人肺炎鏈球菌抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及特定的單克隆抗體及其片段，其發(fā)現(xiàn)用于檢測(cè)、預(yù)防和治療肺炎鏈球菌感染。尤其是，這些抗體可以殺滅肺炎鏈球菌或限制肺炎鏈球菌的復(fù)制。還公開了產(chǎn)生此類單克隆抗體的改進(jìn)的方法。
【專利說明】人肺炎鏈球菌抗體及其用途
[0001] 發(fā)明背景 本發(fā)明用政府支持在基金號(hào) P20RR015577、P20RR015577-10S1、P30RR031152、 P30AR053483 和 U19AI062629 和合同號(hào) HHSN266200500026C (N01-AI500026)下，由 National Institutes of Health資助完成。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
[0002] 本申請(qǐng)要求享有于2012年2月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/593,654的優(yōu) 先權(quán)，其完整內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 包含于文件中名為"0MRFP0108US_ST25"的序列表(其為?91. 8 KB并且在2013 年1月8日產(chǎn)生）與本文一同通過電子申請(qǐng)?zhí)峤唬⑼ㄟ^引用并入本文。
[0004] 1.【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明總體涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，其涉及用于肺炎鏈球菌 感染的診斷、預(yù)防和治療的人單克隆抗體的開發(fā)。
[0005] 2.發(fā)明背景 肺炎鏈球菌(Stre/?iococcws )是引起一系列臨床感染諸如中耳炎、 肺炎、腦膜炎和菌血癥的普遍存在的人病原體。更嚴(yán)重的表現(xiàn)尤其在無免疫應(yīng)答的 (immunocompromised)和老年個(gè)體中是致命的。超過90種不同的肺炎鏈球菌血清型已被表 征，每一種具有不同的莢膜多糖結(jié)構(gòu)。這些多糖在成人中是免疫原性的，并且Pne Um〇Vax?23 疫苗由23種最常見的和/或強(qiáng)毒的肺炎鏈球菌菌株的混合物組成。該疫苗推薦用于超過 60歲的每個(gè)人以及所有無免疫應(yīng)答個(gè)體，以確保針對(duì)這些菌株的血清保護(hù)。
[0006] 已深度研究了對(duì)Pneumovax?23以及綴合疫苗Prevnar? (用于免疫兒童）應(yīng)答的 血清學(xué)關(guān)于在血清和唾液中的體液多克隆IgG和IgA應(yīng)答（Anttila等，1999; Nieminen 等，1998a; Nieminen等，1998b)。記憶細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞（ASC)對(duì)這些疫苗的應(yīng)答之 前也已在細(xì)胞水平上用B細(xì)胞ELISpot測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行研究Nieminen等，1998b ; Clutterbuck等，2006)，并且接種后兩種應(yīng)答的存在現(xiàn)在完全確定。然而，利用ASC來產(chǎn) 生人單克隆抗體將提供完全闡釋接種后對(duì)病原體血清型的回憶應(yīng)答的新的方法，并甚至提 供了勘察過去應(yīng)答的進(jìn)化的窗口。
[0007] 與兩種或多種肺炎球菌多肽交叉反應(yīng)的抗體在免疫前和免疫后存在于血清中 (Lee等，1984; Soininen等，2000);然而，仍不知曉這是否由于能夠交叉反應(yīng)的單 一抗體特異性或是由于廣泛的多克隆抗體特異性。盡管已報(bào)道在患有SLE的患者中用 Pneumovax?23免疫不誘導(dǎo)新的自身特異性（Elkayam等，2005)，但一個(gè)報(bào)道已顯示在患有 SLE的患者中腎結(jié)合抗體還與肺炎球菌多糖交叉反應(yīng)（Chowdhry等，2005)。因此，可能從 SLE供體的B細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體可以顯示增加的多反應(yīng)性（poly-reactivity)或自反應(yīng)性 (auto-reactivity)。僅僅可以通過從SLE供體的人單克隆抗體的表征來確定此類經(jīng)抗體 (per-antibody)的現(xiàn)象。
[0008] 發(fā)明概述 因此，根據(jù)本發(fā)明，提供包含多種抗體的人單克隆抗體組（panel)，其中所述組中的抗 體結(jié)合至少15種肺炎鏈球菌的血清型。所述組中的抗體可以結(jié)合至少18種肺炎鏈球菌血 清型或21種肺炎鏈球菌血清型。至少15種抗體可以是血清型特異性的，至少17種抗體可 以是血清型特異性的，或者19種抗體可以是血清型特異性的?？贵w組可以附著在支持物 上，諸如珠、浸漬片（dipstick)、濾器、膜、板或芯片。血清型可以選自1、2、3、4、5、6B、8、9N、 叭、118、14、158、17?、18(：、194、19?、20、22?、23?、33?和01?5。抗體組可以包含與兩種血清 型反應(yīng)的抗體。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供評(píng)估主體中肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括從所述 主體中獲得第一含抗體的樣品，并評(píng)估所述樣品中的抗體與包含多種抗體的人單克隆抗體 組的結(jié)合，其中所述組中的抗體結(jié)合至少15種肺炎鏈球菌的血清型。所述組中的抗體可以 結(jié)合至少18種肺炎鏈球菌血清型或21種肺炎鏈球菌血清型。至少15種抗體可以是血清型 特異性的，至少17種抗體可以是血清型特異性的，或者19種抗體可以是血清型特異性的。 抗體組可以附著在支持物上，諸如珠、浸漬片（dipstick)、濾器、膜、板或芯片。血清型可以 選自1、2、3、4、5、68、8、9隊(duì)叭、1比、14、158、17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩和(：耶5?？?體組可以包含與兩種血清型反應(yīng)的抗體。
[0010] 主體可以是無免疫應(yīng)答的和/或60歲齡或更老的。主體可以是懷疑具有肺炎鏈 球菌。方法可以進(jìn)一步包括用抗肺炎鏈球菌療法治療所述主體，如果發(fā)現(xiàn)所述第一含抗 體的樣品對(duì)一種或多種血清型是陽性的。方法可以進(jìn)一步包括用萬古霉素或左氧氟沙星 (Ievoflaxin)治療所述主體,如果發(fā)現(xiàn)所述第一含抗體的樣品對(duì)血清型19A和/或19F是 陽性的。所述第一含抗體的樣品可以是血液、血清、血楽、痰（sputum)或唾液（saliva)。 toon] 方法可以進(jìn)一步包括從所述主體中獲得第二含抗體的樣品，并評(píng)估所述第二樣品 中的抗體與包含多種抗體的人單克隆抗體組的結(jié)合，其中所述組中的抗體結(jié)合至少15種 肺炎鏈球菌的血清型。所述第二含抗體的樣品可以是血液、血清、血楽、痰（sputum)或唾液 (saliva)。主體可以在確定所述第一含抗體樣品對(duì)于一種或多種血清型是陽性后已用抗肺 炎鏈球菌療法治療，并且對(duì)來自所述第一樣品的血清型的抗體效價(jià)的降低表明所述抗肺炎 鏈球菌療法對(duì)治療肺炎鏈球菌是有效的。主體可以在確定所述第一含抗體樣品對(duì)于一種或 多種血清型是陽性后已用抗生素治療，并且對(duì)來自所述第一樣品的血清型的抗體效價(jià)未降 低表明所述抗肺炎鏈球菌療法對(duì)治療肺炎鏈球菌是無效的，并且任選所述方法可以進(jìn)一步 包括用不同的抗肺炎鏈球菌療法治療所述主體。
[0012] 在仍另一個(gè)實(shí)施方案中，提供選擇性結(jié)合肺炎鏈球菌的抗體，其中所述抗體具有 選自表2中所述的那些的重鏈和輕鏈CDR?？贵w可以是單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、嵌合抗體、 Fab片段或IgG?？贵w可以進(jìn)一步包含與其連接的抗生素，諸如經(jīng)光不穩(wěn)定的接頭或經(jīng)酶促 切割的接頭連接至所述抗體的抗生素?？贵w可以綴合至納米顆粒或脂質(zhì)體。
[0013] 在還仍另一個(gè)實(shí)施方案中，提供治療主體中肺炎鏈球菌感染的方法，其包括如上 所述向所述主體施用抗體。方法可以進(jìn)一步包括向所述主體施用第二抗肺炎鏈球菌治療， 其可以在所述抗體的同時(shí)給予或在所述抗體之前和/或之后給予?？贵w可以是單鏈抗體、 單結(jié)構(gòu)域抗體、嵌合抗體、Fab片段或IgG。
[0014] 抗體可以進(jìn)一步包含與其連接的抗生素，諸如經(jīng)光不穩(wěn)定的接頭或經(jīng)酶促切割的 接頭連接至所述抗體的抗生素?？贵w可以綴合至脂質(zhì)體或納米顆粒。施用多抗肺炎鏈球菌 抗體，諸如結(jié)合 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 種肺炎鏈球菌血清型 的多抗肺炎鏈球菌抗體。
