利用光分析的單個粒子檢測裝置、單個粒子檢測方法以及單個粒子檢測用計算機(jī)程序的制作方法
【專利摘要】提供一種能夠在基于利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測量逐個檢測單個粒子的掃描分子計數(shù)法的單個粒子檢測技術(shù)中，在非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子混合存在的樣本溶液中分別識別并檢測非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子的存在的技術(shù)。關(guān)于本發(fā)明的檢測樣本溶液中的單個粒子的技術(shù)，一邊使顯微鏡的光檢測區(qū)域的位置在包含非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子的樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光，生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，將時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中相對于背景光強(qiáng)度的光強(qiáng)度的增大檢測為表示發(fā)光粒子的存在的信號，將相對于背景光強(qiáng)度的光強(qiáng)度的下降檢測為表示非發(fā)光粒子的存在的信號。
【專利說明】利用光分析的單個粒子檢測裝置、單個粒子檢測方法以及單個粒子檢測用計算機(jī)程序
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種單個粒子檢測技術(shù)，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對象物、或非生物學(xué)粒子，來獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時有用的信息，更詳細(xì)地說，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)測量依賴于單個粒子的存在的光強(qiáng)度的變化來檢測單個粒子并進(jìn)行各種分析的單個粒子檢測裝置、單個粒子檢測方法以及單個粒子檢測用計算機(jī)程序。
【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來的光測量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù)，能夠檢測/測量單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光測量技術(shù)對生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測的光分析計數(shù)。作為這樣的光分析技術(shù)，例如已知有突光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlat1n Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn)1_3、非專利文獻(xiàn)1-3)、突光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribut1nAnalysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn)4、非專利文獻(xiàn)4)、光子計數(shù)直方圖(Photon CountingHistogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)等。另外,在專利文獻(xiàn)6?8中提出了一種根據(jù)使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測量出的樣本溶液的熒光信號的時間經(jīng)過來檢測熒光性物質(zhì)的方法。
[0003]并且，本申請的 申請人:在專利文獻(xiàn)9?11中提出了一種利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的、基于與FCS、FIDA等光分析技術(shù)不同的原理的新的光分析技術(shù)。在上述的FCS、FIDA等光分析技術(shù)的情況下，如果清楚地進(jìn)行描述則是，針對通過連續(xù)地測量來自浮游于作為樣本溶液內(nèi)的光的檢測區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測區(qū)域”。)的熒光分子的光而得到的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)執(zhí)行統(tǒng)計性的運算處理，從而檢測熒光分子的濃度和/或其它特性。與此相對，在專利文獻(xiàn)9?11所提出的新的光分析技術(shù)中，一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊在光檢測區(qū)域包含在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的發(fā)出光的粒子(發(fā)光粒子)時逐個檢測從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐一地進(jìn)行檢測來進(jìn)行發(fā)光粒子的計數(shù)、獲取與樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。根據(jù)該光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計數(shù)法”)，與FCS、FIDA等光分析技術(shù)同樣地，進(jìn)行測量所需要的樣本可以是微量的(例如幾十UL左右)，另外，測量時間短(在一次測量中反復(fù)進(jìn)行多次秒級時間的測量。)，并且能夠在作為觀測對象的粒子的濃度低于FCS、FIDA等光分析技術(shù)能夠良好地進(jìn)行測量的水平(InM左右)的樣本溶液中檢測發(fā)光粒子的存在，并定量地檢測其濃度、數(shù)密度或其它特性。因而，期待“掃描分子計數(shù)法”在對醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等檢測體數(shù)多的情況下，成為與以前的生物化學(xué)方法相比能夠廉價或迅速地執(zhí)行實驗或檢查且能夠檢測無法良好地執(zhí)行FCS、FIDA等的程度的更低濃度的粒子的濃度和/或特性的強(qiáng)力工具。
[0004]專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876
[0005]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371
[0006]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-281831
[0007]專利文獻(xiàn)4:日本特許第4023523號
[0008]專利文獻(xiàn)5:國際公開2008-080417
[0009]專利文獻(xiàn)6:日本特開2007-20565
[0010]專利文獻(xiàn)7:日本特開2008-116440
[0011]專利文獻(xiàn)8:日本特開平4-337446號公報
[0012]專利文獻(xiàn)9:國際公開第2011/108369
[0013]專利文獻(xiàn)10:國際公開第2011/108370
[0014]專利文獻(xiàn)11:國際公開第2011/108371
[0015]專利文獻(xiàn)12:國際公開2010-119098
[0016]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438頁1999年
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[0018]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子及其他4名、遺傳醫(yī)學(xué)、Vol.6、N0.2,271-277頁
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【發(fā)明內(nèi)容】
[0020]發(fā)明要解決的問題
[0021]另外，在如上所述的掃描分子計數(shù)法中使用的共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的情況下，由于光軸方向的分辨率高于普通的光學(xué)顯微鏡，因此在從共焦區(qū)組織(光檢測區(qū)域)釋放出有意義的背景光的情況下，當(dāng)不發(fā)光的單個粒子通過共焦區(qū)組織的內(nèi)部時，觀測到來自共焦區(qū)組織的光強(qiáng)度的下降(專利文獻(xiàn)12)。因此，本申請的 申請人:在日本特愿2011-184635中提出了如下一種“反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法”:使用不發(fā)光的單個粒子作為觀測對象粒子，利用與通過光檢測區(qū)域掃描釋放出實質(zhì)固定的背景光的樣本溶液內(nèi)的“掃描分子計數(shù)法”同樣的方法進(jìn)行光的檢測，檢測不發(fā)光或發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的單個粒子被包含在光檢測區(qū)域內(nèi)時的單個粒子的光強(qiáng)度的下降，從而檢測單個粒子的存在。根據(jù)所述的“反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法”，能夠檢測低濃度的不發(fā)光的單個粒子。
[0022]另外，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人等的研究發(fā)現(xiàn)，如上述的“反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法”的情況那樣，即使在來自共焦區(qū)組織的光中存在有意義的背景光，如果來自發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度高于背景光，則也能夠逐個檢測單個發(fā)光粒子所釋放的光。因而，在包含在檢測光波長下不發(fā)光或發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的單個粒子(以下稱為“非發(fā)光粒子”。)和在檢測光波長下發(fā)光強(qiáng)度高于背景光的單個發(fā)光粒子的溶液中，如果進(jìn)行依照掃描分子計數(shù)法的光測量，貝1J與非發(fā)光粒子對應(yīng)的信號(光強(qiáng)度的變化)表現(xiàn)為向下凸，與發(fā)光粒子對應(yīng)的信號表現(xiàn)為向上凸。即，在這種情況下，能夠同時且相互區(qū)分地檢測包含在同一樣本溶液中的非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子各自的存在。在本發(fā)明中，有利地利用所述知識。
[0023]這樣，本發(fā)明的主要課題在于提供一種在檢測光波長下不發(fā)光或發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的單個粒子(非發(fā)光粒子)和在檢測光波長下發(fā)光強(qiáng)度高于背景光的單個粒子(發(fā)光粒子)包含在同一樣本溶液內(nèi)的情況下能夠利用掃描分子計數(shù)法的原理來識別并檢測非發(fā)光粒子和發(fā)光粒子各自的存在的單個粒子檢測技術(shù)。
[0024]用于解決問題的方案
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個方式，通過下述單個粒子檢測裝置來達(dá)成上述課題，該單個粒子檢測裝置使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的單個粒子，該單個粒子檢測裝置的特征在于，包括:光檢測區(qū)域移動部，其使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動；光檢測部，其檢測來自光檢測區(qū)域的光；以及信號處理部，其生成一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊由光檢測部檢測出的來自光檢測區(qū)域的光的按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測表示各個單個粒子的存在的信號，其中，由光檢測部檢測出的來自光檢測區(qū)域的光包含實質(zhì)固定的背景光，單個粒子包含具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個粒子和具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個粒子，第一單個粒子的信號為在該第一單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、由光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的增大，第二單個粒子的信號為在該第二單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、由光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的下降。
