或其并發(fā)癥的臨床表現(xiàn)的量施用至處于本文記載的紊亂的風(fēng)險或患有本文記載的紊亂的受試者；這可稱為治療有效量。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物以足以減少癥狀數(shù)量或減少受試者的胰腺β-細胞紊亂的一個或多個癥狀的嚴重程度、持續(xù)時間或頻率的量施用。
[0223]適合于完成該處理的藥物組合物的量為治療有效劑量。劑量方案(dosageschedule)和對該用途有效的量，即給藥方案(dosing regimen)將依賴于各種因素,包括疾病或病況的階段、疾病或病況的嚴重程度、患者健康的總體狀況和患者的身體狀況、和年齡等。在計算患者的給藥方案時，施用模式也考慮在內(nèi)。
[0224]給藥方案還考慮本領(lǐng)域公知的藥代動力學(xué)參數(shù)，即，活性劑的吸收率、生物可利用率、新陳代謝和清除率(clearance)等(參見，例如Hidalgo-Aragones, J.Steroid B1chem.Mo 1.B1l.58:611-617，1996 ；Groning, Pharmaz i e 5 1: 337-341, 1996 ；Fotherby, Contracept1n 54:59-69，1996 ；Johnson,J.Pharm.Sc1.84:1144-1146, 1995 ；Rohatagi, Pharmazie 50:610-613, 1995 ；Brophy, Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108, 1983:Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 21版，2005)。目前技術(shù)水平允許臨床醫(yī)生確定各單獨患者的給藥方案、活性劑、和治療的疾病或病況。為用作藥物的類似的組合物提供的指南可用作確定給藥方案即劑量方案和劑量水平、施用的實施本發(fā)明的方法是正確且合適的指南。
[0225]可根據(jù)下列給出制劑的單一或多個施用，例如:根據(jù)需要的劑量和頻率，和患者的耐受等。制劑應(yīng)為了有效治療，防止或改善病況、疾病或癥狀而提供足夠量的活性劑。
[0226]在替代的實施方案中，口服用藥物制劑日用量在每天每千克體重約I至100或更多mg之間。與口服相反，施用至血流中、至體腔中或至器官內(nèi)腔中可使用較低的劑量。基本上較高的劑量可用于局部或口服施用或通過粉劑、噴霧劑或吸入劑施用。實際用于制備腸胃外或非腸胃外可施用制劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知或顯而易見的，并且更詳細地記載于諸如下述的出版物等中，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，2005。
[0227]試劑盒
[0228]還提供包含特異性結(jié)合至可溶性MANF蛋白(如本文記載的任一種可溶性MANF蛋白)的至少一種抗體或抗原結(jié)合性的抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di_scFv或sdAb)和特異性結(jié)合至的胰腺細胞紊亂的另一標(biāo)記物(例如，胰島素、C-蛋白和ΙΑΡΡ)的至少一種(例如，兩種、三種或四種)抗體或抗原結(jié)合性抗體片段的試劑盒。在某些實施方案中，包括在試劑盒中的抗體或抗原結(jié)合性抗體片段位于底物上(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗)。在某些實施方案中，試劑盒可進一步包括分離、純化或重組的可溶性MANF蛋白(例如，本文記載的任一種可溶性MANF)。在某些實施方案中，一種或多種抗體或抗原結(jié)合性抗體片段被標(biāo)記(例如，放射性同位素、熒光團或結(jié)合蛋白(如抗生物素蛋白(avidin))。這些試劑盒可用于，例如用于診斷胰腺β_細胞紊亂，鑒別受試者處于發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險，或監(jiān)測受試者的胰腺β-細胞功能或胰腺β-細胞團。在某些實施方案中，試劑盒可另外包含進行本文記載的任一種方法的說明。
[0229]報告蛋白
[0230]本文提供的方法使用報告蛋白，所述報告蛋白包含結(jié)合蛋白(BiP)信號序列(例如，小鼠或人BiP信號序列)、氧化還原敏感的熒光蛋白(例如，氧化還原敏感的綠色熒光蛋白和氧化還原敏感的黃色熒光蛋白)和氨基酸序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)。在某些實施方案中，BiP信號序列位于N-末端,氧化還原敏感的突光蛋白位于BiP信號序列的C-末端，氨基酸序列KDEL位于氧化還原敏感的熒光蛋白的C末端。在某些實施方案中，在存在于報告蛋白中的兩個或多個獨立的蛋白質(zhì)元件(protein elements)(例如,BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白和KDEL序列)之間存在I至100個氨基酸(例如，I至50、1至40、I至30、I至25、I至20、I至15和I至10個氨基酸)。氧化還原敏感的綠色熒光蛋白的氨基酸序列在下面列出。
[0231]氧化還原敏感的綠色熒光蛋白(SEQ ID NO: 10)
[0232]MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGE⑶ATYG KLTLKFIVTT GKLPVPffPTLVTTFXLQCFA RYPDHMKRHD FFKSAMPEGY VQERTIFFKD DGNYKTRAEV Ki7E⑶TLVNR IELKGIDFKEDGNILGHKLE YNYNSHCVYI VADKQKNGIK VNFKIRHNIE DGSVQLADHY QQNTPI⑶GP VLLPDNHYLCYQSALSKDPN EKRDHMVLLE FVTAAGITHG MDELYK
[0233]本文記載的報告蛋白可包含與SEQ ID NO: 10至少80% (例如，至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)同一的序列(只要所得蛋白質(zhì)保持其氧化還原敏感的熒光特性即可)。例如，引入至氧化還原敏感的綠色熒光蛋白或氧化還原敏感的黃色熒光蛋白的突變不應(yīng)包括半胱氨酸中的突變。在某些實施方案中，氧化還原敏感的突光蛋白為氧化還原敏感的黃色突光蛋白(例如，rxYFP ;記載于Ostergaard等人，EMBO J.20:5853-5862，2001)。氧化還原敏感的熒光蛋白的其它實例記載于Merksamer等人(Cell 135:933-947，2008)和 Dooley 等人(J.B1l.Chem.279:22284-22293，2004)。
[0234]可存在于報告蛋白的示例性人和小鼠BiP信號序列在下面示出。用于本文記載的方法的報告蛋白可包含任意哺乳動物BiP信號序列(例如，人或小鼠BiP信號序列)。
[0235]在某些實施方案中，報告蛋白和編碼這些報告蛋白的核酸提供靈敏的(例如，顯著改善的)檢測完整(intact)胰腺β_細胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境中的微小波動的手段。