[0015] 考慮本文描述的任何方法或組合物可以就本文描述的任何其他方法或組合物來 實(shí)現(xiàn)。
[0016] 在權(quán)利要求和/或說明書中當(dāng)與術(shù)語"包含（comprising)"結(jié)合使用時(shí)，詞語"一 個(gè)（a)"或"一個(gè)（an)"的用法可以表示"一個(gè)（one)"，但它也與"一個(gè)或多個(gè)"、"至少一個(gè)" 和"一個(gè)或多于一個(gè)"的意思一致。詞語"約"表示所述數(shù)字的正負(fù)5%。
[0017] 本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳述中變得顯而易見。然而，應(yīng)該理解， 詳述和具體實(shí)施例盡管說明了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但僅是通過舉例說明的方式給出， 因?yàn)閺脑撛斒鲋斜景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種改變和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變 得顯而易見。
[0018] 附圖簡(jiǎn)述 以下附圖構(gòu)成本說明書的部分并且包括在內(nèi)以進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明 可以通過參考這些附圖中的一幅或多幅并組合本文呈現(xiàn)的具體實(shí)施方案的詳述而被更好 理解。
[0019] 圖1A-B. Pneumovax?23引起大量ASC爆發(fā)，其可以用作高親和力抗多糖抗體的來 源。（圖1A)在用Pneumovax?23接種后7天從四個(gè)供體中收獲PBMC。將它們?nèi)旧?duì)作 為CD3和CD20陰性和CD19中間體的細(xì)胞進(jìn)行分選。呈現(xiàn)的點(diǎn)圖表明在所有四個(gè)供體中的 大ASC爆發(fā)（⑶27高、⑶38高；循環(huán)門控)。將來自這四個(gè)供體(命名為Coni、Con2、SLEl和 SLE2)的ASC的百分比平均，外周血中16. 3%的總B細(xì)胞是ASC。（圖1B)將A中所示的ASC 分選至96孔板。進(jìn)行RT-PCR和幾輪嵌套PCR來制備V區(qū)用于克隆。然后將DNA克隆入表 達(dá)載體，擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)染入HEK293人細(xì)胞系。
[0020] 圖2A-C.平均上，用Pneumovax?23接種后產(chǎn)生的77%的抗體結(jié)合疫苗組分。（圖 2A)通過ELISA，平均77%(Conl，62% ;Con2，90%;SLEl，75%;SLE2，75%)的表達(dá)的 抗體結(jié)合肺炎鏈球菌莢膜或細(xì)胞壁多糖。（圖2B)盡管顯著百分比的抗體是交叉反應(yīng)性的 (12%)，但產(chǎn)生的大部分抗體對(duì)單一血清型是特異性的。（圖2052%的來自SLE2的抗體 是多反應(yīng)性的，結(jié)合以下五種抗原的至少兩種：R〇、La、Sm、nRNP或心磷脂。
[0021] 圖3A-D.個(gè)體可以產(chǎn)生對(duì)同一血清型的多種抗體，其中的一些是特異性的，并且 其他是交叉反應(yīng)性的。（圖3A)血清型9N和9V具有非常相似的結(jié)構(gòu)，但勿似僅結(jié)合 9N，且卻7僅結(jié)合9V。（圖3B)相反，游似結(jié)合9N和9V。如由親和力（affinity) 和抗體親抗原性（avidity)測(cè)量所示，對(duì)9N的結(jié)合強(qiáng)于對(duì)9V的結(jié)合。（圖 結(jié)合9N，但與14而非9V交叉反應(yīng)。其對(duì)9N和14的親和力和抗體親抗原性相似。（圖3D) 這%^結(jié)合19A和19F，其也具有相似結(jié)構(gòu)。對(duì)19A和19F的親和力相似，然而，對(duì)19A 的抗體親抗原性比對(duì)19F的強(qiáng)4倍。親和力ELISA通過用抗體的連續(xù)稀釋包被具有單一純 化的多糖的板來進(jìn)行。親和力（Kd's)以摩爾濃度表示?？贵w親抗原性離液序列高的ELISA 以相同方式進(jìn)行，但加入使用硫氰酸銨的多種稀釋的15分鐘洗脫步驟。抗體親抗原性圖作 為保留的百分比結(jié)合（OD 4tl5具有SCN/0D4(i5 XSCN * 100)相比于硫氰酸鹽濃度的log來呈 現(xiàn)?？贵w親抗原性等于引起結(jié)合50%降低(或保留）的硫氰酸銨的濃度。
[0022] 圖4A-C. B細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)血清型15B和14,以及17F和33F的交叉反應(yīng)性的抗體。（圖 4A)兩種抗體兄沒/?況浙和兄萬辦光似分別單獨(dú)結(jié)合17F和33F。（圖4B)然而， 結(jié)合兩種血清型。對(duì)33F的親和力比對(duì)17F的親和力要好一個(gè)數(shù)量級(jí)，然而，它們的抗體親 抗原性是相似的。（圖4C)5Z￡^7及?7結(jié)合15B和14兩者。盡管親和力幾乎比對(duì)15B的高 一個(gè)數(shù)量級(jí)，但它常常顯示對(duì)14的高兩倍的抗體親抗原性。
[0023] 圖5從用Pneum〇Vax?23接種產(chǎn)生的ASC產(chǎn)生高度突變的抗體。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)是來 自每一供體的每條序列的體細(xì)胞突變(核苷酸）的平均頻率(在方法中為/?值)。平均上，抗 多糖ASC已積累了與季節(jié)性流感接種后抗流感ASC的相似數(shù)目的突變 14。GC =生發(fā)中心 群。
[0024] 圖6A-B.由Pneumovax?23誘導(dǎo)的ASC特異性通過由疫苗引起的供體的記憶應(yīng)答 來確定。（圖6A)來自四個(gè)供體的'記憶指紋（anamnestic fingerprint)'。之前均未接受 Pneumovax?23,因此由于之前暴露于肺炎鏈球菌而從記憶中產(chǎn)生克隆的ASC '回憶'抗體。 每一供體具有獨(dú)特的血清型(針對(duì)其他們已產(chǎn)生抗體）的"指紋"。（圖6B)在排除克隆庫成 員并組合所有四幅圖后，供體具有非常不同的'肺炎球菌指紋'，其中僅三種血清型（9V、15B 和17F)表示來自三個(gè)供體，且僅兩種來自所有四個(gè)供體（8和33F)。
[0025] 圖7A-B.顯示來自每一供體的交叉反應(yīng)性和多反應(yīng)性的抗體。在此再現(xiàn)還顯示抗 體(其以紅色為交叉反應(yīng)性的（圖7A)和以橙色為多反應(yīng)性的（圖7B))的來自圖2A的ELISA 曲線。來自SLE2的四種交叉反應(yīng)性抗體的三種也是多反應(yīng)性的(但均不來自其他供體)。
[0026] 示例性實(shí)施方案描述 為了探究通過Pneumovax?23疫苗產(chǎn)生的抗體應(yīng)答，本發(fā)明人從SLE患者和健康對(duì)照 產(chǎn)生并表征了大量針對(duì)存在于疫苗中的肺炎鏈球菌血清型的高親和力人單克隆抗體。盡 管在過去已制備了針對(duì)肺炎鏈球菌的人單克隆抗體（Baxendale和Goldblatt, 2006; Baxendale等，2000; Zhou等，2002; Zhou等，2004)，但這些研究還受以下兩個(gè)因素限 制：一，它們利用Fab表達(dá)文庫篩選并且二，它們利用雜交瘤的隨機(jī)產(chǎn)生。此外，之前研究要 么集中于一種血清型（6B和23F)要么利用用綴合疫苗Prevnar (其僅由七種莢膜血清型組 成)接種。相反，本發(fā)明人的技術(shù)提供了及時(shí)的(接種后7天)在一個(gè)特定點(diǎn)上抗多糖應(yīng)答的 代表性表征；因此，用于克隆抗體的每一細(xì)胞已從針對(duì)于該特定接種的記憶應(yīng)答產(chǎn)生。該系 統(tǒng)將告知在多糖免疫應(yīng)答和自身免疫領(lǐng)域中大量仍未解答的問題。具體而言，本文數(shù)據(jù)具 體解決不同血清型間交叉反應(yīng)的人單克隆多糖抗體的百分比，個(gè)體的ASC對(duì)Pneumovax?23 的應(yīng)答如何是由于對(duì)肺炎鏈球菌的前期暴露，并且該應(yīng)答在患有SLE的供體中如何不同。 結(jié)果是，目前存在可用的廣泛范圍的針對(duì)肺炎鏈球菌的完全人單克隆抗體，其可以應(yīng)用于 診斷學(xué)、治療診斷學(xué)和治療學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明的這些和其他方面在下文詳細(xì)描述。
[0027] W.肺炎鏈球菌 A.概述 肺炎鏈球菌或肺炎球菌是屬鏈球菌屬（Streptococcus)的革蘭氏陽性、α溶血的、膽 汁可溶的耐氧性厭氧成員。重要的人病原性細(xì)菌肺炎鏈球菌被認(rèn)為是19世紀(jì)后期肺炎的 主要原因，并且是許多體液免疫研究中的主題。
[0028] 肺炎鏈球菌與草綠色鏈球菌(SirepiococciAs ririt/a/75·)有所區(qū)別，其一些也是α 溶血的，使用奧普托欣試驗(yàn)，如同肺炎鏈球菌是奧普托欣敏感的。肺炎鏈球菌還可以基于其 對(duì)膽汁溶菌的敏感性而區(qū)別。該有莢膜的、革蘭氏陽性球形細(xì)菌在革蘭氏染色上具有特征 性形態(tài)學(xué)，所謂的"柳葉刀形的（lancet-shaped) "雙球菌。它們具有多糖莢膜，其充當(dāng)生物 的毒力因子；多于90種不同的血清型是已知的，并且這些類型在毒力、流行性和藥物抗性 程度上不同。