[0026]在所述結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散并隨機(jī)運動的單個粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等，只要是不固定在基板等上而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運動的粒子，則可以是任意的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指這些顯微鏡中檢測光的微小區(qū)域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地根據(jù)物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來確定。)?！吧鲜鰜碜怨鈾z測區(qū)域的光包含實質(zhì)固定的背景光”是指光檢測區(qū)域內(nèi)不存在作為觀測對象的單個粒子時的檢測光(即，背景光)的強(qiáng)度值為收斂于允許誤差范圍內(nèi)的有意義的強(qiáng)度值。換言之，背景光被調(diào)節(jié)成其變動與單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的檢測光的強(qiáng)度的變動幅度相比充分小。此外，在本說明書中，在稱為“單個粒子的信號”的情況下，只要沒有特別限定，就是指表示單個粒子的存在的信號?！爸饌€檢測表示各個單個粒子的存在的信號”即是指按每個單個粒子逐一地檢測按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的光強(qiáng)度的暫時性的增大或下降。另外，在下面，將具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的單個粒子(第一單個粒子)稱為“發(fā)光粒子”，將具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的單個粒子(第二單個粒子)稱為“非發(fā)光粒子”。即，關(guān)于非發(fā)光粒子，優(yōu)選檢測光的波長頻帶下的發(fā)光強(qiáng)度幾乎為0，但是即使是與背景光的強(qiáng)度相比有意的低水平，也是可以允許的。
[0027]如從上述理解的那樣，在本發(fā)明的裝置中，基本上與專利文獻(xiàn)9?11所記載的“掃描分子計數(shù)法”同樣地，一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊逐次進(jìn)行光的檢測。在所述結(jié)構(gòu)中，在來自光檢測區(qū)域的光中包含了有意義的強(qiáng)度的背景光的情況下，在發(fā)光粒子(第一單個粒子)進(jìn)入到光檢測區(qū)域時或在樣本溶液內(nèi)移動的光檢測區(qū)域包含有發(fā)光粒子時，由于發(fā)光粒子的存在而來自光檢測區(qū)域的到達(dá)光檢測部的光強(qiáng)度或光量增大，在非發(fā)光粒子(第二單個粒子)進(jìn)入到光檢測區(qū)域時或在樣本溶液內(nèi)移動的光檢測區(qū)域包含有非發(fā)光粒子時，由于非發(fā)光粒子的存在而來自光檢測區(qū)域的到達(dá)光檢測部的光強(qiáng)度或光量下降。這樣，在本發(fā)明的裝置中，在樣本溶液中包含發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子作為觀測對象粒子即單個粒子的情況下，以從光檢測區(qū)域檢測出有意義的(比發(fā)光粒子的光強(qiáng)度低且比非發(fā)光粒子的光強(qiáng)度高的值的)背景光強(qiáng)度的狀態(tài)進(jìn)行光檢測，生成時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。然后，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，將光強(qiáng)度或光量的增大和/或下降分別逐個檢測為第一和第二單個粒子的信號，從而以第一和第二單個粒子的存在被相互識別出的方式進(jìn)行檢測。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，樣本溶液中的互不相同的粒子、即各第一和第二粒子被分開檢測出、即按種類被檢測出，按種類獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。換言之，在本發(fā)明的裝置中，在某檢測波長頻帶下的光測量中，能夠逐個檢測種類互不相同的至少兩種單個粒子。
[0028]在上述本發(fā)明的裝置中，作為來自光檢測區(qū)域的光中應(yīng)該包含的背景光，可以是在樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光。在這種情況下，可以在釋放光或使光散射的物質(zhì)未分散于作為樣本溶液使用的溶液中的情況下，在所述溶液中主動地溶解或分散釋放光或使光散射的物質(zhì)。另外，在作為樣本溶液使用的溶液發(fā)出自體熒光的情況下，可以利用該自體熒光作為上述背景光。特別是在產(chǎn)生背景光的物質(zhì)以及作為觀察對象粒子的發(fā)光粒子需要激勵光或照明光的情況下，在顯微鏡裝置中配備照明光用的光源和光學(xué)系統(tǒng)。另一方面，在產(chǎn)生背景光的物質(zhì)沒有激勵光或照明光而發(fā)光的情況下，例如在通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光而發(fā)光的物質(zhì)的情況下，在顯微鏡裝置中不需要照明光。并且，應(yīng)該理解到，對于背景光，如果在光檢測區(qū)域內(nèi)存在非發(fā)光粒子的情況下減少，則也可以是通過透射照明等產(chǎn)生的照明光。
[0029]另外，在上述本發(fā)明的裝置中的發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，優(yōu)選發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度大到足以能夠與背景光強(qiáng)度相區(qū)分。因此，優(yōu)選的是，調(diào)整發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系，使得發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度高于從與光檢測區(qū)域內(nèi)存在發(fā)光粒子時的排除體積相當(dāng)?shù)捏w積區(qū)域釋放的背景光強(qiáng)度。即，優(yōu)選調(diào)整背景光強(qiáng)度和發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度使得從每單位體積的發(fā)光粒子(第一單個粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。另一方面，在本發(fā)明的裝置中的非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，如果調(diào)整非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系使得非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度低于從與光檢測區(qū)域內(nèi)存在非發(fā)光粒子時的排除體積相當(dāng)?shù)捏w積區(qū)域釋放的背景光強(qiáng)度，則由于非發(fā)光粒子的存在而產(chǎn)生光強(qiáng)度的減少。因而，優(yōu)選調(diào)整背景光強(qiáng)度和非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度使得從每單位體積的非發(fā)光粒子(第二單個粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。特別是在檢測由于非發(fā)光粒子的存在而引起的背景光的減少的情況下，背景光的減少程度依賴于非發(fā)光粒子的尺寸與光檢測區(qū)域的尺寸之間的關(guān)系。關(guān)于該點，根據(jù)考慮了后面記述的背景光的變動幅度的估計，發(fā)現(xiàn)在非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度實質(zhì)為O的情況下，優(yōu)選的是，非發(fā)光粒子的外徑為光檢測區(qū)域的直徑的15%以上，更為優(yōu)選的是，非發(fā)光粒子的外徑為光檢測區(qū)域的直徑的35%以上。(參照日本特愿2011-184635)。在發(fā)光粒子的情況下，每單位體積的發(fā)光強(qiáng)度越強(qiáng)，則能夠檢測的發(fā)光粒子的外徑與光檢測區(qū)域的直徑之比越小。對于背景光的調(diào)節(jié)，例如可以通過調(diào)節(jié)樣本溶液中任意發(fā)光物質(zhì)的分散量來進(jìn)行。
[0030]可以根據(jù)單個粒子的特性或者樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)?shù)刈兏鲜霰景l(fā)明的裝置中的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動速度。特別地，當(dāng)光檢測區(qū)域的移動速度變快時，由于單個粒子的存在而引起的光強(qiáng)度或光量的增大/下降的程度減少，因此優(yōu)選的是，能夠適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的移動速度以能夠高精度或高靈敏度地測量由單個粒子引起的光強(qiáng)度或光量的增大/下降。
[0031]另外，優(yōu)選的是，將光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動速度設(shè)定得比作為檢測對象的單個粒子的擴(kuò)散移動速度(由布朗運動引起的粒子的平均移動速度)高。如上述說明的那樣，本發(fā)明的裝置在光檢測區(qū)域通過單個粒子的存在位置時檢測由于該單個粒子的存在而引起的光強(qiáng)度或光量的增大/下降來逐個檢測單個粒子。然而，單個粒子在溶液中由于進(jìn)行布朗運動而隨機(jī)地移動，在多次出入光檢測區(qū)域的情況下，導(dǎo)致從一個單個粒子多次檢測到表示其存在的信號，難以使檢測出的信號與一個單個粒子的存在對應(yīng)起來。因此，如上述那樣，將光檢測區(qū)域的移動速度設(shè)定得比單個粒子的擴(kuò)散移動速度高，由此能夠使一個單個粒子對應(yīng)一個(表示單個粒子的存在的)信號。此外，擴(kuò)散移動速度因單個粒子的特性的不同而變化，因此，如上所述，優(yōu)選的是本發(fā)明的裝置構(gòu)成為能夠根據(jù)單個粒子的特性(特別是擴(kuò)散系數(shù))適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的移動速度。
[0032]可以通過任意的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動。例如，可以使用在激光掃描型光學(xué)顯微鏡中所采用的檢電鏡(Galvano-miiror)等變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來變更光檢測區(qū)域的位置，或者可以(例如移動顯微鏡的臺等)移動樣本溶液的位置來移動光檢測區(qū)域在樣本溶液內(nèi)的相對位置。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可以任意地設(shè)定，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。特別是在變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來變更光檢測區(qū)域的位置的情況下，光檢測區(qū)域的移動迅速，并且在樣本溶液中實質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動、流體動力的作用，因此作為檢測對象的單個粒子不會受到力學(xué)作用的影響而能夠在穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測量，在這點上是有利的。
[0033]另外，在上述本發(fā)明的裝置的信號處理部的處理中，可以根據(jù)由光檢測部檢測出的按時間序列的表示光的信號的形狀來進(jìn)行根據(jù)逐次的來自光檢測部的檢測值的信號判斷是否一個粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域的判斷。在一個實施方式中，可以在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有比規(guī)定的閾值高或低的光強(qiáng)度的信號時，判斷為一個單個粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域。更具體地說，如后面的實施方式一欄中說明的那樣，通常表示單個粒子的存在的信號在光檢測部的按時間序列的檢測值、即光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為超過某種程度的強(qiáng)度的向上凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(在發(fā)光粒子的情況下)、或者表現(xiàn)為低于某種程度的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀的信號(在非發(fā)光粒子的情況下)，噪聲不是吊鐘型的脈沖狀或者表現(xiàn)為振幅小的信號。因此，本發(fā)明的裝置的信號處理部可以構(gòu)成為將時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而超過規(guī)定閾值的向上凸的吊鐘型的脈沖狀的信號或低于規(guī)定閾值的向下凸的吊鐘型的脈沖狀的信號檢測為表示單個粒子的存在的信號?！耙?guī)定閾值”能夠通過實驗設(shè)定為適當(dāng)?shù)闹怠?br>
[0034]并且，通過本發(fā)明的裝置得到的光強(qiáng)度比較微弱，產(chǎn)生細(xì)小的增加和減少，所述的光強(qiáng)度的細(xì)小的增加和減少使表示單個粒子的存在的信號的檢測精度變差。因此，信號處理部可以構(gòu)成為使按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，在對數(shù)據(jù)進(jìn)行加工以能夠忽略光強(qiáng)度的細(xì)小的增加和減少之后，將平滑化后的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而超過規(guī)定閾值的向上凸的吊鐘型的脈沖狀的信號或者具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀的信號檢測為表示單個粒子的存在的信號。