[0236]人BiP 信號序列(SEQ ID NO: 12)
[0237]MKLSLVAAMLLLLSAARA
[0238]小鼠BiP 信號序列(SEQ ID NO: 13)
[0239]MMKFTVAAALLLLGAVRA
[0240]在某些實施方案中，報告蛋白含有如下序列，該序列與含有SEQ ID NO: 14的序列(在下面示出)的報告蛋白至少80%同一(例如，至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一)。在某些實施方案中，報告蛋白由含有與SEQID Ν0:15 至少 80% 同一(例如，至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一)的序列的核酸編碼。例如，SEQ ID NO: 14的報告蛋白中的突變不應(yīng)包括半胱氨酸中的突變。SEQ ID NO: 14的不同突變可使用本文記載的任一種方法測試來確定突變體是否保持它們的氧化還原依賴的熒光特性。包含與SEQ ID NO: 14(MER0S-GFP)至少80%同一的序列的蛋白質(zhì)的特定的氧化還原依賴的熒光特性在實施例中詳細記載。
[0241]MER0S-GFP 蛋白(SEQ ID NO: 14)
[0242]MMKFTVVAAALLLLGAVRAEEEDPPVATMSKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFISTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFE⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNCHKVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLL.PDNHYLKTCSALSKDPNEKRDHMVLLERVTAAGITHGMDELYKTSGGPPPTGEEDTSEKDEL
[0243]MEROS-GFP mRNA(SEQ ID NO:15)
[0244]atgatgaagttcactgtggtggcggcggcgttgctgctgctgggcgcggtgcgggccgaggaggaggatccaccggtcgccaccatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttccactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcagttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactgccacaaggtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagat ggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgaagacatgctctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagcgcgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaaactagtggaggccctcccccaactggtgaagaggatacatcagaaaaagatgagttgtag
[0245]候選試劑的篩選方法
[0246]還提供用于下列一個或多個方面的候選化合物的篩選方法:治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂的發(fā)病，降低胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和減少或延緩胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡。這些方法包括提供胰腺β -細胞，使胰腺β -細胞與候選化合物接觸，并確定在候選化合物存在下由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平，并將由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平與可溶性MANF的參考水平相比較。在這些方法中，與參考水平相比由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平升高表明試驗化合物可用于下列一個或多個方面:治療或延緩受試者的胰腺β_細胞紊亂的發(fā)病，降低胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和減少或延緩胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡。
[0247]用于這些方法的胰腺β -細胞可為本文記載的任一種胰腺β -細胞(例如，胰腺β -細胞系(例如，本文記載的任一種胰腺β -細胞系)或初級胰腺β -細胞)。
[0248]可溶性MANF的水平可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(例如，本文記載的任何以抗體為基礎(chǔ)的方法)確定。該方法可由任何醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、醫(yī)師助理、化驗員、或護士助理)或科學(xué)家來進行。
[0249]在某些實施方案中，參考水平為在不存在候選化合物的情況下由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平。在某些實施方案中，參考水平為存在于不患有胰腺β-細胞紊亂、不具有胰腺細胞紊亂的癥狀或胰腺細胞紊亂家族史的受試者中的可溶性MANF的水平。在某些實施方案中，參考水平為在來自哺乳動物的初級胰腺細胞或哺乳動物胰腺細胞系中產(chǎn)生的可溶性MANF的水平。在某些實施方案中，參考水平為可溶性MANF的閾值水平。
[0250]還提供篩選用于治療或延緩受試者的胰腺β -細胞紊亂的發(fā)病，降低胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和/或減少或延緩胰腺β -細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的候選化合物的方法。這些方法包括提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞(例如，哺乳動物細胞胰腺β -細胞或胰腺細胞系)；使細胞與試驗化合物接觸；確定細胞中氧化的報告蛋白的存在量；和將細胞中氧化的報告蛋白的存在量與參考水平相比較；與參考水平相比細胞中氧化的報告蛋白的水平升高表明候選化合物可用于治療或延緩受試者的胰腺β-細胞紊亂發(fā)病，降低胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和/或減少或延緩胰腺β_細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡。在某些實施方案中，參考水平為在不存在候選試劑的情況下哺乳動物細胞中的氧化的報告蛋白的存在量。在某些實施方案中，細胞與候選試劑和誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑二者相接觸，并且參考水平為存在于單獨用誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑處理的細胞中的氧化的報告蛋白的水平。誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑的非限制性實例記載于本文中。誘導(dǎo)ER應(yīng)激的其它實例是本領(lǐng)域已知的。在某些實施方案中，參考水平為氧化的報告蛋白的閾值水平。所用細胞可為人、小鼠、大鼠、豬、猴或牛細胞。細胞可為本文記載的或本領(lǐng)域已知的任何胰腺細胞系。在某些實施方案中，報告蛋白為SEQ ID Ν0:14，或含有與SEQ ID Ν0:14至少80% (例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% )同一的序列的蛋白質(zhì)。