[0029] 肺炎鏈球菌的基因組是閉合的、環(huán)形DNA結(jié)構(gòu)，根據(jù)菌株不同，其含有2. 0-2. 1 百萬個(gè)堿基對(duì)。它具有1553個(gè)基因的核心組，加在其毒力組（virulome)中的154個(gè)基因 (其負(fù)責(zé)毒力）和維持非侵襲性表型的176個(gè)基因。遺傳信息在菌株間可以變化高至10%。
[0030] 肺炎鏈球菌是正常的上呼吸道菌群的部分，但是，如同許多天然菌群，它在合適條 件下可以變?yōu)橹虏⌒缘?例如，如果宿主的免疫系統(tǒng)受到抑制)。侵染素諸如肺炎鏈球菌溶 血素、抗吞噬的莢膜、多種黏附素和免疫原性的細(xì)胞壁組分是所有主要的毒力因子。
[0031] 社區(qū)獲得性肺炎（Community-acquired pneumonia, CAP)變得越來越普遍，并且 代表世界范圍內(nèi)死亡率和發(fā)病率的重要成因。盡管大量不同的病原體可以產(chǎn)生CAP，但肺炎 鏈球菌是最普遍之一。
[0032] CAP常常經(jīng)吸入或抽吸肺致病性生物進(jìn)入肺區(qū)或肺葉中而獲得。更不常見的，CAP 產(chǎn)生于來自遠(yuǎn)源的繼發(fā)菌血癥。
[0033] 嚴(yán)重CAP通常在患有心肺疾病、受損的脾功能、和/或致病性毒力的患者中發(fā)生， 但甚至年輕和/或健康宿主也可以發(fā)生嚴(yán)重CAP，如果成因的病原體足夠有毒力。CAP中的 并發(fā)癥依賴于感染性病原體和患者健康。由于社區(qū)獲得性肺炎（CAP)的發(fā)熱可能促成心肌 梗塞。而且，具有受損的脾功能的患有CAP的患者可以發(fā)生無法抗拒的肺炎球菌敗血病，可 能在12-24小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致死亡，而與所用的抗微生物療法無關(guān)。
[0034] CAP發(fā)病率和死亡率在老年患者中和在無免疫應(yīng)答的宿主中是最高的。預(yù)測(cè)患有 CAP患者中升高的死亡率風(fēng)險(xiǎn)的其他因素包括顯著并存病的存在、升高的呼吸速率、低血 壓、發(fā)熱、牽連多葉（multilobar involvement)、貧血和缺氧。
[0035] B.相關(guān)疾病狀態(tài) 無關(guān)名稱，肺炎鏈球菌導(dǎo)致除肺炎外的許多類型的肺炎球菌感染，包括急性鼻竇炎、中 耳炎、腦膜炎、菌血癥、敗血病、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窩組織 炎和腦膿腫。
[0036] C.多藥物抗性 肺炎鏈球菌療法中日益增長(zhǎng)的關(guān)注是菌株許多對(duì)青霉素及其他對(duì)β內(nèi)酰胺(如阿莫 西林)的抗性，其在全世界范圍內(nèi)增加?？剐缘闹饕獧C(jī)制涉及編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因中 引入突變。該發(fā)展使得治療極大地復(fù)雜化，并且當(dāng)療法失敗時(shí)還增加了不必要的花費(fèi)。
[0037] 在 2〇00 年，Whitney 等檢查了在 Centers for Disease Control and Prevention 的活性細(xì)菌核心監(jiān)視（Active Bacterial Core Surveillance)計(jì)劃中從1995年至1998 年鑒定的患者中侵襲性肺炎球菌疾病的數(shù)據(jù)。在1998年間，報(bào)道了 4013例侵襲性肺炎鏈 球菌疾病，并且3475例可獲得隔離群（87%)?？傮w上，來自1998年的24%的隔離群對(duì)青 霉素是抗性的。青霉素抗性隔離群比易感性隔離群更可能具有高水平的對(duì)其他抗微生物劑 的抗性。包括在7價(jià)綴合物和23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗中的血清型分別占了青霉素抗性菌 株的78%和88%。在1995年至1998年之間，對(duì)三類或更多類藥物有抗性的隔離群的比例 從9%增加至14%;在對(duì)青霉素(從21%至25%)、頭孢噻肟(從10%至14%)、美羅培南(從 10%至16%)、紅霉素(從11%至15%)、和甲氧芐啶磺胺甲噁唑(從25%至29%)有抗性的 隔離群的比例中也存在增加。這些趨勢(shì)可能持續(xù)，給予臨床醫(yī)生更大的壓力以求諸藥物諸 如萬古霉素和左氧氟沙星（Ievoflaxin)。
[0038] D.診斷 肺炎鏈球菌可以基于α溶血測(cè)試而與其他鏈球菌感染區(qū)分開。草綠色鏈球菌(其 中一些也是α溶血的）可以使用奧普托欣測(cè)試來區(qū)別，因?yàn)榉窝祖溓蚓菉W普托欣敏感 的，而草綠色鏈球菌不是。肺炎鏈球菌還可以基于其對(duì)膽汁溶菌的敏感性而區(qū)別。該有 莢膜的、革蘭氏陽性球形細(xì)菌在革蘭氏染色上具有特征性形態(tài)學(xué)，所謂的"柳葉刀形的 (lancet-shaped) "雙球菌。它們具有多肽莢膜，其充當(dāng)生物的毒力因子；多于90種不同的 血清型是已知的，并且這些類型在毒力、流行性和藥物抗性程度上不同。
[0039] 在區(qū)別血清型方面，目前可獲得對(duì)血清型1、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、18C、 19F 和 23F 的抗體（ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT)。
[0040] E.治療 抗生素是對(duì)肺炎鏈球菌感染的治療選擇，并且通風(fēng)(氧補(bǔ)充）作為細(xì)菌性肺炎的支持療 法。抗生素選擇依賴于在地理區(qū)域中最常引起肺炎的微生物，以及具體生物的性質(zhì)，個(gè)體的 免疫狀態(tài)和根本健康，感染的嚴(yán)重程度以及之前的治療史。在英國(guó)，將阿莫西林用作絕大部 分在社區(qū)中獲得肺炎的患者的一線療法，有時(shí)并加入克拉霉素。在北美，在那社區(qū)獲得性肺 炎的"非典型性"形式變得越來越普遍，克拉霉素、阿奇霉素或氟喹諾酮類作為單一療法已 經(jīng)取代了阿莫西林作為一線療法。在開始藥物治療時(shí)，應(yīng)該總是考慮抗生素抗性的本地模 式。在住院個(gè)體或具有免疫缺陷的那些個(gè)體中，本地指導(dǎo)方針決定抗生素的選擇。這些抗生 素通常經(jīng)靜脈內(nèi)路線給予。具體而言，用阿莫西林(或在對(duì)青霉素過敏的患者中為紅霉素） 治療肺炎鏈球菌，并且在嚴(yán)重情況下用頭孢呋辛和紅霉素。
[0041] III.產(chǎn)生單克隆抗體 Α.總體方法 應(yīng)理解結(jié)合肺炎鏈球菌的單克隆抗體將用于幾種應(yīng)用中。這些包括產(chǎn)生用于檢測(cè)和診 斷疾病的診斷試劑盒。在這些背景下，技術(shù)人員可以將此類抗體與診斷劑或治療劑連接，或 者使用它們作為競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中的俘獲劑或競(jìng)爭(zhēng)物。用于制備并表征抗體的方法是本領(lǐng)域中 熟知的（參見例如Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;美國(guó)專利 4, 196, 265)。
[0042] 用于產(chǎn)生單克隆抗體（Mb)的方法通常與用于制備多克隆抗體的方法沿相同路 線開始。這兩種方法的第一步是免疫合適宿主或鑒定由于之前天然感染而被免疫的主體。 如本領(lǐng)域中熟知的，用于免疫的給定組合物可以在其免疫原性上不同。因此，加強(qiáng)宿主免 疫系統(tǒng)通常是必要的，如同可以通過將肽或多肽免疫原與載體偶聯(lián)來實(shí)現(xiàn)。示例性且優(yōu)選 的載體是匙孔槭血藍(lán)蛋白（KLH)和牛血清白蛋白（BSA)。其他白蛋白諸如卵清蛋白、小鼠 血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作載體。用于綴合多肽與載體蛋白的方法是本領(lǐng)域 中熟知的，并且包括戊二醛、間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯（m-malei midobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亞胺（carbodiimyde)和雙重氮聯(lián)苯胺 (bis-biazotized benzidine)。本領(lǐng)域中還熟知的是，特定免疫原組合物的免疫原性可以 通過使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物(稱為佐劑)來增強(qiáng)。示例性且優(yōu)選的佐劑包括完全弗 氏佐劑(含有殺滅的結(jié)核分枝桿菌(MercWo 1Si1S)的免疫應(yīng)答非特異性刺 激物)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。