[0035]并且，在另一個實施方式中，單個粒子的信號的檢測處理可以通過以下方式進(jìn)行(參照日本特愿2012-32421):計算光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度的時間變化的、假定在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在單個粒子的狀態(tài)的情況下的產(chǎn)生概率和假定在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的狀態(tài)的情況下的產(chǎn)生概率，根據(jù)這些產(chǎn)生概率檢測單個粒子在光檢測區(qū)域內(nèi)存在的時間來檢測表示各個單個粒子的存在的信號。如果清楚地進(jìn)行描述，則在掃描分子計數(shù)法的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上發(fā)現(xiàn)，噪聲始終是隨機(jī)地瞬間的光強(qiáng)度的增大/下降，與此相對地，如果是單個粒子的信號，則是在時間上集中的光強(qiáng)度的增大/下降。即，單個粒子的信號和噪聲在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案不同，因此在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的某部分的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案為在光檢測區(qū)域內(nèi)沒有單個粒子的情況下容易產(chǎn)生的圖案時，能夠判斷為該部分是只有噪聲的部分，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的某部分的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況下容易產(chǎn)生的圖案時，能夠判斷為該部分是與單個粒子的信號對應(yīng)的部分。因此，計算在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案的、在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況和不存在單個粒子的情況的各個情況下產(chǎn)生的概率，辨別該光強(qiáng)度值的時間變化的圖案是在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況和在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在單個粒子的情況的哪一個情況下容易產(chǎn)生的圖案，由此能夠檢測單個粒子的信號。
[0036]并且，在上述本發(fā)明的一個實施方式中，可以對信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)來對包含在光檢測區(qū)域中的單個粒子的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)(粒子的計數(shù))。在這種情況下，通過將所檢測出的單個粒子的個數(shù)和光檢測區(qū)域的位置的移動量組合，能夠獲得與樣本溶液中的被分類的單個粒子的數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息。具體地說，例如可以計算多個樣本溶液的數(shù)密度或濃度之比，或者計算相對于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對的數(shù)密度或濃度之比，或者使用相對于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對的數(shù)密度或濃度之比來確定絕對的數(shù)密度值或濃度值?；蛘撸绻ㄟ^任意的方法、例如以規(guī)定的速度移動光檢測區(qū)域的位置等而能夠確定出光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡的總體積，則能夠具體估算單個粒子的數(shù)密度或濃度。特別地，在本發(fā)明的情況下，能夠?qū)旌洗嬖谟谕粯颖救芤褐械陌l(fā)光粒子和非發(fā)光粒子分別分開地進(jìn)行計數(shù)和/或濃度的估算。
[0037]此外，關(guān)于如上所述的粒子的計數(shù)，在其典型的方式中是對在任意設(shè)定的測量時間中獲得的單個粒子的信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。然而，在這種情況下，根據(jù)設(shè)定的測量時間的長度的不同而檢測出的單個粒子的信號數(shù)發(fā)生變動，特別地，在單個粒子濃度低時，基于檢測信號數(shù)估算的單個粒子濃度值的偏差變大而精度可能下降。因此，在上述本發(fā)明的裝置中，作為粒子計數(shù)的其它方式，可以執(zhí)行測量直到單個粒子的信號數(shù)達(dá)到任意設(shè)定的個數(shù)為止，根據(jù)測量時間估算單個粒子濃度值。即，上述本發(fā)明的裝置可以構(gòu)成為重復(fù)進(jìn)行光檢測區(qū)域移動部使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的移動、光檢測部對來自光檢測區(qū)域的光的檢測以及信號處理部對表示單個粒子的存在的信號的檢測直到信號處理部檢測出的表示單個粒子的存在的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)為止，根據(jù)表示單個粒子的存在的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間來確定樣本溶液中的單個粒子的濃度。在這種情況下，對于單個粒子的濃度高的樣本溶液，期待測量時間的縮短，對于單個粒子的濃度低的樣本溶液，花費充分的時間執(zhí)行測量。即，根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，與單個粒子的濃度相應(yīng)地使測量時間最優(yōu)化。另外，如果事先將預(yù)先決定的個數(shù)設(shè)定為達(dá)成結(jié)果所要求的精度的個數(shù)，則能夠?qū)z測預(yù)先決定的該個數(shù)的單個粒子所需要的時間或基于時間導(dǎo)出的任意結(jié)果中的偏差抑制得小，從而滿足結(jié)果的精度。
[0038]在上述本發(fā)明的裝置中，也能夠通過通用的計算機(jī)實現(xiàn)一邊使光檢測區(qū)域的位置在發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子混合存在的樣本溶液內(nèi)移動一邊在背景光的存在下進(jìn)行光檢測并將光強(qiáng)度或光量的增大或下降分別逐次地檢測為發(fā)光粒子或非發(fā)光粒子的信號的單個粒子檢測技術(shù)的處理。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個方式，提供一單個粒子檢測用計算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的單個粒子，該單個粒子檢測用計算機(jī)程序使計算機(jī)執(zhí)行以下步驟:使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動；一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光并生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測表示各個單個粒子的存在的信號；其中，檢測出的來自光檢測區(qū)域的光包含實質(zhì)固定的背景光，單個粒子包含具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個粒子和具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個粒子，第一單個粒子的信號為在該第一單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，第二單個粒子的信號為在該第二單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。此外，通過存儲到計算機(jī)能夠讀取的存儲介質(zhì)中來提供計算機(jī)程序。計算機(jī)通過讀出存儲在存儲介質(zhì)中的程序來執(zhí)行信息的加工、運算處理，由此實現(xiàn)上述步驟。在此，計算機(jī)能夠讀取的記錄介質(zhì)可以是磁盤、磁光盤、⑶_R0M、DVD-R0M、半導(dǎo)體存儲器等。并且，上述的程序也可以通過通信線路傳輸?shù)接嬎銠C(jī)，由接受該傳輸?shù)挠嬎銠C(jī)來執(zhí)行程序。
[0039]在所述的結(jié)構(gòu)中也同樣，背景光可以是分散在樣本溶液內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光、或者是照明光。另外，優(yōu)選的是，調(diào)整背景光強(qiáng)度以及發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度，使得在發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的發(fā)光粒子(第一單個粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，并且在非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的非發(fā)光粒子(第二單個粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。特別地，非發(fā)光粒子的外徑優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的15%以上，更優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的35%以上。
[0040]另外，在上述的計算機(jī)程序中，也可以根據(jù)按時間序列的信號的形狀來進(jìn)行表示各個單個粒子的存在的信號的逐個檢測。在實施方式中，典型地是，在逐個檢測表示單個粒子的存在的信號的步驟中，可以形成為在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有高于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號時，判斷為一個發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域，在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有低于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號時，判斷為一個非發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域。具體地說，在逐個檢測表示單個粒子的存在的信號的步驟中，可以將時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有超過規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向上凸的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示發(fā)光粒子的存在的信號，將從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示非發(fā)光粒子的存在的信號，此時，可以對時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑化，將平滑化后的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示單個粒子的存在的信號。或者，作為不同的、表示各個單個粒子的存在的信號的逐個檢測的其它方式，也可以對在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案計算其在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況和不存在單個粒子的情況的各情況下產(chǎn)生的概率，辨別該光強(qiáng)度值的時間變化的圖案是在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況和不存在單個粒子的情況的哪一個情況下容易產(chǎn)生的圖案，由此進(jìn)行單個粒子的信號的檢測。
[0041]并且，可以根據(jù)單個粒子的特性、樣本溶液中的數(shù)密度或濃度來適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動速度，優(yōu)選的是，將光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動速度設(shè)定得比作為檢測對象的單個粒子的擴(kuò)散移動速度高?？梢酝ㄟ^任意的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置這樣本溶液內(nèi)的移動，優(yōu)選的是，可以通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路或者移動樣本溶液的位置來變更光檢測區(qū)域的位置。可以任意地設(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0042]并且，在上述的計算機(jī)程序中也同樣，可以包括以下步驟:對逐個檢測出的單個粒子的信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)來對在光檢測區(qū)域的位置的移動過程中檢測出的單個粒子的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)；和/或根據(jù)檢測出的單個粒子的個數(shù)來確定樣本溶液中的單個粒子的數(shù)密度或濃度。此外，在上述的計算機(jī)程序的情況下也同樣，在粒子的計數(shù)中，典型地是，對在任意設(shè)定的測量時間中獲得的單個粒子的信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)，但是也可以執(zhí)行測量直到單個粒子的信號數(shù)達(dá)到任意設(shè)定的個數(shù)為止，根據(jù)測量時間估算單個粒子濃度值。因而，上述的計算機(jī)程序也可以包括以下步驟:重復(fù)進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動、來自光檢測區(qū)域的光的檢測以及表示單個粒子的存在的信號的檢測直到表示單個粒子的存在的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)為止，根據(jù)表示單個粒子的存在的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間來確定樣本溶液中的單個粒子的濃度。