[0251]還提供篩選用于治療或延緩受試者的胰腺β -細胞紊亂的發(fā)病，降低胰腺β -細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和/或減少或延緩胰腺β -細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的候選化合物的方法。該方法包括提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞(例如，哺乳動物細胞胰腺β-細胞)；使細胞與試驗化合物接觸；確定細胞中還原的報告蛋白的存在量；和將細胞中還原的報告蛋白的存在量與參考水平相比較；與參考水平相比細胞中還原的報告蛋白的水平升高表明候選化合物可用于治療或延緩受試者的胰腺細胞紊亂發(fā)病，降低胰腺細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，和/或減少或延緩胰腺細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡。在某些實施方案中，參考水平為在不存在候選試劑的情況下哺乳動物細胞中的還原的報告蛋白的存在量。在某些實施方案中，細胞與候選試劑和誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑二者相接觸，并且參考水平為存在于單獨用誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑處理的細胞中的還原的報告蛋白的水平。誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑的非限制性實例記載于本文中。誘導(dǎo)ER應(yīng)激的其它實例是本領(lǐng)域已知的。在某些實施方案中，參考水平為還原的報告蛋白的閾值水平。所用細胞可為人、小鼠、大鼠、豬、猴或牛細胞。細胞可為本文記載的或本領(lǐng)域已知的任何胰腺細胞系。在某些實施方案中，報告蛋白為SEQ ID NO: 14，或含有與SEQ ID NO: 14至少80% (例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% )同一的序列的蛋白質(zhì)。
[0252]在某些實施方案中，通過檢測細胞中報告蛋白的一個或多個熒光性質(zhì)(例如，檢測還原或氧化形式的報告蛋白所特有的光譜特征)來進行確定。在某些實施方案中，還原或氧化形式的報告蛋白的水平使用熒光平板讀數(shù)器或使用熒光輔助細胞分選術(shù)(FACS)確定。
[0253]例如，表達報告蛋白的胰腺細胞(例如，INS-1 832/13)可接種(plated)至
6-孔板中，與候選化合物接觸，然后通過胰蛋白酶消化來收集。用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌后，細胞可懸浮在適合的介質(zhì)(例如，IImM葡萄糖-漢克斯緩沖鹽溶液)中，用LSRII (BD)進行FACS，從而確定存在于細胞中的還原或氧化形式的報告蛋白的水平。
[0254]在某些實施方案中，熒光平板讀數(shù)器可用于確定存在于細胞中的還原或氧化形式的報告蛋白的水平。例如，胰腺細胞系(如INS-1 832/13細胞)可接種至96-孔板中并用候選試劑處理。還原或氧化形式的報告蛋白的水平可使用熒光平板讀數(shù)器檢測。在該實施方案中，背景信號的減去應(yīng)在確定還原或氧化形式的報告蛋白的水平之前進行。
[0255]在某些實施方案中，報告蛋白包含SEQ ID NO: 14或含有與SEQ ID NO: 14至少80%同一的序列的蛋白質(zhì)。在這些實施方案中，還原形式的報告蛋白具有473nM的激發(fā)波長和510nM的發(fā)射波長，氧化形式的報告蛋白具有394nM的激發(fā)波長和510nM的發(fā)射波長。
[0256]在這些方法的某些實施方案中，可確定細胞中還原形式的報告蛋白的水平與氧化形式的報告蛋白的水平之比。在這些方法中，計算的比可與參考比相比較。參考比可為來自未用候選試劑處理的細胞的比。參考比還可為閾值比。在某些實施方案中，細胞與候選試劑和誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑相接觸，確定細胞中還原形式的報告蛋白的水平與氧化形式的報告蛋白的水平之比，并將細胞中的比與來自單獨用誘導(dǎo)ER應(yīng)激的試劑處理的細胞的參考比相比較。在這些方法中，使得與參考比相比細胞中的比下降的候選試劑定義為用于治療受試者的胰腺細胞紊亂的候選試劑。
[0257]上述方法的某些實施方案進一步包括在胰腺β -細胞紊亂的動物模型中試驗候選化合物(例如，確定候選化合物的施用是否會治療動物模型中胰腺細胞紊亂的一個或多個癥狀(例如，減少嚴重程度、頻率或持續(xù)時間)或延緩動物模型中胰腺細胞紊亂的一個或多個癥狀的發(fā)生)。2型糖尿病的非限制性動物模型包括朱克肥胖大鼠(Zucker fatty rats, ZFR)、ob/ob (肥胖(obese))小鼠、cp(肥胖(corpulent))大鼠、朱克糖尿病肥胖型(ZDF)大鼠、沙鼠(肥沙鼠(Psammomys obesus))、為恒河猴(obsessrhesus monkeys)、KK 小鼠和 KK-Ay 小鼠(記載于 Srinivasan 等人，Indian J.Med.Res.125:451-472, 2007)。I型糖尿病的非限制性動物模型包括非肥胖的糖尿病型(NOD)小鼠和生物育種(BB)大鼠(記載于Rees等人，Diabetic Med.22:359—370，2005)。胰腺β-細胞紊亂的一個或多個癥狀的嚴重程度或發(fā)生可在這些動物中使用本文記載的方法或本領(lǐng)域已知的方法確定或觀察。
[0258]上述方法的某些實施方案進一步包括試驗候選化合物是否會降低或延緩胰腺β-細胞群體中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡(例如，與在不存在候選試劑的情況下的用誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑處理的胰腺β -細胞群體相比，減少或延緩用候選試劑和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑處理的胰腺β-細胞群體中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡)。用于檢測凋亡性細胞死亡的方法是本領(lǐng)域已知的并包括，但不限于，細胞胱天蛋白酶(cellular caspases)(例如,胱天蛋白酶原_3和胱天蛋白酶原_4)的裂解、Hoescht和