[0043] 用于制備多克隆抗體的免疫原組合物的量根據(jù)免疫原的性質(zhì)以及用于免疫的動(dòng) 物而不同。多種途徑可用于施用免疫原(皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)）。多克隆抗體 產(chǎn)生可以通過在免疫后多個(gè)點(diǎn)取樣經(jīng)免疫的動(dòng)物的血液來監(jiān)測(cè)。還可以給予第二次加強(qiáng)注 射。重復(fù)加強(qiáng)和滴定過程直到達(dá)到合適的效價(jià)。當(dāng)獲得期望水平的免疫原性時(shí)，可以將免 疫的動(dòng)物放血并分離血清并儲(chǔ)存，和/或?qū)?dòng)物用于產(chǎn)生MAb。
[0044] 在人單克隆抗體的情況下，技術(shù)人員可以改為簡(jiǎn)單尋找已經(jīng)知道已產(chǎn)生免疫應(yīng)答 的個(gè)體，在這種情況下，為已暴露于肺炎鏈球菌或用Pneumovax?23免疫。為了鑒定具有對(duì) 多種肺炎鏈球菌菌株的免疫性的主體，技術(shù)人員通常能夠從主體獲得血液并測(cè)試它們的肺 炎鏈球菌抗體。本發(fā)明中描述的許多抗體以這種方式使用來自其他健康個(gè)體(之前感染過 肺炎鏈球菌）的外周血來產(chǎn)生。
[0045] 免疫或從如上所述的之前感染過的主體中獲得細(xì)胞后，具有產(chǎn)生抗體潛力的體細(xì) 胞(具體為B淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞))選擇用于MAb產(chǎn)生方案。這些細(xì)胞可以從活檢的脾或淋巴 結(jié)或從循環(huán)血中獲得。來自免疫的動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞隨后與無限增殖的骨髓瘤 細(xì)胞(通常為與已免疫的動(dòng)物相同的物種或人或人/小鼠嵌合細(xì)胞之一)的細(xì)胞融合。適合 用于產(chǎn)生雜交瘤融合程序的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選為非抗體產(chǎn)生性的，具有高融合效率，和酶 缺乏，所述酶缺乏進(jìn)而使得無法在某些僅支持期望的融合細(xì)胞(雜交瘤）生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)。
[0046] 可以使用大量骨髓瘤細(xì)胞的任何一種，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的（Goding,第 65-66頁，1986; Campbell,第75-83頁，1984)。例如，其中免疫的動(dòng)物是小鼠時(shí)， 技術(shù)人員可以使用 P3_X63/Ag8、X63-Ag8. 653、NS1/1. Ag 4 1、Sp210-Agl4、F0、NS0/U、 MPC-11、MPC11-X45-GTG I. 7 和 S194/5XX0 Bul ;對(duì)于大鼠，技術(shù)人員可以使用 R210. RCY3、 Y3-Ag L 2. 3、IR983F 和 4B210 ;并且 U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC729-6 均 可用于與人細(xì)胞融合相關(guān)中。一種具體的鼠骨髓瘤細(xì)胞是NS-I骨髓瘤細(xì)胞系（也稱為 P3-NS-l-Ag4-l)，其通過要求細(xì)胞系儲(chǔ)存號(hào)GM3573可容易地獲自NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository?？梢允褂玫牧硪环N小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是8-氮鳥噪呤抗性的小 鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生產(chǎn)者細(xì)胞系。更近期，已描述了用于與人B細(xì)胞的另外的融合伴侶 系，包括 KR12 (ATCC CRL-8658; K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668)和 HMMA2. 5 (Posner等，1987)。本發(fā)明中的抗體使用HMMA2. 5系產(chǎn)生。
[0047] 用于生成產(chǎn)生抗體的脾或淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜交物的方法通常包括將 體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以2:1的比例混合，盡管在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種或多種試劑(化學(xué) 的或電的）存在的情況下，該比例可以分別從約20:1至約1:1變化。使用仙臺(tái)病毒的融合 方法已由Kohler和Milstein (1975; 1976)描述，以及使用聚乙二醇（PEG)的方法，諸如 37% (v/v) PEG,由Gefter等（1977)描述。電誘導(dǎo)的融合方法的使用也是合適的（Goding, 第71-74頁，1986)。本發(fā)明中分泌流感抗體的雜交瘤可以通過電融合獲得。
[0048] 融合程序通常以低頻率(約I X KT6至I X KT8)產(chǎn)生活的雜交物。然而，這 不會(huì)產(chǎn)生問題，因?yàn)橥ㄟ^在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，活的、融合的雜交物與親代、未融合的 (infused)細(xì)胞(特別是未融合的骨髓瘤細(xì)胞，其將通常持續(xù)不確定地分裂）被區(qū)分。選擇 性培養(yǎng)基通常是含有阻斷組織培養(yǎng)基中核苷酸的重新合成的試劑的培養(yǎng)基。示例性且優(yōu)選 的試劑是氨基蝶呤、甲氨蝶呤、和偶氮絲氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的重新 合成，而偶氮絲氨酸僅阻斷嘌呤的合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤時(shí)，培養(yǎng)基補(bǔ)充有次黃 嘌呤和胸苷作為核苷酸的來源（HAT培養(yǎng)基)。在使用偶氮絲氨酸時(shí)，培養(yǎng)基補(bǔ)充有次黃嘌 呤。如果B細(xì)胞來源是轉(zhuǎn)化EB病毒（EBV)的人B細(xì)胞系，則加入哇巴因，以排除未與骨髓 瘤融合的EBV轉(zhuǎn)化的系。
[0049] 優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能夠運(yùn)行核苷酸補(bǔ)救途徑的 細(xì)胞才能夠在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細(xì)胞缺乏補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，例如次黃嘌呤磷酸 核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT)，并且它們無法存活。B細(xì)胞可以運(yùn)行該途徑，但它們?cè)谂囵B(yǎng)中具有有 限的生存期，并且通常在約兩周內(nèi)死亡。因此，只有能夠在選擇性培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞是那 些從骨髓瘤和B細(xì)胞形成的雜交物。當(dāng)用于融合的B細(xì)胞來源是EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系時(shí)，同 樣，也使用哇巴因用于雜交物的藥物選擇，因?yàn)镋BV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞對(duì)于藥物殺死是易感的， 而所用的骨髓瘤伴侶被選為哇巴因抗性的。
[0050] 培養(yǎng)提供了雜交瘤的群，從中選擇特定的雜交瘤。通常，通過培養(yǎng)細(xì)胞由在微量滴 定板中單克隆稀釋，隨后測(cè)試單獨(dú)的克隆上清液(在約2至3周后）的期望的反應(yīng)性來完成 雜交瘤的選擇。測(cè)定應(yīng)該是靈敏、簡(jiǎn)單且快速的，諸如放射性免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定、細(xì)胞毒 性測(cè)定、噬菌斑測(cè)定、點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定等。
[0051] 然后將所選的雜交瘤連續(xù)稀釋或通過流式細(xì)胞術(shù)分選進(jìn)行單細(xì)胞分選，并克隆入 單獨(dú)的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，該克隆可以隨后不確定地繁殖以提供mAb?？梢砸詢煞N基本方式 開發(fā)細(xì)胞系的MAb產(chǎn)生?？梢詫㈦s交瘤樣品注射(通常注射入腹膜腔）入動(dòng)物(例如小鼠)。 任選地，注射前用烴引發(fā)動(dòng)物，尤其是油諸如姥鮫烷（四甲基十五烷)。當(dāng)以這種方式使用人 雜交瘤時(shí)，優(yōu)選注射無免疫應(yīng)答的小鼠，諸如SCID小鼠，以防止腫瘤排斥。注射的動(dòng)物發(fā)生 由融合的細(xì)胞雜交物產(chǎn)生的分泌特異性單克隆抗體的腫瘤。動(dòng)物的體液諸如血清或腹水液 可隨后放出以提供高濃度的MAb。單獨(dú)的細(xì)胞系還能夠體外培養(yǎng)，其中Mb天然分泌入培養(yǎng) 基中，從中可以容易地將它們以高濃度獲得。或者，可以體外使用人雜交瘤細(xì)胞系來在細(xì)胞 上清液中產(chǎn)生免疫球蛋白。細(xì)胞系可以適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以優(yōu)化回收高純度的 人單克隆免疫球蛋白的能力。