[0043]根據(jù)上述本發(fā)明的裝置或計算機(jī)程序，實現(xiàn)一邊使光檢測區(qū)域的位置在發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子混合存在的樣本溶液內(nèi)移動一邊在背景光的存在下進(jìn)行光檢測并將光強(qiáng)度或光量的增大或下降分別逐次地檢測為發(fā)光粒子或非發(fā)光粒子的信號的新的方法。這樣，根據(jù)本發(fā)明，還提供一種單個粒子檢測方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的單個粒子，該單個粒子檢測方法的特征在于，包括以下過程:使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動；一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光并生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測表示各個單個粒子的存在的信號，其中，檢測出的來自光檢測區(qū)域的光包含實質(zhì)固定的背景光，單個粒子包含具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個粒子和具有比背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個粒子，第一單個粒子的上述信號為在第一單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，第二單個粒子的上述信號為在第二單個粒子進(jìn)入到光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。
[0044]在所述結(jié)構(gòu)中也同樣，背景光可以是分散在樣本溶液內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生的突光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光、或者是照明光。另外，優(yōu)選的是，調(diào)整背景光強(qiáng)度以及發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度，使得在發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的發(fā)光粒子(第一單個粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，并且在非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系中，從每單位體積的非發(fā)光粒子(第二單個粒子)釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從每單位體積的光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。特別地，非發(fā)光粒子的外徑優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的15%以上，更優(yōu)選為光檢測區(qū)域的直徑的35%以上。
[0045]另外，在上述的方法中也同樣，可以根據(jù)按時間序列的信號的形狀來進(jìn)行表示各個單個粒子的存在的信號的逐個檢測。在實施方式中，典型地是，在逐個檢測表示單個粒子的存在的信號的過程中，可以在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有高于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號時，判斷為一個發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域，在檢測出從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有低于規(guī)定的閾值的光強(qiáng)度的信號時，判斷為一個非發(fā)光粒子進(jìn)入到了光檢測區(qū)域。具體地說，在逐個檢測表示單個粒子的存在的信號的過程中，將時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有超過規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向上凸的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示發(fā)光粒子的存在的信號，將從背景光的強(qiáng)度起進(jìn)行計量而具有低于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的向下凸的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示非發(fā)光粒子的存在的信號，此時，可以使時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的吊鐘型的脈沖狀信號檢測為表示單個粒子的存在的信號。或者，作為表示各個單個粒子的存在的信號的逐個檢測的其它方式，也可以對在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案計算其在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況和不存在單個粒子的情況的各情況下產(chǎn)生的概率，辨別該光強(qiáng)度值的時間變化的圖案是在光檢測區(qū)域內(nèi)存在單個粒子的情況和不存在單個粒子的情況的哪一個情況下容易產(chǎn)生的圖案，由此進(jìn)行單個粒子的信號的檢測。
[0046]并且，可以根據(jù)單個粒子的特性、樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動速度，優(yōu)選的是，將光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動速度設(shè)定得比作為檢測對象的單個粒子的擴(kuò)散移動速度高?？梢酝ㄟ^任意的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動，優(yōu)選的是，可以通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路或者移動樣本溶液的位置來變更光檢測區(qū)域的位置?？梢匀我獾卦O(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0047]并且，在上述的方法中也可以包含以下過程:對逐個檢測出的單個粒子的信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)來對在光檢測區(qū)域的位置的移動過程中檢測出的單個粒子的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)；和/或根據(jù)檢測出的單個粒子的個數(shù)來確定樣本溶液中的單個粒子的數(shù)密度或濃度。此夕卜，在上述的方法的情況下也同樣，在粒子的計數(shù)中，典型地是，對在任意設(shè)定的測量時間中獲得的單個粒子的信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)，但是也可以執(zhí)行測量直到單個粒子的信號數(shù)達(dá)到任意設(shè)定的個數(shù)為止，根據(jù)測量時間估算單個粒子濃度值。因而，上述的方法也可以包括以下過程:重復(fù)進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動、來自光檢測區(qū)域的光的檢測以及表示單個粒子的存在的信號的檢測直到表示單個粒子的存在的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)為止，根據(jù)表示單個粒子的存在的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間來確定樣本溶液中的單個粒子的濃度。
[0048]上述本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)典型地用于分析或解析蛋白質(zhì)、肽、核酸、月旨質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)對象物在溶液中的狀態(tài)的用途，但是也可以用于分析或解析非生物學(xué)粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、脂質(zhì)體、金屬膠體、微珠(磁珠、聚苯乙烯珠、膠乳珠等)、消光劑(偶氮苯類(dabcyl、BHQ等))、金屬粒子等)在溶液中的狀態(tài)，應(yīng)該理解為這種情況也屬于本發(fā)明的范圍。
[0049]發(fā)明的效果
[0050]如果清楚地進(jìn)行描述，本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)是依照掃描分子計數(shù)法來在溶液中分散有發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的情況下進(jìn)行這些單個粒子的檢測的技術(shù)。應(yīng)該理解的是，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，通過一個檢測光波長頻帶下的光測量能夠同時檢測發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的存在。因而，在本發(fā)明的技術(shù)中，通過將發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子調(diào)制為不同種類的觀測對象粒子，能夠通過一次測量來針對兩種觀測對象粒子進(jìn)行各個種類的存在檢測、粒子的計數(shù)、濃度檢測等。
[0051]通過本發(fā)明的以下優(yōu)選實施方式的說明可清楚本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052]圖1的(A)是本發(fā)明的執(zhí)行掃描分子計數(shù)法的單個粒子檢測裝置的內(nèi)部構(gòu)造的示意圖。圖1的(B)是共焦區(qū)組織(共焦顯微鏡的光檢測區(qū)域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖1的(D)是移動微板的水平方向位置來移動樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0053]圖2的(A)、⑶分別是說明本發(fā)明的掃描分子計數(shù)法中的檢測單個粒子的存在的原理的示意圖以及所測量的光強(qiáng)度的時間變化的示意圖。
[0054]圖3是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計數(shù)法的處理步驟的一個方式(時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的平滑化以及利用吊鐘型函數(shù)的擬合進(jìn)行的單個粒子信號的檢測)的圖。
[0055]圖4的(A)、(B)分別是表示在單個粒子一邊進(jìn)行布朗運動一邊橫穿光檢測區(qū)域時以及在通過以比單個粒子的擴(kuò)散移動速度快的速度使樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置移動而粒子橫穿光檢測區(qū)域時的粒子的運動方式的模型圖。圖4的(C)是說明用于依照圖3的處理根據(jù)所測量的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計數(shù)的時間變化)檢測單個粒子的存在的處理步驟中的檢測信號的信號處理過程的例子的圖。
[0056]圖5是說明基于時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率的單個粒子信號的檢測原理的圖。(A)表示時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的示意性的例子。(左)圖是存在亮度大的發(fā)光粒子的情況。(中)圖是存在亮度小的發(fā)光粒子的情況。(右)圖是不存在發(fā)光粒子的情況。(B)是說明在本發(fā)明中在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上設(shè)定的解析窗的圖。
[0057]圖6是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計數(shù)法的處理過程的另一方式(基于時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率檢測單個粒子信號)的圖。
[0058]圖7是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計數(shù)法的處理過程的另一方式(執(zhí)行單個粒子信號的檢測直到計數(shù)出規(guī)定的粒子數(shù)為止的情況)的圖。
[0059]圖8的(A)示出依照本發(fā)明的掃描分子計數(shù)法獲得的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計數(shù)數(shù)據(jù))的一部分。圖8的(B)示出分別假定(A)的數(shù)據(jù)中存在非發(fā)光粒子的情況和不存在非發(fā)光粒子的情況而計算出的產(chǎn)生概率的比值比，圖8的(C)示出分別假定(A)的數(shù)據(jù)中存在發(fā)光粒子的情況和不存在發(fā)光粒子的情況而計算出的產(chǎn)生概率的比值比。