7-氨基-放線菌素攝取，TdT-介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記試驗，和膜聯(lián)蛋白膜染色。各種用于檢測凋亡性細胞死亡的試劑盒是商購可得的。
[0259]上述方法的某些實施方案包括試驗候選化合物是否防止或延緩胰腺β -細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激其它標(biāo)記物的誘導(dǎo)(例如，候選化合物是否減少grp78 (BiP)或bag-1表達的誘導(dǎo)；減少激活，高爾基體轉(zhuǎn)位，蛋白酶裂解或ATF6的核轉(zhuǎn)位；減少PERK激活、低聚或自體磷酸化；減少IREl的激活；減少eIF2a的磷酸化；減少XBPl mRNA的內(nèi)含子加工；減少JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活；防止胱天蛋白酶原(proCaSpaSe)4的激活和裂解；和/或防止或減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原環(huán)境的變化(例如，使用本文記載的任一種報告蛋白測量))。BiP和Bag-1的表達水平可使用定量實時PCR利用設(shè)計為與BiP或Bag-1的部分雜交的幾組引物確定。BiP、Bag-1、PERK、IREl、eIF2a、XBP1和ATF6的表達水平或加工、激活、磷酸化或細胞定位還可使用與一個B i P、Bag-1、PERK、I RE 1、e IF2 α、XBPI或ATF6特異性結(jié)合的抗體利用本領(lǐng)域已知的方法確定。在某些實施方案中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個或多個標(biāo)記物的防止或延緩是將用候選試劑和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑處理的細胞與在不存在候選試劑的情況下用誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑處理的一種或多種胰腺β-細胞相比較。
[0260]任一種類型的候選化合物可用于上述方法。候選化合物，例如可為蛋白質(zhì)、肽、核酸(如RNA或DNA)、無機化合物、脂質(zhì)、寡糖、或其任意組合?？捎糜谏鲜龇椒ǖ暮蜻x化合物的文庫是商購可得的。
[0261]要篩選的候選化合物可使用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中多種手段中的任一種獲得，包括:生物文庫；空間尋址平行固相或溶液相文庫；需要反褶積(deconvolut1n)的合成文庫法；“一珠一化合物(one-bead one-compound) ”文庫法；和使用親和層析選擇的合成文庫法。生物文庫手段僅限于肽文庫，而其它四種手段適用于肽、非肽低聚物或小分子化合物文庫(Lam, Anticancer Drug Des., 12:145，1997)。
[0262]用于合成分子文庫的方法的實例可見于文獻，例如=DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,90:6909，1993 ;Erb 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,91:11422, 1994 ；Zuckermann 等人，J.Med.Chem., 37:2678, 1994 ；Cho 等人，Science 261:1303, 1993 ；Carrell 等人，Angew.Chem.1nt.Ed.Engl., 33:2059，1994 ；Carell 等人，Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.，33:2061，1994 ;和 Gallop 等人，J.Med.Chem.，37:1233，1994。
[0263]化合物的文庫可存在于溶液中(例如，Houghten，B1/Techniques, 13:412-421，1992)，或在珠上(Lam, Nature, 354:82-84，1991)，芯片上(Fodor, Nature 364:555-556，1993)，細菌上(美國專利 5，223，409)，孢子上(美國專利 5，571，698 ;5，403，484 ；和 5，223，409)，質(zhì)粒上(Cull 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A., 89:1865-1869，1992)或噬菌體上(Scott 和 Smith, Science, 249:386-390，1990 ；Devl in, Science, 249: 404-406，1990 ; Cwirla 等人，Proc.Nat 1.Acad.Sc1.U.S.A.，87:6378-6382，1990 ;和 Felici, J.Mol.B1l.，222:301-310，1991)。
[0264]實施例
[0265]實施例1.胰腺β -細胞中可溶性MANF表達在ER應(yīng)激期間增加
[0266]進行實驗來確定是否可溶性MANF的表達在應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的胰腺β -細胞中被誘導(dǎo)。這些實驗使用嚙齒類胰腺細胞系(INS-1 832/13 and MIN6)、初級小鼠和人胰島、和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的兩種不同的化學(xué)試劑(毒胡蘿卜素和衣霉素)進行。INS-1 832/13細胞在包含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉和0.1% β-巰基乙醇的RPM1-1640中培養(yǎng)。初級胰島從Prodo獲得，并接種于預(yù)涂有804G細胞產(chǎn)生的層粘連蛋白V的6-孔板中，并在增補有胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和抗生素的CMRL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0267]在用毒胡蘿卜素(50ηΜ)處理后的培養(yǎng)的大鼠胰腺β _細胞系(INS-1 832/13)的培養(yǎng)基中檢測可溶性MANF蛋白(圖1)。在用5 μ M衣霉素或20ηΜ毒胡蘿卜素處理24小時后的相同細胞系中檢測MANF mRNA的升高水平(圖2)。
[0268]來自使用小鼠初級胰島進行的實驗的數(shù)據(jù)進一步顯示，用0.5 μ M毒胡蘿卜素處理小鼠胰島6小時導(dǎo)致MANF mRNA表達的顯著增加(圖3)。第二組實驗使用來自兩個人類供體的人初級胰島進行。這些數(shù)據(jù)還顯示用毒胡蘿卜素(0.25μΜ)處理人胰島導(dǎo)致MANFmRNA表達的顯著增加(圖4)，并且可溶性MANF蛋白的產(chǎn)生和釋放至細胞外基質(zhì)(圖5和