[0052] 如需要，由任一種方法產(chǎn)生的Mb可以進(jìn)一步純化，其使用過濾、離心和多種層析 方法諸如FPLC或親和層析。本發(fā)明的單克隆抗體的片段可以獲自純化的單克隆抗體，其 通過包括用酶諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化在內(nèi)的方法，和/或通過化學(xué)還原裂解二硫 鍵?；蛘?，本發(fā)明包括的單克隆抗體片段可以使用自動(dòng)肽合成儀來合成。
[0053] 還考慮的是可以使用分子克隆方法來產(chǎn)生單克隆抗體。為此，可以從雜交瘤系分 離RNA并通過RT-PCR獲得抗體基因并克隆入免疫球蛋白表達(dá)載體?；蛘?，從分離自細(xì)胞系 的RNA制備組合的免疫球蛋白噬菌粒文庫，并通過使用病毒抗原淘選來選擇表達(dá)合適抗體 的噬菌粒。該方法相對(duì)于常規(guī)雜交瘤技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是多至大約IO 4倍的抗體可以在單一輪次 中產(chǎn)生并篩選，并且通過H鏈和L鏈組合產(chǎn)生新的特異性，其進(jìn)一步增加了發(fā)現(xiàn)合適抗體的 機(jī)會(huì)。
[0054] 教導(dǎo)了用于本發(fā)明中的抗體產(chǎn)生的其他美國(guó)專利(其每一個(gè)通過引用并入本文） 包括美國(guó)專利5, 565, 332,其描述了使用組合方法產(chǎn)生嵌合抗體；美國(guó)專利4, 816, 567,其 描述了重組免疫球蛋白制備；和美國(guó)專利4, 867, 973,其描述了抗體治療劑綴合物。
[0055] B.本發(fā)明的抗體 在第一種情況下，本發(fā)明的抗體可以通過其結(jié)合特異性來確定。通過使用本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的技術(shù)來評(píng)估給定抗體的結(jié)合親和力，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定此類抗體是否落 入本權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0056] 在本發(fā)明的上下文中，抗體特異性涉及肺炎鏈球菌血清型。存在由Pneumovax?23 代表的24種不同血清型，由以下命名所代表：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、 14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F和CWPS。代表性抗體的CDR區(qū)序列包括在所附 的序列表中。
[0057] 另一個(gè)分類本發(fā)明的抗體的方法是通過它們的活性。這可以包括在存在或不存在 補(bǔ)體的情況下，中和或殺滅肺炎鏈球菌的能力。最后，抗體可以具體參考重/輕鏈可變區(qū)序 列來確定。本發(fā)明人提供了以下抗體，其在調(diào)理吞噬測(cè)定（OPA)中已顯示出針對(duì)肺炎鏈球 菌的活性，所述測(cè)定測(cè)量抗體介導(dǎo)的通過吞噬細(xì)胞系的細(xì)菌攝入。這也可以通過如表2中 所述的可變區(qū)來呈現(xiàn)。
[0058] C.抗體序列的工程化 在多個(gè)實(shí)施方案中，技術(shù)人員可以由于多種原因選擇來工程化鑒定的抗體的序列，諸 如改進(jìn)表達(dá)、改進(jìn)交叉反應(yīng)性或消除脫靶（off-target)結(jié)合。以下內(nèi)容是用于抗體工程化 的相關(guān)技術(shù)的一般討論。
[0059] 可以培養(yǎng)雜交瘤，然后裂解細(xì)胞，并提取總RNA?？梢允褂秒S機(jī)六聚物用RT來產(chǎn)生 RNA的cDNA拷貝，并隨后使用預(yù)期擴(kuò)增全部人可變基因序列的PCR引物的多重混合物來進(jìn) 行PCR?？梢詫CR產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy?載體，然后通過自動(dòng)DNA測(cè)序使用標(biāo)準(zhǔn)載體 引物來測(cè)序。結(jié)合和中和測(cè)定可以使用從雜交瘤上清液收集并通過FPLC使用蛋白G柱純 化的抗體來進(jìn)行。
[0060] 重組全長(zhǎng)IgG抗體可以通過將來自克隆載體的重鏈和輕鏈Fv DNA亞克隆入第二 載體中，諸如Lonza pConlgGl或pConK2質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染入293自由式（Freestyle)細(xì)胞或 Lonza CHO細(xì)胞來產(chǎn)生，并且抗體可以隨后從細(xì)胞上清液中收集并純化。
[0061] pCon Vectors?是再表達(dá)完整抗體的簡(jiǎn)單方法。恒定區(qū)載體是一組提供一定范圍 的克隆入PEE載體中的免疫球蛋白恒定區(qū)載體的載體。這些載體提供具有人恒定區(qū)的全長(zhǎng) 抗體的簡(jiǎn)單構(gòu)建和GS System?的便利。
[0062] 抗體分子將包含片段（諸如F(ab'）、F(ab'）2)，其例如通過mAb或例如可經(jīng)重 組方法產(chǎn)生的單鏈免疫球蛋白的蛋白水解切割來產(chǎn)生。此類抗體衍生物是單價(jià)的。在一 個(gè)實(shí)施方案中，此類片段可以彼此組合，或與其他抗體片段或受體配體組合，以形成"嵌合" 結(jié)合分子。值得注意的是，此類嵌合分子可以含有能夠結(jié)合相同分子的不同表位的取代基 (substituent)〇
[0063] 在相關(guān)的實(shí)施方案中，抗體是公開的抗體的衍生物，例如包含與公開的抗體中的 CDR序列相同的CDR序列的抗體(例如，嵌合或CDR移植抗體)。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 抗體是完全人重組抗體?；蛘撸夹g(shù)人員可以期望進(jìn)行更多輕微改變，諸如向抗體分子引入 保守改變。在進(jìn)行這種改變中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予對(duì)蛋 白的相互作用的生物學(xué)功能上的重要性是本領(lǐng)域通常理解的（Kyte和Doolittle, 1982)。 接受的是氨基酸的相關(guān)親水特征促成產(chǎn)生的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其進(jìn)而確定蛋白與其他分子 (例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等）的相互作用。
[0064] 在本領(lǐng)域還理解的是基于親水性可以有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代。美國(guó)專利 4, 554, 101 (其通過引用并入本文）陳述了蛋白的最高局部平均親水性（由其相鄰的氨基 酸的親水性所控制）與蛋白的生物學(xué)特性相關(guān)。如美國(guó)專利4, 554, 101中詳述，以下親水 性值已分配于氨基酸殘基：堿性氨基酸：精氨酸（+3. 0)、賴氨酸（+3. 0)和組氨酸（-0. 5); 酸性氨基酸：天冬氨酸（+3.0 ± 1)、谷氨酸（+3.0 ± 1)、天冬酰胺（+0.2)和谷氨酰胺 (+0. 2);親水性、非離子氨基酸：絲氨酸（+0. 3)、天冬酰胺（+0. 2)、谷氨酰胺（+0. 2)和蘇氨 酸（-0. 4)，含硫的氨基酸：半胱氨酸（-1. 0)和甲硫氨酸（-1. 3);疏水性、非芳香族氨基酸： 纈氨酸（-1. 5)、亮氨酸（-1. 8)、異亮氨酸（-1. 8)、脯氨酸（-0. 5 ± 1)、丙氨酸（-0. 5)和甘 氨酸（〇);疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸（-3. 4)、苯丙氨酸（-2. 5)和酪氨酸（-2. 3)。
[0065] 理解的是氨基酸可以取代為另一個(gè)具有相似親水性的氨基酸，并且產(chǎn)生生物學(xué)上 或免疫學(xué)上修飾的蛋白。在這種改變中，優(yōu)選其親水性值在± 2以內(nèi)的氨基酸的取代，在 ± 1以內(nèi)的那些是尤其優(yōu)選的，并且在± 0.5以內(nèi)的那些是甚至更尤其優(yōu)選的。
[0066] 如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如其疏水性、 親水性、電荷、大小等?？紤]多種前述特征的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包 括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和纈氨 酸、亮氨酸和異亮氨酸。