[0060]圖9表示對不含粒子的溶液(0:0)、僅含非發(fā)光粒子的溶液(2:0)、僅含發(fā)光粒子的溶液(0:2)、包含發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的溶液(1:1)依照本發(fā)明的掃描分子計數(shù)法檢測出的脈沖數(shù)的平均值(直方圖表)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差條)。
[0061]附圖標(biāo)記說明
[0062]1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ；4:準(zhǔn)直透鏡；5:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡(condenser lens) ；13:針孔；14:屏蔽濾波器；14a:分色鏡或偏振分束器；15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ；16:光檢測器；17:反射鏡偏轉(zhuǎn)器；17a:臺位置變更裝置；18:計算機(jī)。
【具體實施方式】
[0063]下面，詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。
_4] 單個粒子檢測裝置的結(jié)構(gòu)
[0065]實現(xiàn)本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)的單個粒子檢測裝置可以是如下的裝置:在基本結(jié)構(gòu)中，如圖1的(A)示意性地例示那樣，組合能夠執(zhí)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測器而成。參照該圖，單個粒子檢測裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2?17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的動作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計算機(jī)18構(gòu)成。單個粒子檢測裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，在此，使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射，通過準(zhǔn)直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。
[0066]典型地是，在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I μ L?幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中聚焦，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激勵區(qū)域)。此外，在樣本溶液中典型地是分散或溶解有作為觀測對象物的發(fā)光粒子、非發(fā)光粒子以及產(chǎn)生背景光的任意的發(fā)光物質(zhì)，在觀測對象粒子未進(jìn)入激勵區(qū)域時，發(fā)光物質(zhì)被激勵而釋放出實質(zhì)固定的光成為背景光，當(dāng)非發(fā)光粒子進(jìn)入激勵區(qū)域時，背景光降低，當(dāng)發(fā)光粒子進(jìn)入激勵區(qū)域時，發(fā)光粒子釋放的光加上背景光而光強(qiáng)度增大。
[0067]這樣，從激勵區(qū)域釋放出的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過針孔13，透過屏蔽濾波器14 (在此，只選擇特定波長頻帶的光成分。)，被導(dǎo)入到多模光纖15，到達(dá)光檢測器16，在被變換為按時間序列的電信號之后輸入到計算機(jī)18，以后面說明的方式進(jìn)行用于單個粒子檢測的處理。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，在上述結(jié)構(gòu)中，針孔13配置在與物鏡8的焦點位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的激光的焦點區(qū)域、即激勵區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過針孔13，來自激勵區(qū)域以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點區(qū)域通常是具有IfL?1fL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測區(qū)域(典型地是光強(qiáng)度以區(qū)域中心為頂點的高斯型分布。有效體積是以光強(qiáng)度為Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。)，被稱為共焦區(qū)組織。
[0068]另外，在本發(fā)明中，檢測由來自幾個分子左右的熒光色素分子的微弱光構(gòu)成的背景光存在下的、由于單個粒子的存在而引起的光量的增大或下降，因此作為光檢測器16，優(yōu)選使用能夠在光子計數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測器。在光的檢測是通過光子計數(shù)進(jìn)行的情況下，以在規(guī)定時間內(nèi)按每個規(guī)定的單位時間(BIN TIME)逐次測量來到光檢測器的光子的個數(shù)的方式執(zhí)行光強(qiáng)度的測量。因而，在這種情況下，按時間序列的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)是按時間序列的光子計數(shù)數(shù)據(jù)。另外，可以在顯微鏡的臺(未圖示)設(shè)置用于移動微板9的水平方向位置以變更要觀察的皿10的臺位置變更裝置17a?？梢杂捎嬎銠C(jī)18控制臺位置變更裝置17a的動作。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在存在多個檢體的情況下也能夠達(dá)成迅速的測量。
[0069]并且，在上述的單個粒子檢測裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有用于通過光檢測區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)的、即用于使焦點區(qū)域即光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動的機(jī)構(gòu)。作為所述的用于使光檢測區(qū)域的位置移動的機(jī)構(gòu)，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17 (移動光檢測區(qū)域的絕對位置的方式)。所述反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同?；蛘?，作為其它的方式，如圖1的(D)所例示的那樣，也可以使臺位置變更裝置17a進(jìn)行動作以移動注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置而使光檢測區(qū)域在樣本溶液內(nèi)的相對位置移動(使樣本溶液的絕對位置移動的方式)。無論在哪種方式的情況下，都在計算機(jī)18的控制下，與光檢測器16的光檢測協(xié)調(diào)地驅(qū)動反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺位置變更裝置17a以達(dá)成所期望的光檢測區(qū)域的位置的移動圖案。可以從圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡(可以設(shè)為在計算機(jī)18中的程序中能夠選擇各種移動圖案。)。另外，可以將使光檢測區(qū)域的絕對位置移動的方式與使樣本溶液的絕對位置移動的方式組合來使樣本溶液的位置移動并執(zhí)行光檢測區(qū)域的絕對位置的移動。在這種情況下，避免由于光檢測區(qū)域在短時間內(nèi)通過同一區(qū)域而反復(fù)檢測同一單個粒子?；蛘撸部梢酝ㄟ^使光檢測區(qū)域的絕對位置移動的方式，有意地使光檢測區(qū)域反復(fù)通過同一區(qū)域，來周期性地多次檢測同一單個粒子而實現(xiàn)信號精度的提高。在這種情況下，可以在規(guī)定時間內(nèi)執(zhí)行光檢測區(qū)域的絕對位置的移動之后，間歇地移動樣本溶液的位置，在樣本溶液內(nèi)的其它場所執(zhí)行同一單個粒子的反復(fù)檢測而實現(xiàn)被檢測的單個粒子的個數(shù)的增大。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過使物鏡8或臺上下移動來使光檢測區(qū)域的位置在上下方向上移動，從而將光檢測區(qū)域的位置的軌跡在樣本溶液內(nèi)三維地展開。
[0070]在作為觀測對象粒子的發(fā)光粒子以及生成背景光的發(fā)光物質(zhì)通過多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵光的焦點區(qū)域(光檢測區(qū)域)釋放光，因此可以去除針孔13。另外，在生成背景光的發(fā)光物質(zhì)不通過激勵光而通過化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光的情況下，可以省略用于生成激勵光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。在生成背景光的發(fā)光物質(zhì)通過磷光或散射而發(fā)光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。并且，也可以通過照明光來提供背景光。在這種情況下，從物鏡的上方，通過透射照明(可以是庫勒照明(Kohler illuminat1n)。)來對樣本溶液進(jìn)行照明。
[0071]并且，在光分析裝置I中，如圖示那樣，可以設(shè)置多個激勵光源2，可以根據(jù)發(fā)光粒子或提供背景光的物質(zhì)的激勵波長來適當(dāng)?shù)剡x擇激勵光的波長。另外，也可以構(gòu)成為具備多個光檢測器16，各個光檢測器16分別檢測來自光檢測區(qū)域的光中的互不相同的成分。在這種情況下，在通過針孔13后的檢測光光路中設(shè)置用于以任意方式分割光路的機(jī)構(gòu)。例如，在檢測光光路的部位14a處，通過在檢測光光路上插入對特定波長頻帶的光進(jìn)行反射并使其它的波長頻帶透過的分色鏡14a，能夠分別檢測波長頻帶互不相同的光成分。
[0072]計算機(jī)18具備CPU以及存儲器，通過CPU執(zhí)行各種運算處理來執(zhí)行本發(fā)明的過程。此外，各過程也可以通過硬件構(gòu)成。在本實施方式中說明的處理的全部或一部分可以由計算機(jī)18使用存儲有實現(xiàn)這些處理的程序的計算機(jī)能夠讀取的存儲介質(zhì)來執(zhí)行。即，計算機(jī)18可以通過讀出存儲在存儲介質(zhì)中的程序執(zhí)行信息的加工、運算處理來實現(xiàn)本發(fā)明的處理過程。在此，計算機(jī)能夠讀取的記錄介質(zhì)可以是磁盤、磁光盤、⑶_R0M、DVD-R0M、半導(dǎo)體存儲器等，或者也可以將上述程序通過通信線路傳輸?shù)接嬎銠C(jī)，由接受該傳輸?shù)挠嬎銠C(jī)來執(zhí)行程序。
[0073]本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)的原理
[0074]如“
【發(fā)明內(nèi)容】
” 一欄所記載的那樣，如果清楚地進(jìn)行描述，則在本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)中，在樣本溶液中包含有發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的情況下，在背景光存在下依照掃描分子計數(shù)法測量光檢測區(qū)域的光來獲得時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在所述的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上將光強(qiáng)度的有意義的增大檢測為發(fā)光粒子的信號，將光強(qiáng)度的有意義的下降檢測為非發(fā)光粒子的信號。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在一個檢測光波長頻帶下的一次光測量中，能夠進(jìn)行作為觀測對象粒子的兩種互不相同的粒子的檢測、對這些粒子的計數(shù)、或者與樣本溶液中的濃度有關(guān)的信息的獲取等。下面，說明本發(fā)明的掃描分子計數(shù)法的原理。