6)。
[0269]進行實驗以確定是否可溶性MANF保護胰腺β-細胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在第一組實驗中，MANF表達使用靶向MANF mRNA的三種不同siRNA構(gòu)建體之一敲除。根據(jù)制造商的使用手冊使用Lipofectamine 2000 (脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑)進行轉(zhuǎn)染。來自這些實驗的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)細胞用衣霉素(2μΜ)處理24小時時，與用對照siRNA轉(zhuǎn)染并用相同水平的衣霉素處理的對照細胞相比，MANF表達的敲除導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加(如BiP mRNA水平增加所示)(圖7)。這些數(shù)據(jù)表明，可溶性MANF起到防止或降低胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。
[0270]進行另外的實驗以確定是否可溶性MANF會降低或延緩用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激_誘導(dǎo)的化學(xué)試劑處理的胰腺β_細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡。來自這些實驗的數(shù)據(jù)顯示，小鼠胰腺β -細胞系(ΜΙΝ6)用可溶性MANF的處理顯著地減少了在用衣霉素(I μ Μ, 24小時)處理后的細胞中觀察到的胱天蛋白酶-3裂解量(圖8)。這些數(shù)據(jù)表明，可溶性MANF可防止或延緩胰腺β-細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡。
[0271]實施例2.用于監(jiān)測ER中氧化還原狀態(tài)的體系
[0272]開發(fā)了檢測細胞中ER的氧化還原狀態(tài)的新體系。在該體系中，小鼠BiP和哺乳動物ER滯留信號(retrieval signal)的信號序列(KDEL)分別附加至氧化還原敏感的綠色突光蛋白(GFP)的N-和C-末端(圖9A)。重組蛋白稱為MER0S-GFP (哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-定位的氧化還原-敏感的 GFP (Mammalian Endoplasmic Reticulum-Localized RedOx-SensitiveGFP))。熒光顯微鏡用于證實MER0S-GFP定位于ER (圖9B)。MER0S-GFP在NSC34細胞中的完全氧化和還原的物質(zhì)(species)中顯示了不同的激發(fā)光譜,在394nM和473nM處存在極大值(圖10A)。NSC 34細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM中。
[0273]來自兩個不同的激發(fā)波長508nM和510nM的激發(fā)光譜是可比較的(圖1OB和10C)。共焦顯微鏡分析證實，在用強還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理的細胞中，來自476nM的熒光激發(fā)顯著增加，而405nM處的熒光稍微降低(圖11)。
[0274]標(biāo)準(zhǔn)化為野生型未處理細胞的來自激發(fā)473nM對394nM的熒光之比稱為MER0S-GFP比。MER0S-GFP比使用熒光平板讀數(shù)器確定。在這些實驗中，INS-1 832/13細胞以50，000個細胞/孔接種至96-孔板上，細胞在各濃度下用H2O2或DTT處理30分鐘，測量激發(fā)波長473nM和發(fā)射波長510nM(針對還原的MER0S-GFP)處的、或激發(fā)波長394nM和發(fā)射波長510nM(針對氧化的MER0S-GFP)處的熒光。MER0S-GFP比在減去背景信號后確定。數(shù)據(jù)顯示，氧化劑H2O2不改變MER0S-GFP比-表明MER0S-GFP在體內(nèi)幾乎100%被氧化(圖
12)。相反，DTT處理以劑量-依賴方式增加了 MER0S-GFP比(圖12)。
[0275]進行了另外的實驗以證實MER0S-GFP比反應(yīng)了其在體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變。在這些實驗中，MER0S-GFP的氧化還原狀態(tài)使用非還原性SDS-PAGE與硫醇-烷基化試劑、4-乙酰氨基-4’-二苯乙烯馬來酰亞胺-2，2’-二磺酸(AMS)組合來監(jiān)測。在這些實驗中，不處理的或用2mM DTT處理的INS-1832/13細胞用含有25mM AMS的帶有或不帶有2-β-巰基乙醇的1XSDS-PAGE樣品緩沖液溶解，在95°C下煮沸10分鐘，使用SDS-PAGE電泳，并使用抗-GFP抗體免疫印跡。正如所預(yù)期的，來自DTT-處理的細胞的溶解產(chǎn)物的非還原性SDS-PAGE顯示僅一條MER0S-GFP的較緩慢的遷移帶(migrating form)，表明DTT處理完全還原了體內(nèi)的MER0S-GFP (圖13)。
[0276]MER0S-GFP比還在不同時間點在DTT-處理的細胞中監(jiān)控。圖14顯示ER可在DTT處理的幾分鐘內(nèi)還原，并且在DTT洗脫(washout) —分鐘內(nèi)恢復(fù)至氧化環(huán)境。這些結(jié)果表明，MER0S-GFP可用于實時、活體監(jiān)測哺乳動物細胞的ER內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。
[0277]流式細胞術(shù)用于精確監(jiān)測體內(nèi)的MER0S-GFP。這些數(shù)據(jù)顯示，胰腺β -細胞系INS-1 832/13用DTT處理導(dǎo)致來自488ηΜ對405ηΜ處激發(fā)的熒光比劑量依賴性增加(圖15和16)。為了進一步分析該觀測數(shù)據(jù)，在DTT-處理的細胞中檢測中值MER0S-GFP比。數(shù)據(jù)顯示DTT處理以劑量-依賴方式增加了中值MER0S-GFP比(圖17)。然而，H2O2處理不改變MER0S-GFP比(圖18)，表明MER0S-GFP在ER中在基礎(chǔ)水平(basal level)上幾乎完全氧化。中值MER0S-GFP比還由ER應(yīng)激的實驗和生理誘導(dǎo)劑，包括衣霉素、毒胡蘿卜素、布雷菲德菌素A、MG 132(圖19和20)，慢性高葡萄糖(chronic high glucose)(圖21)，血清消耗、葡萄糖剝奪(圖22)，棕櫚酸鹽(酯)、人胰島淀粉樣多肽(hIAPP)和炎性因子(圖23和24)來增加。
[0278]實施例3.ER應(yīng)激細胞中ER氧化還原狀態(tài)的異質(zhì)性