[0067] 本發(fā)明還考慮同種型修飾。通過修飾Fc區(qū)以具有不同的同種型，可以實(shí)現(xiàn)不同的 功能性。例如，對(duì)IgG 1的改變可以增加抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)換至A類可以改進(jìn)組 織分布，并且轉(zhuǎn)換至M類可以改進(jìn)效價(jià)。
[0068] 修飾抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，包括通過標(biāo)準(zhǔn)分子生 物學(xué)技術(shù)來表達(dá)，或多肽的化學(xué)合成。用于重組表達(dá)的方法在本文件中其他處提及。
[0069] D.單鏈抗體 單鏈可變片段（scFv)是免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的融合體，用短(通常為絲 氨酸、甘氨酸）接頭連接在一起。該嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特異性，盡管去除了恒 定區(qū)并引入了接頭肽。該修飾通常使特異性未改變。這些分子歷史上產(chǎn)生以促進(jìn)噬菌體展 示，其中極大地方便于表達(dá)作為單一肽的抗原結(jié)合域。或者，scFv可以直接從來源于雜交 瘤的亞克隆的重鏈和輕鏈產(chǎn)生。單鏈可變分子缺少在完整抗體分子中發(fā)現(xiàn)的恒定Fc區(qū)，并 因此缺少用于純化抗體的常用結(jié)合位點(diǎn)（例如，蛋白A/G)。這些片段常?？梢允褂玫鞍譒 來純化/固定，因?yàn)榈鞍譒與κ輕鏈的可變區(qū)相互作用。
[0070] 柔性接頭通常由促螺旋和促轉(zhuǎn)角（helix- and turn-promoting)氨基酸殘基諸如 丙氨酸、絲氨酸和甘氨酸構(gòu)成。然而，其他殘基也可以起作用。Tang等（1996)使用噬菌體 展示作為快速選擇來自蛋白接頭文庫的單鏈抗體（scFvs)的定制接頭的方法。構(gòu)建隨機(jī)接 頭文庫，其中重鏈和輕鏈可變域的基因通過編碼可變組成的18個(gè)氨基酸多肽的區(qū)段來連 接。scFv所有組成成分(約5 X IO6個(gè)不同成員）在絲狀噬菌體上展示并進(jìn)行用半抗原的 親和力選擇。選擇的變體的群展示出結(jié)合活性中的顯著增加，但保留了相當(dāng)大的序列多樣 性。篩選1054個(gè)單獨(dú)的變體隨后產(chǎn)生了以可溶形式有效產(chǎn)生的催化活性的scFv。序列分 析揭示了接頭中在V h C末端后兩個(gè)殘基的保守脯氨酸和在其他位置處精氨酸和脯氨酸的 豐富，其作為所選范圍的唯一共同特征。
[0071] 本發(fā)明的重組抗體還可能涉及允許受體二聚化或多聚化的序列或部分。此類序列 包括來源于IgA的那些，其允許綴合有J鏈的多聚物的形成。另一個(gè)多聚化結(jié)構(gòu)域是Gal4 二聚化結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方案中，鏈可以用試劑諸如生物素/抗生物素蛋白來修飾，其允 許兩種抗體的組合。
[0072] 在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案中，單鏈抗體可以通過使用非肽接頭或化學(xué)單元將受體輕 鏈和重鏈結(jié)合來產(chǎn)生。通常，輕鏈和重鏈將在不同細(xì)胞中產(chǎn)生，純化并隨后以合適方式連接 在一起（即，重鏈的N末端經(jīng)合適的化學(xué)橋鍵（chemical bridge)連接至輕鏈的C末端)。 [0073] 使用交聯(lián)劑來形成將兩個(gè)不同分子的官能團(tuán)連在一起形成分子橋鍵，例如穩(wěn)定劑 和混凝劑。然而，應(yīng)考慮可以產(chǎn)生相同類似物的二聚體或多聚體或者不同類似物構(gòu)成的 異聚化復(fù)合體（heteromeric complex)。為了以分步（step-wise)方式連接兩種不同的 化合物，可以使用消除不想要的均聚物形成的異-雙功能交聯(lián)劑（hetero-bifunctional cross-linker)〇
[0074] 示例性異-雙功能交聯(lián)劑包含兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)：一個(gè)與伯胺基反應(yīng)（S卩N-羥基琥珀 酰亞胺）并且另一個(gè)與巰基反應(yīng)(例如吡啶基二硫化物、馬來酰亞胺、鹵素等)。經(jīng)伯胺反應(yīng) 基團(tuán)，交聯(lián)劑可以與一個(gè)蛋白（例如選擇的抗體或片段）的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基反應(yīng)并且 經(jīng)過巰基反應(yīng)基團(tuán)，已連接至第一蛋白的交聯(lián)劑可以與另一個(gè)蛋白（例如選擇劑）的半胱氨 酸殘基(游離巰基）反應(yīng)。
[0075] 優(yōu)選將使用在血液中具有合理的穩(wěn)定性的交聯(lián)劑。許多類型的含二硫鍵的接頭是 已知的，其可以成功用于綴合靶向劑和治療/預(yù)防劑。含有為空間位阻的二硫鍵的接頭可 以證實(shí)提供更大的體內(nèi)穩(wěn)定性，防止靶向肽在達(dá)到作用位點(diǎn)之前釋放。這些接頭因此是一 組連接劑。
[0076] 另一種交聯(lián)劑是SMPT，其是含有二硫鍵的雙功能交聯(lián)劑，所述二硫鍵通過鄰近的 苯環(huán)和甲基而是"空間位阻的"。認(rèn)為二硫鍵的空間位阻起到保護(hù)鍵免于硫醇鹽陰離子(諸 如谷胱甘肽，其可能存在于組織和血液中）的攻擊的作用，并由此幫助防止在遞送連接的試 劑到目標(biāo)位點(diǎn)前綴合物的解偶聯(lián)。
[0077] SMPT交聯(lián)劑，如同許多其他已知的交聯(lián)劑一樣，帶來交聯(lián)官能團(tuán)諸如半胱氨酸的 SH或伯胺(例如，賴氨酸的ε氨基）的能力。另一種可能類型的交聯(lián)劑包括異-雙功能光 反應(yīng)性苯基疊氮化物，其含有可裂解的二硫鍵，諸如磺基琥珀酰亞胺基-2-(對(duì)-疊氮水楊 ?；被┮一?1，3' -二硫代丙酸鹽/酯。N-羥基-琥珀酰亞胺基與伯氨基反應(yīng)并且苯 基疊氮化物(光裂解后）非選擇性地與任何氨基酸殘基反應(yīng)。
[0078] 除了位阻的交聯(lián)劑外，無位阻的接頭也可以一同使用。其他有用的交聯(lián)劑(不考 慮含有或生成受保護(hù)的二硫化物）包括SATA，SPDP和2-亞氨基硫烷（iminothiolane) (Wawrzynczak和Thorpe, 1987)。使用此類交聯(lián)劑是本領(lǐng)域熟知的。另一個(gè)實(shí)施方案涉及 使用柔性接頭。
[0079] 美國(guó)專利4, 680, 338描述了用于產(chǎn)生配體與含胺的聚合物和/或蛋白的綴合物， 尤其是用于與螯合劑、藥物、酶、可檢測(cè)標(biāo)記等形成抗體綴合物的雙功能接頭。美國(guó)專利 5, 141，648和5, 563, 250公開了含有在許多溫和條件下可裂解的不穩(wěn)定鍵的可裂解的綴合 物。該接頭尤其可用于目標(biāo)試劑可以與接頭直接成鍵并且裂解導(dǎo)致釋放活性試劑的情況 中。具體用途包括向蛋白（諸如抗體）或藥物添加游離氨基或游離巰基。
[0080] 美國(guó)專利5, 856, 456提供了用于連接多肽組分以形成融合蛋白例如單鏈抗體的 肽接頭。該接頭長(zhǎng)度多至約50個(gè)氨基酸，含有至少出現(xiàn)一次的帶電荷的氨基酸(優(yōu)選精 氨酸或賴氨酸）隨后為脯氨酸，并且其特征在于更大的穩(wěn)定性和降低的聚集。美國(guó)專利 5, 880, 270公開了含氨基氧基的接頭，其用于多種免疫診斷和分離技術(shù)。
[0081] 在具體的實(shí)施方案中，抗體是重組抗體，其適合于在細(xì)胞內(nèi)部作用一此類抗體稱 為"細(xì)胞內(nèi)抗體（intrabodies)"。這些抗體可能由于多種機(jī)制(諸如通過改變胞內(nèi)蛋白運(yùn) 輸）而干擾目標(biāo)功能，干擾酶功能，并阻斷蛋白-蛋白或蛋白-DNA相互作用。以許多方式， 它們的結(jié)構(gòu)模擬上文討論的那些單鏈和單結(jié)構(gòu)域抗體或與其相似。的確，單轉(zhuǎn)錄物/單鏈 是允許在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)表達(dá)的重要特征，并還使得蛋白運(yùn)輸過細(xì)胞膜更可行。然而，需要 另外的特征。
[0082] 影響細(xì)胞內(nèi)抗體治療劑的實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)主要問題是遞送，包括細(xì)胞/組織靶向，和 穩(wěn)定性。關(guān)于遞送，已可以使用多種方法，諸如組織定向遞送，使用細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子， 基于病毒的遞送和使用細(xì)胞穿透性/膜易位肽。關(guān)于穩(wěn)定性，方法通常為通過蠻力（brute force)來篩選(包括涉及噬菌體展示并可以包括序列成熟或共有序列發(fā)展的方法)，或者為 更加定向的修飾諸如插入穩(wěn)定序列(例如，F(xiàn)c區(qū)、分子伴侶蛋白序列、亮氨酸拉鏈)和二硫化 物置換/修飾。