[0075]在“掃描分子計數(shù)法”(專利文獻(xiàn)9?11)中，基本上是驅(qū)動用于移動光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來變更光路或者移動注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，如圖2的(A)示意性地描繪的那樣，一邊使光檢測區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi)，一邊執(zhí)行光檢測。此時,特別地，在本發(fā)明的情況下，使光檢測區(qū)域釋放背景光(或者，用照明光對光檢測區(qū)域進(jìn)行照明)，由此，在光檢測區(qū)域CV的移動過程中(圖中為時間t0?t3)，大致一致地檢測到背景光。而且，在光檢測區(qū)域CV通過存在一個發(fā)光粒子的區(qū)域時(tl)，除了背景光以外，還從發(fā)光粒子釋放出光，因此如圖2的(B)所描繪的那樣在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)吊鐘型的脈沖狀的有意義的光強(qiáng)度的增大。另外，在光檢測區(qū)域CV通過存在一個非發(fā)光粒子的區(qū)域時(t2)，來自光檢測區(qū)域CV的光量減少，因此如圖2的(B)所描繪的那樣在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)吊鐘型的脈沖狀的有意義的光強(qiáng)度的下降。因此，執(zhí)行上述的光檢測區(qū)域CV的位置的移動和光檢測，逐一檢測在該期間出現(xiàn)的如圖2的(B)所例示的那樣的脈沖狀的信號(有意義的光強(qiáng)度的增大和下降)，由此一邊逐個地且分別識別發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子一邊進(jìn)行檢測，通過對發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子各自的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)，能夠獲取存在于所測量的區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的個數(shù)或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息以及非發(fā)光粒子的個數(shù)或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0076]如上所述，為了達(dá)成背景光存在下的發(fā)光粒子的信號和非發(fā)光粒子的信號的檢測，需要適當(dāng)?shù)卣{(diào)整發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系以及非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系。關(guān)于發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系，如果清楚地進(jìn)行描述，則只要光檢測區(qū)域中存在發(fā)光粒子時、即發(fā)光粒子占有光檢測區(qū)域內(nèi)的一部分空間時的整個光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度大于光檢測區(qū)域中不存在發(fā)光粒子時的整個光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度即可，因此在檢測光波長頻帶，使每單位體積的發(fā)光粒子的發(fā)光量大于每單位體積的背景光的光量。然而，實際上，背景光強(qiáng)度并不完全固定，因此調(diào)整發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度和/或背景光強(qiáng)度以使每單位體積的發(fā)光粒子的發(fā)光量充分大于每單位體積的背景光的光量。(具體地說，可以通過實驗調(diào)整兩者的光強(qiáng)度。)
[0077]另一方面，關(guān)于非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度與背景光強(qiáng)度之間的關(guān)系，只要光檢測區(qū)域中存在非發(fā)光粒子時、即非發(fā)光粒子占有光檢測區(qū)域內(nèi)的一部分空間時的整個光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度小于光檢測區(qū)域中不存在非發(fā)光粒子時的整個光檢測區(qū)域內(nèi)的檢測光波長頻帶下的光強(qiáng)度即可。因而，調(diào)整非發(fā)光粒子的發(fā)光強(qiáng)度和背景光強(qiáng)度使得檢測光波長頻帶下的非發(fā)光粒子的每單位體積的發(fā)光量小于每單位體積的背景光的光量。(即，應(yīng)該理解為，非發(fā)光粒子只要在檢測光波長頻帶下的發(fā)光強(qiáng)度低于背景光的發(fā)光強(qiáng)度即可，也可以不是完全不發(fā)光的粒子。)
[0078]此外，關(guān)于非發(fā)光粒子，能夠根據(jù)非發(fā)光粒子的直徑與光檢測區(qū)域的直徑之間的關(guān)系來估計光強(qiáng)度下降的程度。典型地是，光檢測區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布具有在中心具有最大強(qiáng)度Imax并向半徑r方向強(qiáng)度降低的吊鐘型的輪廓f(r)(參照圖5的(C))。因而，使用使f (r)大致為O的光檢測區(qū)域的半徑a，通過下式給出在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在非發(fā)光粒子時從光檢測區(qū)域內(nèi)釋放出的光的總量α。
[0079]α = 4 π / r2f (r) dr [積分區(qū)間為 O ?a]
[0080]另一方面，在半徑b的非發(fā)光粒子進(jìn)入光檢測區(qū)域內(nèi)并位于光檢測區(qū)域的中心時，由于提供該區(qū)域的背景光的空間(以下稱為“發(fā)光空間”。)被排除，因此降低與被排除的發(fā)光空間相當(dāng)?shù)墓饬?。與該被排除的發(fā)光空間相當(dāng)?shù)墓饬俊⒓聪陆盗喀峦ㄟ^下式給出。
[0081]β = 4 π / r2f(r) dr [積分區(qū)間為 O ?b]
[0082]這樣，能夠通過β/α估計光強(qiáng)度的下降比例。在此，f(r)為高斯函數(shù)，在α =
1、a = I時，成為
[0083]f (r) = 0.684exp (~2r2)。
[0084]典型地是，背景光的變動率為1%左右，當(dāng)非發(fā)光粒子所引起的光強(qiáng)度的下降比例為I %以下時，不能檢測信號，因此當(dāng)通過上述式子進(jìn)行運算時，非發(fā)光粒子半徑相對于光檢測區(qū)域的半徑之比b/a應(yīng)該設(shè)為0.15以上。另外，在將非發(fā)光粒子所引起的光強(qiáng)度的下降比例設(shè)為10%以上的情況下，能夠檢測的非發(fā)光粒子半徑相對于光檢測區(qū)域的半徑之比b/a為0.35。此外，在要觀測的非發(fā)光粒子是消光劑、熒光能量轉(zhuǎn)移的受體的情況下，非發(fā)光粒子吸收周圍(例如1nm)的光，因此能夠檢測的非發(fā)光粒子半徑與上述例示的半徑相比能夠減小。另外，在非發(fā)光粒子發(fā)光的情況下，能夠檢測的非發(fā)光粒子半徑與上述例示的半徑相比能夠增大。
[0085]這樣，在如上所述的本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)中，不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度的波動的計算那樣的統(tǒng)計性的運算處理而是逐一檢測粒子，因此即使在要觀測的粒子的濃度低至通過以往的FCS、FIDA等無法以足夠的精度進(jìn)行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。另外，特別地，根據(jù)存在有意義的背景光，具有降低雜散光、拉曼散射光的影響這樣的優(yōu)點。并且，重要的是，在本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)中，在一個檢測光波長頻帶的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(Ich的光強(qiáng)度數(shù)據(jù))上能夠識別發(fā)光粒子的信號和非發(fā)光粒子的信號，因此達(dá)成同時檢測兩種互不相同的粒子且識別出其種類的方式。所述優(yōu)點在分子的相互作用等的分析中是非常有利的。
[0086]掃描分子計數(shù)法的處理操作過稈
[0087]在依照使用了圖1的(A)所例示的單個粒子檢測裝置I的本發(fā)明的掃描分子計數(shù)法的實施方式中，具體地說，執(zhí)行以下的處理:(1)包含單個粒子和生成背景光的發(fā)光物質(zhì)的樣本溶液的調(diào)制，(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測量處理，(3)測量出的光強(qiáng)度的分析處理。圖3以流程圖的形式示出一個實施方式中的處理。
[0088](I)樣本溶液的調(diào)制
[0089]作為本發(fā)明的光分析技術(shù)的觀測對象物的粒子，如果是溶解的分子等在樣本溶液中分散并在溶液中隨機(jī)運動的粒子，則可以是任意的粒子，例如可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、月旨質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞、或金屬膠體、其它非生物學(xué)分子等。關(guān)于發(fā)光粒子，在觀測對象粒子原本不是發(fā)光粒子的情況下，使用以任意的方式對作為觀測對象物的粒子附加了發(fā)光標(biāo)識(熒光分子、磷光分子、化學(xué)、生物發(fā)光分子)的粒子。關(guān)于非發(fā)光粒子，與發(fā)光粒子的情況同樣地可以是任意的粒子。另外，背景光可以是熒光、自體熒光、散射(拉曼散射(溶劑(水)二硫化碳、異戊二烯、過渡金屬絡(luò)合物)、發(fā)光物質(zhì)所產(chǎn)生的光，或者也可以是均勻光源產(chǎn)生的照明光。在通過發(fā)光物質(zhì)的分散提供背景光的情況下，發(fā)光物質(zhì)可以是任意的發(fā)光分子，例如突光分子、磷光分子、化學(xué)、生物發(fā)光分子，以在光檢測區(qū)域內(nèi)始終存在幾個分子以上的濃度溶解或分散在樣本溶液中。此外，背景光的光量如上述那樣被適當(dāng)調(diào)整為在每單位體積中少于作為觀測對象的發(fā)光粒子的光量且多于作為觀測對象的非發(fā)光粒子的光量。樣本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有機(jī)溶劑及其它任意的液體。
[0090](2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測量(圖3-步驟100)
[0091]本實施方式的利用掃描分子計數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測量除了在測量過程中驅(qū)動反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺位置變更裝置17a來進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(樣本溶液內(nèi)的掃描)以外，可以通過與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度的測量過程相同的方式執(zhí)行。在操作處理中，典型地是，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺上后，在使用者向計算機(jī)18輸入開始測量的指示時，計算機(jī)18依照存儲在存儲裝置(未圖示)中的程序(使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動的過程和在光檢測區(qū)域的位置的移動過程中檢測來自光檢測區(qū)域的光并生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的過程)，開始樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域中的激勵光的照射以及光強(qiáng)度的測量。在所述測量中，在依照計算機(jī)18的程序的處理動作的控制下，反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺位置變更裝置17a驅(qū)動反射鏡7 (檢電鏡)或顯微鏡的臺上的微板9，來執(zhí)行皿10內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動，與此同時地，光檢測器16將逐次檢測出的光變換為電信號并發(fā)送到計算機(jī)18，在計算機(jī)18中，通過任意的方式，根據(jù)所發(fā)送的信號生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。光檢測器16典型地是能夠檢測有無單光子的到來的超高靈敏度光檢測器，因此在光的檢測是利用光子計數(shù)來進(jìn)行的情況下，時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)可以是按時間序列的光子計數(shù)數(shù)據(jù)。
[0092]光強(qiáng)度的測量過程中的光檢測區(qū)域的位置的移動速度是任意地、例如是通過實驗或為了符合分析目的而設(shè)定的規(guī)定的速度。在根據(jù)所檢測出的單個粒子的個數(shù)獲取與其數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息的情況下，需要光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的大小或體積，因此以能夠掌握移動距離的方式執(zhí)行光檢測區(qū)域的位置的移動。此外，測量過程中的經(jīng)過時間和光檢測區(qū)域的位置的移動距離具有比例關(guān)系更容易解釋測量結(jié)果，因此優(yōu)選移動速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0093]另外，關(guān)于光檢測區(qū)域的位置的移動速度，為了定量地高精度地執(zhí)行基于測量出的按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的單個粒子的逐個檢測、或者單個粒子的個數(shù)的計數(shù)，優(yōu)選將所述移動速度設(shè)定為比單個粒子的隨機(jī)運動、即布朗運動所引起的移動速度快的值。本發(fā)明的單個粒子檢測技術(shù)的觀測對象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且隨機(jī)運動的粒子，因此由于布朗運動，位置隨著時間而移動。因而，在光檢測區(qū)域的位置的移動速度比粒子的布朗運動所引起的移動慢的情況下，如圖4的(A)示意性地描繪的那樣，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動，由此光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已經(jīng)提及的那樣，光檢測區(qū)域的激勵光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點向外方降低。)，難以確定與各個單個粒子對應(yīng)的有意義的光強(qiáng)度的變化。因此，優(yōu)選的是將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定得比粒子的因布朗運動引起的平均移動速度(擴(kuò)散移動速度)快，使得如圖4的(B)所描繪的那樣粒子大致直線地橫穿光檢測區(qū)域，由此在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4的(C)最上部所例示的那樣，與各個單個粒子對應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓大致一致(在單個粒子大致直線地通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化的輪廓與將激勵光強(qiáng)度分布反轉(zhuǎn)得到的輪廓大致相同。)，從而能夠容易地確定各個粒子與光強(qiáng)度之間的對應(yīng)。