[0279]兩種不同的細胞群體通過流式細胞儀在用棕櫚酸鹽(酯)(胰腺β細胞的強ER誘導(dǎo)劑)處理INS-1 832/13細胞后觀察:一種可保持氧化的ER狀態(tài)，另一種具有高度還原的ER (圖25和26)。為了進一步研究這些異質(zhì)細胞群體，將MER0S-GFP比大于2的細胞歸類為“還原的細胞”。這些兩種不同的細胞群體還觀察下列利用其它已知的胰腺細胞的ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑的處理，包括慢性高葡萄糖(圖27)、血清消耗、葡萄糖剝奪(圖28)和人IAPP (圖29)。在應(yīng)激誘導(dǎo)劑中，棕櫚酸鹽(酯)處理導(dǎo)致具有高度還原的ER的細胞群體中最大的增加。有趣的是，已預(yù)先顯示對棕櫚酸鹽(酯)_誘導(dǎo)的細胞功能障礙的保護的不飽和脂肪酸、油酸和亞油酸，顯著地抑制了棕櫚酸鹽(酯)建立還原ER的能力(圖30)。這些數(shù)據(jù)表明ER應(yīng)激的細胞在其氧化還原狀態(tài)中是異質(zhì)的。
[0280]實施例4.具有誘導(dǎo)的ER的細胞中未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的激活
[0281]進行實驗以研究UPR和氧化還原狀態(tài)的異質(zhì)性之間的關(guān)系。在這些實驗中，氧化還原狀態(tài)與UPR活化水平均在相同細胞中監(jiān)測。為了達到該目標(biāo)，構(gòu)建了由人BiP啟動子驅(qū)動的編碼紅色熒光蛋白的UPR報告基因mCherry。BiP啟動子包含三個未折疊蛋白應(yīng)答元件(UPRE)并已顯示有效反映UPR的活化水平。該BiP-mCherry報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達MER0S-GFP的INS-1 832/13細胞中，并且將FACS分析用于監(jiān)測在相同細胞中的MER0S-GFP比和經(jīng)BiPiCherry的UPR活化水平(圖31)。BiPiCherry的活化水平和MER0S-GFP比在誘導(dǎo)ER應(yīng)激后監(jiān)測。在這些實驗中，表達MER0S-GFP的INS-1 832/13細胞接種至6-孔板中，用各化合物處理規(guī)定的時間，然后通過胰蛋白酶消化收集。在用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌后，將細胞重懸在IlmM葡萄糖-漢克斯緩沖鹽溶液中。流式細胞儀分析利用LSRII(BD)進行。
[0282]數(shù)據(jù)顯示具有還原ER的細胞群體(MER0S-GFP比>2.0)與可保持氧化ER的細胞相比具有較高的BiP-mCherry活化水平，預(yù)示了 UPR在高度還原的ER細胞群體中的活化(圖32 和 33)。
[0283]進行另外的實驗以證實這些數(shù)據(jù)。在這些實驗中，具有氧化ER和高度還原ER的細胞在用棕櫚酸鹽(酯)處理后通過FACS分選(圖34和35)，并使用實時PCR測定UPR標(biāo)記物BiP和剪接的XBP-1的表達。在這些實驗中，還原和氧化的細胞通過FACS分選，總RNA通過RNeasy試劑盒(Qiagen)提取。反轉(zhuǎn)錄酶和定量PCR使用B1Rad iQ5使用SYBR綠色染料進行。
[0284]數(shù)據(jù)顯示BiP和剪接的XBP-1的表達水平與具有氧化的ER的細胞中的水平相比在具有高度還原的ER的細胞中增加(圖36)。這些數(shù)據(jù)進一步通過具有還原的ER和氧化的ER的細胞中的表達譜證實(圖37)。這些實驗使用利用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)處理24小時的FACS-分選的INS-1 832/13細胞進行?？俁NA使用RNAeasy試劑盒(Qiagen)提取。接著將純化的RNA根據(jù)制造商的使用手冊用于GeneChip Rat Gene 1.0 ST Array (Affymetrix)。這些數(shù)據(jù)表明懷有高度還原的ER的細胞還具有高度活化的UPR，可能作為一種調(diào)節(jié)機制。
[0285]實施例5.將ER從還原環(huán)境向氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移的化合物的小分子篩選
[0286]上述數(shù)據(jù)表明，將ER向氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移的化合物和生物制劑可能對于治療ER應(yīng)激和ER功能紊亂相關(guān)的疾病有效。為了調(diào)查這種可能性，兩種FDA-批準(zhǔn)的藥物，吡格列酮(Actos)和牛黃熊脫氧膽酸(TUDCA)，可影響ER氧化還原狀態(tài)并改善ER疾病細胞模型中的細胞死亡。吡格列酮批準(zhǔn)用于治療患有2型糖尿病的患者并已在Wolfram綜合征的小鼠模型中顯示保護胰腺β-細胞功能。吡格列酮顯示在用毒胡蘿卜素處理的胰腺β_細胞中將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移(圖38，右圖)并保護這些細胞免受細胞死亡(圖38，左圖)。另一種小分子，TUDCA，已用于治療膽結(jié)石和膽汁性肝硬化，并顯示減輕糖尿病小鼠模型中的ER應(yīng)激。TUDCA顯示還將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移(圖38，右圖)并保護細胞在ER應(yīng)激條件下免受死亡(圖38，左圖)。
[0287]將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移的試劑可給予對抗ER應(yīng)激的保護的這一發(fā)現(xiàn)，允許開發(fā)新的篩選試驗來使用高通量手段鑒別新的還原ER的小分子抑制劑。進行1280-化合物文庫(MicroSource)的試驗性篩選(pilot screen), I, 040美國藥物和240國際藥物的收集(圖39)。在該實驗中，穩(wěn)定表達MER0S-GFP的INS-1832/13細胞接種(20，000個細胞/孔)在黑光(black optical) 96-孔板中。24小時后，使用TeMo液體處理機器人添加2 μ L各化合物。另外24小時后，細胞用0.2mMDTT強還原劑刺激2小時，然后計算MER0S-GFP比。未處理細胞的平均比為0.037 (S.D.= 0.003)，且DTT-處理的細胞為0.069 (S.D.= 0.006)。陽性化合物為可保持MER0S-GFP比低于0.05的那些。使用該標(biāo)準(zhǔn)，在篩選中鑒別出20種陽性化合物。
[0288]使用0.4mM棕櫚酸鹽(酯)與20mM葡萄糖的組合進行第二個篩選以誘導(dǎo)ER應(yīng)激。在兩次篩選中，鑒別出9種常見的陽性化合物，其中5種由于自體熒光而除去。為了進一步消除假陽性，穩(wěn)定表達MER0S-GFP的INS-1 832/13細胞用剩余的4種常見化合物預(yù)處理，用0.5mM棕櫚酸鹽(酯)刺激24小時，并使用FACS測定MER0S-GFP比。該另外的步驟除去作為假陽性的兩種化合物。剩余的兩種化合物為臨床使用的試劑阿樸嗎啡和灰黃霉素。盡管在篩選試驗中鑒別為陽性，但灰黃霉素對INS-1 832/13細胞具有強毒性作用。
[0289]實施例6.阿樸嗎啡將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移并給與對ER應(yīng)激的保護