[0083] 細(xì)胞內(nèi)抗體可能需要的另一個(gè)特征是細(xì)胞內(nèi)靶向的信號(hào)?？梢詫⒓?xì)胞內(nèi)抗體(或 其他蛋白)靶向亞細(xì)胞區(qū)域諸如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和ER的載體已被設(shè)計(jì)并且是可商購 的（Invitrogen Corp. ; Persic 等，1997) 〇
[0084] 由于它們進(jìn)入細(xì)胞的能力，細(xì)胞內(nèi)抗體具有其他類型抗體無法實(shí)現(xiàn)的額外用途。 在本發(fā)明抗體的情況下，在活細(xì)胞中與MUC1胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用的能力可以干擾與MUC1 CD相關(guān)的功能，諸如信號(hào)傳遞功能(結(jié)合至其他分子）或寡聚體形成。尤其是，考慮此類抗 體可以用于抑制MUCl二聚體形成。
[0085] E.純化 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以純化。如本文所用術(shù)語"純化的"意指組合物， 其可從其他組分中分離，其中將所述蛋白純化至相對(duì)于其天然可獲狀態(tài)的任何程度。因此， 純化的蛋白還指這樣的蛋白，其從它可能天然存在的環(huán)境中分離出來。當(dāng)使用術(shù)語"基本上 純化的"時(shí)，該用法將指這樣的組合物，其中蛋白或肽形成了所述組合物的主要組分，諸如 構(gòu)成所述組合物中約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更多的蛋白。
[0086] 蛋白純化技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。這些技術(shù)在一個(gè)水平上涉及細(xì)胞環(huán) 境至多肽和非多肽級(jí)分的粗分級(jí)。已將多肽從其他蛋白中分離后，目標(biāo)多肽可以使用層析 和電泳技術(shù)進(jìn)一步純化以實(shí)現(xiàn)部分或完全的純化(或純化至同質(zhì)性)。尤其適合于制備純肽 的分析方法是離子交換層析、排阻層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳；等電聚焦。蛋白純化的其他 方法包括用硫酸銨、PEG、抗體等沉淀或通過熱變性，隨后離心；凝膠過濾、反向、羥基磷灰石 和親和層析；和這些及其他技術(shù)的組合。
[0087] 在純化本發(fā)明的抗體中，可以期望在原核生物或真核生物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)多肽， 并使用變性條件提取蛋白。多肽可以使用親和柱(其結(jié)合多肽的標(biāo)簽化部分)從其他細(xì)胞組 分中純化。如本領(lǐng)域中通常熟知的，認(rèn)為可以改變進(jìn)行多個(gè)純化步驟的次序，或者可以去除 某些步驟，并仍產(chǎn)生用于制備基本上純化的蛋白或肽的合適方法。
[0088] 通常，完全抗體是分級(jí)的利用試劑（即，蛋白A)，其結(jié)合抗體的Fc部分?；蛘?，抗原 可以同時(shí)用于純化并選擇合適抗體。此類方法通常利用結(jié)合至支持物(諸如柱、濾器或珠） 上的選擇劑。將抗體結(jié)合至支持物上，去除污染物(例如洗掉)，并通過施用條件(鹽、熱等） 將抗體釋放。
[0089] 定量蛋白或肽純化的程度的多種方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員在本公開的教導(dǎo)下將 是已知的。這些包括例如確定活性級(jí)分的比活，或者通過SDS/PAGE分析評(píng)估級(jí)分內(nèi)多肽的 量。用于評(píng)估級(jí)分的純度另一個(gè)方法是計(jì)算所述級(jí)分的比活，將其與起始提取物的比活比 較，并因而計(jì)算純化程度。用于代表活性的量的實(shí)際單位將當(dāng)然依賴于所選的進(jìn)行純化的 具體測(cè)定技術(shù)和表達(dá)的蛋白或肽是否展示出可檢測(cè)的活性。
[0090] 已知用不同的SDS/PAGE條件，多肽的遷移可以改變，有時(shí)顯著地改變（Capaldi 等，1977)。因此，應(yīng)理解在不同的電泳條件下，純化的或部分純化的表達(dá)產(chǎn)物的表觀分子 量可以改變。
[0091] IV.肺炎鏈球菌感染的被動(dòng)免疫和治療 A.制劑和施用 抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移，稱為人工獲得性被動(dòng)免疫，通常涉及使用靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射。此類免 疫通常持續(xù)僅短時(shí)間周期，但提供了立即保護(hù)?？贵w將在適合于注射的載體諸如無菌的且 可注射的（syringeable)載體中配制。因此，本發(fā)明提供包含抗肺炎鏈球菌抗體和用于產(chǎn)生 所述抗體的抗原的藥物組合物。此類組合物包含預(yù)防上或治療上有效量的抗體或其片段， 以及藥學(xué)上可接受的載體。在具體的實(shí)施方案中，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"意指通過聯(lián)邦或 州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或列于美國(guó)藥典或其他通常認(rèn)可的用于動(dòng)物且更具體為人中的藥 典里。術(shù)語"載體"指稀釋劑、賦形劑、或媒介物，用其可施用治療劑。此類藥學(xué)上載體可以 是無菌液體，諸如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦 物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是具體的載體。鹽水溶液和含水葡萄糖和 甘油溶液也可以用作液體載體，尤其是可注射的溶液。其他合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡 萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯 化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇（propylene, glycol)、水、乙醇等。
[0092] 如需要，組合物還可以含有少量的濕潤(rùn)劑或乳化劑、或pH緩沖劑。這些組合物 可以采用溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等形式。口服制劑可以 包括標(biāo)準(zhǔn)載體諸如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合 適的藥物試劑的實(shí)例描述于"Remington's Pharmaceutical Sciences"。此類組合物將 含有預(yù)防上或治療上有效量的抗體或其片段，優(yōu)選以純化的形式，連同合適量的載體，以 向患者提供合適施用的形式。制劑應(yīng)適合施用模式，其可以是口服、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、頰內(nèi) (intrabuccal)、鼻內(nèi)、噴霧、支氣管吸入，或通過機(jī)械通氣遞送。
[0093] 通常，本發(fā)明的組合物的成分單獨(dú)地或以單位劑量形式(例如，在氣密密封容器內(nèi) 諸如表明活性劑的量的安瓿或小袋（sachette)內(nèi)作為干燥的冷凍干燥粉末或無水濃縮物） 混合在一起來提供。當(dāng)組合物通過輸注施用時(shí)，它可以用含無菌藥用級(jí)水或鹽水的輸注瓶 來配制。當(dāng)組合物通過注射施用時(shí)，可以提供一安瓿的用于注射的無菌水或鹽水，從而使成 分在施用前可以混合。
[0094] 本發(fā)明的組合物可以配制為中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與陰離子諸 如來源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的鹽，和與陽離子諸如來源于鈉、鉀、 銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些形成的鹽。 [0095] B.組合療法 為了增加本發(fā)明的抗體療法的有效性，可以期望將該治療與其他在治療或預(yù)防肺炎鏈 球菌感染上有效的藥劑例如抗生素組合。該方法可以涉及向患者同時(shí)施用本發(fā)明的抗體和 一種或多種其他藥劑。這可以通過使用單一的藥物組合物來實(shí)現(xiàn)，所述藥物組合物包括兩 種藥劑，或通過同時(shí)施用兩種不同組合物來實(shí)現(xiàn)，其中一種組合物包括本發(fā)明的抗體并且 另一種包括一種或多種第二藥劑。
[0096] 兩種療法可以以任何次序給予，并且可以以范圍在數(shù)分鐘至數(shù)周的時(shí)間間隔在另 一種治療之前或之后。在其中其他藥劑分開應(yīng)用的實(shí)施方案中，技術(shù)人員應(yīng)通常保證在每 次遞送時(shí)刻之間重要的時(shí)間周期沒有失效，從而使藥劑仍能夠?qū)嵤?duì)患者的有利地組合效 果。在這種情況下，考慮可以在彼此的約12-24 h內(nèi)并且更優(yōu)選在彼此的約6-12 h內(nèi)施用 兩種藥物手段（modality)。在某些情況下，可以期望明顯延長(zhǎng)治療時(shí)間周期，然而，其中在 各次施用之間過去了若干天（2、3、4、5、6或7)至若干周（1、2、3、4、5、6、7或8)。