[0094]具體地說，具有擴(kuò)散系數(shù)D的粒子由于布朗運動而通過半徑Wo的光檢測區(qū)域(共焦區(qū)組織)時所需要的時間At根據(jù)以下的平均平方位移的關(guān)系式，
[0095](2ffo)2 = 6D.At
[0096]成為
[0097]At = (2ffo)2/6D,
[0098]因此，粒子因布朗運動而移動的速度(擴(kuò)散移動速度)Vdif大致為
[0099]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo。
[0100]因此，光檢測區(qū)域的位置的移動速度可以參照所述Vdif設(shè)定為與其相比充分快的值。例如在預(yù)想觀測對象粒子的擴(kuò)散系數(shù)是D = 2.0XlO^V/s左右的情況下，在設(shè)Wo為0.62 μ m左右時，Vdif為1.0X 10_3m/s，因此，可以將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為其10倍以上的15mm/s等。此外，在觀測對象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知的情況下，可以設(shè)定各種光檢測區(qū)域的位置的移動速度，反復(fù)執(zhí)行用于找到使光強(qiáng)度的變化的輪廓為預(yù)想的輪廓(典型地是與激勵光強(qiáng)度分布大致相同)的條件的預(yù)備實驗，來決定適合的光檢測區(qū)域的位置的移動速度。
[0101](3)光強(qiáng)度的分析
[0102]當(dāng)通過上述處理得到時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時，在計算機(jī)18中，通過依照存儲在存儲裝置中的程序的處理，執(zhí)行單個粒子的信號的檢測、單個粒子的計數(shù)、濃度計算等各種分析。
[0103](i)時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的平滑化以及利用吊鐘型函數(shù)擬合的單個粒子信號的逐個檢測
[0104]在按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在一個粒子通過光檢測區(qū)域時的軌跡如圖4的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下，與該粒子對應(yīng)的信號中的光強(qiáng)度的變化具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)決定的)光檢測區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布的大致吊鐘狀的輪廓。參照圖4的(C)最上部，特別地，在非發(fā)光粒子(α)通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化為向下凸，在發(fā)光粒子(β)通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化為向上凸。這樣，在單個粒子信號的逐個檢測的一個方式中，基本上，在從背景光起進(jìn)行計量的、低于適當(dāng)設(shè)定的閾值的光強(qiáng)度的下降所持續(xù)的時間寬度處于規(guī)定的范圍時，而且在從背景光起進(jìn)行計量的，超過適當(dāng)設(shè)定的閾值的光強(qiáng)度的增大所持續(xù)的時間寬度處于規(guī)定的范圍時，判斷為各個具有光強(qiáng)度的下降或增大的輪廓的信號對應(yīng)于一個粒子通過光檢測區(qū)域，可以進(jìn)行一個粒子的檢測。另外，在能夠?qū)⒐鈾z測區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為從背景光Ibg向下凸的或向上凸的高斯分布，即
[0105]I = Ibg-A-.exp(_2t2/a2)...(α )
[0106]I = Ibg+A+.exp(_2t2/a2)…(β)時，
[0107]在使式α或式β擬合有意義的光強(qiáng)度的下降或增大的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景光的波動的輪廓)而計算出的強(qiáng)度A-、A+以及寬度a處于規(guī)定的范圍內(nèi)時，判斷為該光強(qiáng)度的輪廓對應(yīng)于一個粒子通過光檢測區(qū)域，可以進(jìn)行一個粒子的檢測。(強(qiáng)度A-、A+以及寬度a處于規(guī)定的范圍外的信號被判斷為噪聲或異物的信號，在其后的分析等中可以忽略。)
[0108]作為從時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中一并檢測單個粒子的處理方法的一個例子，首先，對時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(圖4的(C)、最上部“檢測結(jié)果(未處理)”)進(jìn)行平滑(平滑化)處理(圖3-步驟110、圖4的(C)的中上部“平滑”)。作為觀測對象粒子的發(fā)光粒子及提供背景光的物質(zhì)等所發(fā)出的光是概率性地釋放的，并且，其光強(qiáng)度比較微弱，因此在產(chǎn)生細(xì)小的增加和減少時，所述光強(qiáng)度的細(xì)小的增加和減小(波動)使表示單個粒子的存在的信號的檢測精度變差。通過平滑處理能夠忽略所述數(shù)據(jù)上的細(xì)小的增加和減小。例如可以通過移動平均法(例如鄰近平均法、Savinsky-golay法的算法)、百分比濾波器法、FFT濾波器法進(jìn)行平滑處理?？梢愿鶕?jù)獲取光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時的光檢測區(qū)域的位置的移動速度(掃描速度)、BIN--ΜΕ，適當(dāng)?shù)卦O(shè)定執(zhí)行平滑處理時的參數(shù)、例如在移動平均法中進(jìn)行一次平均的數(shù)據(jù)個數(shù)、移動平均的次數(shù)等。例如，可以通過移動平均法等來進(jìn)行。
[0109]接著，在平滑處理后的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，為了檢測有意義的脈沖狀的信號(以下稱為“脈沖信號”)所存在的時間區(qū)域(脈沖存在區(qū)域)，對平滑處理后的光時序強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時間運算一次微分值(步驟120)。時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時間微分值如圖4的(C)的中下部“時間微分”所例示的那樣，在信號值的變化時刻值的變化變大，因此通過參照所述時間微分值，能夠有利于確定有意義的信號的起點和終點。
[0110]然后，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上，逐次檢測有意義的脈沖信號，判斷檢測出的信號是否為與單個粒子對應(yīng)的信號。具體地說，首先在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的按時間序列的時間微分值數(shù)據(jù)上，參照時間微分值逐次搜索并確定一個脈沖信號的起點和終點，確定脈沖存在區(qū)域(步驟130)。當(dāng)確定了一個脈沖存在區(qū)域時，針對該脈沖存在區(qū)域中的平滑后的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在向上凸的光強(qiáng)度變化的區(qū)域進(jìn)行向上凸的吊鐘型函數(shù)的擬合，在向下凸的光強(qiáng)度變化的區(qū)域進(jìn)行向下凸的吊鐘型函數(shù)的擬合(圖4的(C)的下部的“吊鐘型函數(shù)擬合”)，計算吊鐘型函數(shù)的脈沖的峰值的強(qiáng)度(相對于背景光的最大下降量)Ipeak、脈沖寬度(半峰全寬)Wpeak、擬合時的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。此外，擬合的吊鐘型函數(shù)典型地是高斯函數(shù)，但也可以是洛侖茲型函數(shù)。另外，在脈沖存在區(qū)域中的光強(qiáng)度變化的朝向以基于時間微分值的起點和終點處的增加和減少的順序進(jìn)行識別。然后，判斷計算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)是否處于針對一個單個粒子通過光檢測區(qū)域時檢測出的脈沖信號所描繪的吊鐘型的輪廓的參數(shù)而設(shè)想的范圍內(nèi)，即判斷脈沖的峰值強(qiáng)度(式α的A-或式β的Α+、背景光的下降量或增大量的最大值)、脈沖寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別處于規(guī)定范圍內(nèi)，例如判斷是否滿足下述的條件等(步驟150)，即
[0111]20 μ s〈脈沖寬度〈400 μ s
[0112]峰值強(qiáng)度>4.0 [pc/10 μ s]…(A)
[0113]相關(guān)系數(shù)>0.95。
[0114]這樣，將被判斷為計算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)處于針對與一個粒子對應(yīng)的信號設(shè)想的范圍內(nèi)的信號判斷為是與一個粒子對應(yīng)的信號。另一方面，計算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)不在設(shè)想的范圍內(nèi)的脈沖信號作為噪聲而被忽略。
[0115]可以在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的整個區(qū)域中反復(fù)執(zhí)行上述步驟130?150的處理中的脈沖信號的搜索和判斷(步驟160)。特別地，在本實施方式中，在進(jìn)行脈沖信號的搜索和判斷時，可以逐次識別信號是向上凸還是向下凸，來分別分開地對脈沖信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。
[0116](ii)基于時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率的單個粒子信號的逐個檢測
[0117]作為單個粒子信號的逐個檢測的其它方式，也可以計算在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的光強(qiáng)度變化(光子數(shù)變化)的圖案的產(chǎn)生概率，根據(jù)所述產(chǎn)生概率檢測單個粒子的信號的存在(參照日本特愿2012-32421)。參照圖5的(A)，一般地，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是光子計數(shù)數(shù)據(jù)的情況下，光強(qiáng)度值為每BIN TIME的檢測光子數(shù)。因而，如圖示那樣，光強(qiáng)度值在時間軸方向上離散地分布。在這種情況下，亮度大的粒子信號受噪聲信號的影響少，具有大致吊鐘狀的輪廓(左圖)，但是亮度小的粒子信號的強(qiáng)度值與噪聲信號大致相同，進(jìn)一步由于噪聲信號疊加(中圖)而難以抽出大致吊鐘狀的輪廓，難以與沒有粒子的僅存在噪聲信號的時間區(qū)域(右圖)進(jìn)行區(qū)分。然而，在存在亮度小的粒子信號的時間區(qū)域和僅存在噪聲信號的時間區(qū)域中，檢測出光子的事件(光子數(shù)為I以上的事件)的產(chǎn)生頻率和圖案存在差異。在非發(fā)光粒子的信號與背景光的波動之間也觀察到同樣的現(xiàn)象。因此，對于時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的每個規(guī)定的時間寬度的光強(qiáng)度值的時間變化(光子數(shù)列)，計算在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下產(chǎn)生上述光強(qiáng)度值的時間變化的概率(產(chǎn)生概率(存在粒子時))以及在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在粒子的情況下產(chǎn)生上述光強(qiáng)度值的時間變化的概率(產(chǎn)生概率(不存在粒子時))，將提供高的產(chǎn)生概率的狀態(tài)估計為是實際的狀態(tài)。
[0118]更具體地說，首先，參照圖5的(B)，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上設(shè)定任意的時間寬度的區(qū)間(以下稱為解析窗。)。該解析窗具有按每個單位時間(通?？梢允荁IN TIME。)ti(i=1，2，…以下相同)檢測出的光子數(shù)Ci。另外，考慮在各單位時間內(nèi)產(chǎn)生的光子檢測事件的數(shù)量依照具有該單位時間內(nèi)的預(yù)期值的泊松分布，因此通過下式給出在任意的單位時間ti中成為檢測光子數(shù)Ci的概率(單位時間產(chǎn)生概率)。
[0119][數(shù)I]
Fiu
[0120]Pi = -~cxp(-Ei)…(I)
Ci!