[0290]進行另外的實驗以證實阿樸嗎啡可將ER從還原環(huán)境向氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移。在這些實驗中，表達MER0S-GFP的INS-1 832/13細胞用阿樸嗎啡處理24小時，接著用棕櫚酸鹽(酯)刺激24小時。數(shù)據(jù)顯示阿樸嗎啡處理使具有還原ER的細胞群體減少(圖40)。用棕櫚酸鹽(酯)處理的INS-1 832/13細胞中的細胞活力和線粒體膜電位分別使用碘化丙啶(PI)和MitoProbe (Invitrogen)染色測定。阿樸嗎啡使具有較低線粒體膜電位的群體減少(圖41)并抑制ER應(yīng)激-誘導(dǎo)的細胞死亡(圖42)。阿樸嗎啡還保護INS-1 832/13細胞免受由強ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的ER應(yīng)激-介導(dǎo)的細胞死亡(圖43)。共同地，這些數(shù)據(jù)顯示阿樸嗎啡將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移并給與對抗ER應(yīng)激的保護。
[0291]實施例7.將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移的小分子可減輕ER應(yīng)激細胞模型的病理
[0292]上述數(shù)據(jù)顯示阿樸嗎啡和吡格列酮具有將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移的并給予對抗ER應(yīng)激的保護的能力。進行另外的實驗以確定是否阿樸嗎啡和吡格列酮可保護人胰島免受ER應(yīng)激-介導(dǎo)的細胞死亡。數(shù)據(jù)表明阿樸嗎啡和吡格列酮均可保護人胰島免受毒胡蘿卜素-介導(dǎo)的細胞死亡(圖44，左圖)。
[0293]使用INS-1 832/13-來源的多西環(huán)素-可誘導(dǎo)的WFSl敲除細胞，Wolfram綜合征的細胞模型，進行另外的實驗。該模型用于試驗是否阿樸嗎啡和吡格列酮可防止細胞死亡。如前所報道的，shRNA-介導(dǎo)的WFSl敲除導(dǎo)致細胞死亡，其由胱天蛋白酶-3的裂解完成(Riggs等人，Diabetologia 48:2313-2321,2005)。在該模型中，阿樸嗎啡和吡格列酮均抑制了胱天蛋白酶-3的裂解以及胱天蛋白酶-3底物聚(ADP)-核糖基化酶(ribosylatingenzyme) (PARP)的裂解，并能夠保護WFSl-敲除的β -細胞免受細胞死亡(圖44，右圖)。合起來考慮，這些數(shù)據(jù)顯示將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移的小分子可減輕ER疾病的細胞模型的病理。
[0294]實施例8.可溶性MANF保護胰腺β -細胞免受ER應(yīng)激和ER應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡
[0295]進行另外的實驗以確定是否可溶性MANF可在暴露于誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑時防止胰腺β-細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氧化還原環(huán)境中的波動。使用表達MER0S-GFP的轉(zhuǎn)染有慢病毒載體(lentivirus vector)的INS-1 832/13細胞(胰腺β -細胞系)進行實驗。細胞在IlmM或25mM葡萄糖中培養(yǎng)，并未處理或用0.5 μ g/mL可溶性MANF處理。細胞接著使用FACS分析使用460-495nM之間的激發(fā)光譜和520_570nM之間的發(fā)射光譜(FITC-A濾光器)來分析，其中允許來自轉(zhuǎn)染細胞中的還原的EroGFP的熒光發(fā)射的特定檢測。數(shù)據(jù)示出用可溶性MANF的處理導(dǎo)致含有可檢測水平的還原MER0S-GFP的細胞數(shù)量減少(圖45 ;右下圖vs.左下圖)。與上述數(shù)據(jù)一致，這些數(shù)據(jù)顯示胰腺細胞利用可溶性MANF的處理可將ER朝氧化環(huán)境轉(zhuǎn)移，并可用于治療或防止受試者的胰腺β細胞功能紊亂。
[0296]其它實施方案
[0297]應(yīng)理解的是，在本發(fā)明連同其詳細描述一起記載的同時，前述描述意欲說明但不限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。其它方面、優(yōu)勢和修改在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種診斷受試者的胰腺β-細胞紊亂的方法，所述方法包括: 確定可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自所述受試者的生物樣品中的水平；和 將可溶性MANF在所述生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較， 其中與所述參考水平相比可溶性MANF在所述生物樣品中的水平升高表明所述受試者患有胰腺細胞紊亂。
2.一種預(yù)測受試者發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險的方法，所述方法包括: 確定可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自所述受試者的生物樣品中的水平；和 將可溶性MANF在所述生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較， 其中與所述參考水平相比可溶性MANF在所述生物樣品中的水平升高表明所述受試者發(fā)展胰腺β -細胞紊亂的風(fēng)險增加，和與所述參考水平相比可溶性MANF在所述生物樣品中的水平降低或沒有顯著差異表明所述受試者具有發(fā)展胰腺β_細胞紊亂的風(fēng)險正常或降低。
3.—種監(jiān)測受試者的胰腺β_細胞功能或胰腺β_細胞團的方法，所述方法包括: 確定在第一時間點時可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自所述受試者的生物樣品中的水平； 確定在第二時間點時可溶性MANF在來自所述受試者的生物樣品中的水平；和將第二時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平與第一時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平相比較， 其中與第一時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平升高表明所述受試者的胰腺β -細胞功能下降或胰腺β -細胞團減少，和與第一時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平降低或無顯著變化表明所述受試者胰腺β -細胞功能沒有變化或提高，或胰腺β -細胞團沒有變化或增加。