[0097] 可以使用多種組合，本發(fā)明的抗體治療是"A"，并且第二治療為"B"：
【權(quán)利要求】
1. 包含多種抗體的人單克隆抗體組，其中所述組中的抗體結(jié)合至少15種肺炎鏈球菌 (Ytre/?乙OCOCCW51 白勺血i青型。
2. 權(quán)利要求1的抗體組，其中所述組中的抗體結(jié)合至少18種肺炎鏈球菌血清型。
3. 權(quán)利要求2的抗體組，其中所述組中的抗體結(jié)合21種肺炎鏈球菌血清型。
4. 權(quán)利要求3的抗體組，其中至少15種抗體是血清型特異性的。
5. 權(quán)利要求4的抗體組，其中至少17種抗體是血清型特異性的。
6. 權(quán)利要求5的抗體組，其中19種抗體是血清型特異性的。
7. 權(quán)利要求1的抗體組，其中所述抗體組連接至支持物。
8. 權(quán)利要求7的抗體組，其中所述支持物是珠、浸漬片、濾器、膜、板、或芯片。
9. 權(quán)利要求1的抗體組，其中所述血清型選自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、 17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩和(：耶5。
10. 權(quán)利要求1的抗體組，其中至少一種抗體與兩種血清型反應(yīng)。
11. 評(píng)估主體中的肺炎鏈球菌的方法，其包括從所述主體中獲得第一含抗體的樣品，并 評(píng)估所述樣品中的抗體與包含多種抗體的人單克隆抗體組的結(jié)合，其中所述組中的抗體結(jié) 合至少15種肺炎鏈球菌的血清型。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述組中的抗體結(jié)合至少18種肺炎鏈球菌血清型。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述組中的抗體結(jié)合21種肺炎鏈球菌血清型。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中至少15種抗體是血清型特異性的。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中至少17種抗體是血清型特異性的。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中19種抗體是血清型特異性的。
17. 權(quán)利要求11的方法，其中所述抗體組連接至支持物。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述支持物是珠、浸漬片、濾器、膜、板、或芯片。
19. 權(quán)利要求11的方法，其中所述血清型選自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、 17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩和(：耶5。
20. 權(quán)利要求11的方法，其中至少一種抗體與兩種血清型反應(yīng)。
21. 權(quán)利要求11的方法，其中所述主體是無免疫應(yīng)答的和/或60歲齡或更老。
22. 權(quán)利要求11的方法，其中所述主體懷疑具有肺炎鏈球菌。
23. 權(quán)利要求11的方法，其進(jìn)一步包括如果發(fā)現(xiàn)所述第一含抗體的樣品對(duì)一種或多種 血清型是陽性的，則用抗肺炎鏈球菌療法治療所述主體。
24. 權(quán)利要求11的方法，其進(jìn)一步包括如果發(fā)現(xiàn)所述第一含抗體的樣品對(duì)血清型19A 和/或19F是陽性的，則用萬古霉素或左氧氟沙星治療所述主體。
25. 權(quán)利要求11的方法，其中所述第一含抗體的樣品是血液、血清、血漿、痰或唾液。
26. 權(quán)利要求11的方法，其進(jìn)一步包括從所述主體中獲得第二含抗體的樣品，并評(píng)估 所述第二樣品中的抗體與包含多種抗體的人單克隆抗體組的結(jié)合，其中所述組中的抗體結(jié) 合至少15種肺炎鏈球菌的血清型。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述第二含抗體的樣品是血液、血清、血漿、痰或唾液。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中在確定所述第一含抗體的樣品對(duì)于一種或多種血清型是 陽性后用抗肺炎鏈球菌療法治療所述主體，并且對(duì)來自所述第一樣品的血清型的抗體效價(jià) 的降低表明所述抗肺炎鏈球菌療法對(duì)治療肺炎鏈球菌是有效的。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中在確定所述第一含抗體的樣品對(duì)于一種或多種血清型是 陽性后用抗生素治療所述主體，并且對(duì)來自所述第一樣品的血清型的抗體效價(jià)中不存在降 低表明所述抗肺炎鏈球菌療法對(duì)治療肺炎鏈球菌是無效的。
30. 權(quán)利要求29的方法，其進(jìn)一步包括用不同的抗肺炎鏈球菌療法治療所述主體。
31. 抗體，其選擇性結(jié)合肺炎鏈球菌，其中所述抗體具有如表2中所述的重鏈和輕鏈 CDR。
32. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體為單鏈抗體。
33. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體為單結(jié)構(gòu)域抗體。
34. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體。
35. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體為Fab片段。
36. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體為IgG。
37. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含與其連接的抗生素。
38. 權(quán)利要求37的抗體，其中所述抗生素經(jīng)光不穩(wěn)定的接頭連接至所述抗體。
39. 權(quán)利要求37的抗體，其中所述抗生素經(jīng)酶促切割的接頭連接至所述抗體。
40. 權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體綴合至納米顆?；蛑|(zhì)體。
41. 治療主體中的肺炎鏈球菌感染的方法，其包括向所述主體施用權(quán)利要求31的抗 體。
42. 權(quán)利要求41的方法，其進(jìn)一步包括向所述主體施用第二抗肺炎鏈球菌治療。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述第二抗肺炎鏈球菌治療與所述抗體同時(shí)給予。
44. 權(quán)利要求42的方法，其中所述第二抗肺炎鏈球菌治療在所述抗體之前和/或之后 給予。
45. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體為單鏈抗體。
46. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體為單結(jié)構(gòu)域抗體。
47. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體為嵌合抗體。
48. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體為Fab片段。
49. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體為IgG。
50. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包含與其連接的抗生素。
51. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗生素經(jīng)光不穩(wěn)定的接頭連接至所述抗體。
52. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗生素經(jīng)酶促切割的接頭連接至所述抗體。
53. 權(quán)利要求41的方法，其中所述抗體綴合至脂質(zhì)體或納米顆粒。
54. 權(quán)利要求41的方法，施用多抗肺炎鏈球菌抗體。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中所述多抗肺炎鏈球菌抗體結(jié)合2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95或100種肺炎鏈球菌血清型。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104364650SQ201380017988
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】K.史密斯 申請(qǐng)人:俄克拉荷馬醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)