4.一種選擇治療胰腺細胞紊亂的受試者的方法，所述方法包括: 確定可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自所述受試者的生物樣品中的水平；和 將可溶性MANF在所述生物樣品中的水平與可溶性MANF的參考水平相比較， 選擇具有與所述參考水平相比可溶性MANF在所述生物樣品中的水平升高的受試者用于治療胰腺細胞紊亂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述胰腺β-細胞紊亂選自由I型糖尿病、2型糖尿病和Wolfram綜合征組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述參考水平為可溶性MANF的閾值水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述參考水平為可溶性MANF在健康受試者中的水平。
8.一種治療或延緩受試者的胰腺β_細胞紊亂發(fā)病的方法，其包括向所述受試者施用有效量的包括與SEQ ID Ν0:2至少80%同一的序列的可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)或阿樸嗎啡。
9.一種減少胰腺B-細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法，所述方法包括使所述胰腺β-細胞與有效量的包括與SEQ ID Ν0:2至少80%同一的序列的可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)或阿樸嗎啡接觸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述胰腺β-細胞在所述受試者中。
11.一種減少或延緩兩個以上的胰腺β-細胞群體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-誘導(dǎo)的凋亡性細胞死亡的方法，所述方法包括使所述胰腺β -細胞群體與有效量的包括與SEQ ID NO:2至少80%同一的序列的可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)或阿樸嗎啡接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述胰腺細胞群體在所述受試者中。
13.根據(jù)權(quán)利要求1_4、8、10和12任一項所述的方法，其中所述受試者為人類。
14.一種監(jiān)測受試者中胰腺β_細胞紊亂的治療效力的方法，所述方法包括: 確定在第一時間點時可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在來自所述受試者的生物樣品中的水平； 確定在第二時間點時可溶性MANF在來自所述受試者的生物樣品中的水平；和 將第二時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平與第一時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平相比較， 其中(i)所述第一時間點為在治療之前，和所述第二時間點為在治療起始后的任意時間點，或(ii)所述第一時間點在治療起始之后，和所述第二時間點為晚于治療期間或之后的時間點；和 與第一時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平相比第二時間點時可溶性MANF在所述生物樣品中的水平降低表明所述治療在所述受試者中是有效的。
15.一種篩選用于治療或延緩受試者的胰腺β_細胞紊亂發(fā)病的候選化合物的方法，所述方法包括: 提供胰腺β-細胞； 使所述胰腺β-細胞與試驗化合物接觸； 確定在所述試驗化合物的存在下由所述胰腺β-細胞產(chǎn)生的可溶性中腦星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)的水平；和 將在所述試驗化合物的存在下由所述胰腺細胞產(chǎn)生的可溶性(MANF)的水平與可溶性MANF的參考水平相比較， 選擇與所述參考水平相比由所述胰腺細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平升高相關(guān)的化合物作為用于治療或延緩所述受試者的胰腺β-細胞紊亂發(fā)病的候選化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述參考水平為在不存在候選劑下由胰腺β -細胞產(chǎn)生的可溶性MANF的水平。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述參考水平為可溶性MANF的閾值水平。
18.—種篩選用于治療或延緩受試者的胰腺β_細胞紊亂發(fā)病的候選化合物的方法，所述方法包括: 提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞； 使所述細胞與試驗化合物接觸； 確定所述細胞中氧化的報告蛋白的存在量；和 將所述細胞中氧化的報告蛋白的存在量與參考水平相比較； 選擇與所述參考水平相比細胞中氧化的報告蛋白的水平升高相關(guān)的試驗化合物作為用于治療或延緩所述受試者的胰腺β-細胞紊亂發(fā)病的候選化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述參考水平為在不存在候選劑下哺乳動物細胞中氧化的報告蛋白的存在量。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述參考水平為氧化的報告蛋白的閾值水平。
21.—種篩選用于治療或延緩受試者的胰腺β_細胞紊亂發(fā)病的候選化合物的方法，所述方法包括: 提供表達含有BiP信號序列、氧化還原敏感的熒光蛋白和氨基酸序列KDEL的報告蛋白的哺乳動物細胞； 使所述細胞與試驗化合物接觸； 確定所述細胞中還原的報告蛋白的存在量；和 將所述細胞中還原的報告蛋白的存在量與參考水平相比較； 選擇與所述參考水平相比細胞中還原的報告蛋白的水平降低相關(guān)的試驗化合物作為用于治療或延緩受試者的胰腺β-細胞紊亂發(fā)病的候選化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述參考水平為在不存在候選劑下哺乳動物細胞中還原的報告蛋白的存在量。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述參考水平為氧化的報告蛋白的閾值水平。
24.一種試劑盒，其包括: 特異性結(jié)合可溶性MANF的抗體或抗原結(jié)合性抗體片段；和 結(jié)合至選自由胰島素、C-蛋白和胰島淀粉樣多肽組成的組的蛋白質(zhì)的至少一種抗體或抗原結(jié)合性抗體片段。
25.一種藥物組合物，其包括: 包括與SEQ ID NO: 2至少80%同一的序列的可溶性MANF蛋白，或阿樸嗎啡；和 至少一種用于治療胰腺細胞紊亂的附加劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述至少一種附加劑為胰島素。
【文檔編號】G01N33/68GK104204811SQ201380016366
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月24日
【發(fā)明者】浦野文彥, 金藏孝介 申請人:馬薩諸塞大學(xué)