[0121]在此，Ei是單位時間ti內(nèi)的光子數(shù)的預(yù)期值。而且，在解析窗中包含n+1個單位時間時，通過下式給出解析窗內(nèi)產(chǎn)生檢測光子數(shù)列Ci的概率P (產(chǎn)生概率)。
[0122][數(shù)2]
[0123]P = ]~f Pi.■'」1
l-u
[0124]上述的各單位時間ti內(nèi)的光子檢測事件的產(chǎn)生數(shù)的預(yù)期值Ei根據(jù)在光測量中的與解析窗對應(yīng)的時間區(qū)域有無光檢測區(qū)域內(nèi)的粒子來確定。這樣，在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在粒子的情況下，光子檢測事件總是隨機(jī)地產(chǎn)生，因此各測量單位時間ti內(nèi)的預(yù)期值Eni可以設(shè)定為
[0125]Eni = Bg...(3)
[0126]在此，Bg是背景光的時間平均值。因而，將式(3)的值代入到式(I)，來按時間序列估算各測量單位時間ti內(nèi)的單位時間產(chǎn)生概率Pni，再通過式(2)計算在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)不存在粒子的狀態(tài)的情況下產(chǎn)生實際的檢測光子數(shù)列的概率Pn。
[0127]另一方面，在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下，由于光檢測區(qū)域CV的位置正在移動，因此粒子如圖4的(B)示意性地描繪的那樣通過光檢測區(qū)域CV內(nèi)。在所述的過程中，從光檢測區(qū)域中的粒子釋放并被檢測出的光的強(qiáng)度值或因在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子而減少的背景光的減少量如圖5的(C)所示那樣，粒子的位置距光檢測區(qū)域的大致中心越遠(yuǎn)則越低。因而，在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子時的各單位時間ti內(nèi)的預(yù)期值Epi也表現(xiàn)為以時間為變量的吊鐘狀的函數(shù)。在此，當(dāng)假設(shè)通過高斯函數(shù)對該吊鐘狀的函數(shù)進(jìn)行近似時，通過下式給出預(yù)期值Epi。
[0128][數(shù)3]
?.? ( (11 — Ic ) _/ Λ \
[0129]Epi = Q.exp--— +Bg…(4)
I 2 W-
[0130]在此，高斯函數(shù)被假定為在解析窗內(nèi)的任意的時間tc (例如解析窗的中心)處具有峰值強(qiáng)度Q。另外，式(4)的高斯函數(shù)的半峰全寬等于移動速度為V的光檢測區(qū)域通過半峰全寬d的時間d/v，該半峰全寬d是如圖5的(C)所例示的那樣從光檢測區(qū)域中的粒子釋放并檢測出的光的強(qiáng)度值或因在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子而減少的背景光的減少量的半徑r方向的分布的半峰全寬，根據(jù)該條件，通過下式給出W。
[0131][數(shù)4]
_2] W = ( °
[0133]此外，圖5的(C)的半峰全寬d能夠由光學(xué)系統(tǒng)決定。
[0134]在觀測對象粒子是發(fā)光粒子的情況下，當(dāng)假定為解析窗內(nèi)的光子數(shù)的總計與式
(4)的預(yù)期值的總計一致時，通過下式給出式(4)中的峰值強(qiáng)度Q。
[0135][數(shù)5]
「 ? t (O-Bg)
[0136]q 1-ο__…C a )
Q- { }
[0137]另外，在觀測對象粒子是非發(fā)光粒子的情況下，依照式(4)設(shè)定光子數(shù)的減少量的絕對值的預(yù)期值，通過下式給出峰值強(qiáng)度Q。
[0138][數(shù)6]
η
T(Bg-Ci)
[0139]q _ ι=υ__...( 7 I
WyflTl
[0140]這樣，將式(4)的值代入到式(I)，按時間序列估算各測量單位時間ti內(nèi)的單位時間產(chǎn)生概率Ppi，再通過式(2)計算假定在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的狀態(tài)的情況下產(chǎn)生實際的檢測光子數(shù)列的概率Pp。而且，在假定存在粒子的狀態(tài)的情況下的檢測光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pp超過假定不存在粒子的狀態(tài)的情況下的檢測光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pn規(guī)定的程度時，判斷為在該解析窗中存在粒子的信號。
[0141]此外，在實施方式中，關(guān)于在解析窗內(nèi)是否存在粒子的信號的判斷，可以計算產(chǎn)生概率Pp與產(chǎn)生概率Pn的比值比0R，
[0142]OR = Pp (1-Pn) / (1-Pp) Pn...(8)
[0143]在其大小超過規(guī)定值時，判斷為在解析窗內(nèi)存在粒子的信號。
[0144]在上述的粒子的信號的檢測處理過程中，解析窗優(yōu)選設(shè)定為單個粒子通過光檢測區(qū)域內(nèi)所需要的時間以上。如果設(shè)為半徑r的光檢測區(qū)域以速度V移動，則將解析窗的時間寬度設(shè)定得比
[0145]2r/v...(9)
[0146]長。另外，優(yōu)選的是，可以在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上針對每個單位時間依次設(shè)定解析窗。根據(jù)所述設(shè)定，能夠沿著時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)計算產(chǎn)生概率Pp、產(chǎn)生概率Pn和/或比值比0R。然而，在這種情況下，運算量變多，因此也可以針對每多個單位時間設(shè)定解析窗。并且，也可以在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上以解析窗的時間寬度進(jìn)行分割來設(shè)定解析窗。在這種情況下，解析窗不會被相互重復(fù)地設(shè)定。
[0147]在針對每個單位時間設(shè)定解析窗的情況下，在存在一個粒子信號時，在連續(xù)的解析窗中持續(xù)作出存在粒子的信號的判斷。即，一個粒子的信號對應(yīng)于持續(xù)作出存在粒子的信號的判斷的一個區(qū)間。因而，通過對持續(xù)作出存在粒子的信號的判斷的區(qū)間數(shù)進(jìn)行計數(shù)，能夠進(jìn)行粒子的信號的計數(shù)。另外，在上述的粒子的信號的檢測處理過程中，BIN --ΜΕ被設(shè)定為單個粒子通過光檢測區(qū)域內(nèi)所需要的時間(式9)以下。這是為了通過多個BIN TIME捕捉單個粒子通過時的信號而能夠檢測單個粒子通過期間的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案。(如果BIN TIME比式9的時間長，則無法捕捉單個粒子通過期間的光強(qiáng)度值的時間變化的圖案。)
[0148]圖6是以流程圖的方式表示利用上述產(chǎn)生檢測光子數(shù)列的概率Pp、Pn檢測單個粒子信號的處理。參照該圖，首先，在生成時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)之后(步驟100)，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上進(jìn)行背景光的強(qiáng)度值的計算(步驟310)。背景光的強(qiáng)度值可以是時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上不存在粒子的信號的區(qū)域的強(qiáng)度值(光子數(shù))的平均值。這樣，在背景光的強(qiáng)度值計算的一個方法中，可以采用所獲得的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度值中的、從高值起去除規(guī)定比例(例如20% )的數(shù)據(jù)和從低值起去除規(guī)定比例(例如20% )的數(shù)據(jù)后的總強(qiáng)度值的平均值作為背景光的強(qiáng)度值。這是因為考慮為從光強(qiáng)度值的高值起的規(guī)定比例的數(shù)據(jù)是發(fā)光粒子的信號，從光強(qiáng)度值的低值起的規(guī)定比例的數(shù)據(jù)是非發(fā)光粒子的信號。此外，也可以采用利用不包含觀測對象的粒子的樣本溶液獲得的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度值的平均作為背景光的強(qiáng)度值。
[0149]接著，在本實施方式的處理過程中，在時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上執(zhí)行解析窗的設(shè)定(步驟320)。如已經(jīng)提及的那樣，一個解析窗的長度可以根據(jù)光檢測區(qū)域的大小和移動速度來決定(參照式(9))。另外，優(yōu)選的是，可以按時間序列針對每個BIN TIME設(shè)定解析窗。然而，為了減少運算量，也可以針對每多個BIN --ΜΕ進(jìn)行設(shè)定，或者也可以以解析窗相互不重疊的方式進(jìn)行設(shè)定。
[0150]這樣，當(dāng)進(jìn)行了解析窗的設(shè)定時，依照上述說明過的原理，分別計算假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)沒有粒子的情況下的解析窗內(nèi)的光強(qiáng)度值列或光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pn(步驟130)、假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下的解析窗內(nèi)的光強(qiáng)度值列或光子數(shù)列的產(chǎn)生概率Pp (步驟140)。關(guān)于該點，特別地，在本發(fā)明中，在一個時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上可能存在發(fā)光粒子的信號和非發(fā)光粒子的信號。因而，關(guān)于假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp，分別計算假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在發(fā)光粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp+以及假定為在檢測區(qū)域內(nèi)存在非發(fā)光粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp_(Pp+是使用式(6)計算出的概率，Pp-是使用式(7)計算出的概率。)然后，將計算出的產(chǎn)生概率Pp+、Pp-、Pn相互比較，判斷在解析窗內(nèi)是否存在發(fā)光粒子或非發(fā)光粒子(步驟150)。在所述判斷中，計算產(chǎn)生概率Pp+或Pp-與產(chǎn)生概率Pn的比值比(參照式(8))，在發(fā)光粒子的比值比為規(guī)定值以上時，可以判斷為存在發(fā)光粒子，在非發(fā)光粒子的比值比為規(guī)定值以上時，可以判斷為存在非發(fā)光粒子。此為，在假定為在光檢測區(qū)域內(nèi)存在粒子的情況下的產(chǎn)生概率Pp+、Pp-的計算中，可以假定為強(qiáng)度值的預(yù)期值在解析窗的中心存在強(qiáng)度的峰值。實際上，粒子的信號的峰值幾乎不存在于解析窗的中心，實際的粒子的信號的峰值的位置距解析窗的中心越遠(yuǎn)，產(chǎn)生概率Pp+、Pp-的值越低，但是相比于不存在實際的粒子的信號時的產(chǎn)生概率Pn的值而言是高的值。
[0151]上述步驟130?150的處理中的解析窗內(nèi)的產(chǎn)生概率Pp、Pn的計算以及粒子信號的檢測可以在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上設(shè)定的所有解析窗中執(zhí)行(步驟160)。
[0152](iii)粒子濃度的確定
[0153]并且，也可以對檢測出的單個粒子的信號的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)來確定粒子的個數(shù)(粒子的計數(shù))。另外，如果通過任意的方法能夠確定光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，則能夠根據(jù)其體積值和粒子的個數(shù)確定樣本溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度(步驟170)。
[0154]光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積可以根據(jù)激勵光或檢測光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)在理論上進(jìn)行估算，但是也可以通過實驗，例如根據(jù)針對粒子濃度已知的溶液(對照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測量條件相同的條件進(jìn)行上述所說明的光強(qiáng)度的測量、粒子的檢測以及計數(shù)所檢測出的粒子的個數(shù)和對照溶液的粒子的濃度來確定。具體地說，例如當(dāng)針對粒子濃度C的對照溶液，將對照溶液的單個粒子的檢測數(shù)設(shè)為N時，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積Vt通過下式給出。
[0155]Vt = N/C...(10)
[0156]另外，例如可以準(zhǔn)備單個粒子的濃度不同的多個溶液作為對照溶液，針對多個溶液分別執(zhí)行測量，采用計算出的Vt的平均值作為光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積vt。而且，當(dāng)給出Vt時，單個粒子的計數(shù)結(jié)果為η的樣本溶液的粒子濃度C通過下式給出。
[0157]c = n/Vt...(11)
[0158]此外，可以不依據(jù)上述的方法而通過任意的方法、例如通過利用FCS、FIDA等給出光檢測區(qū)域的體積、光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積。另外，在本實施方式的裝置中，可以針對所設(shè)想的光檢測區(qū)域的移動圖案，將針對各種標(biāo)準(zhǔn)的粒子的濃度C與粒子的個數(shù)N之間的關(guān)系(式(10))的信息預(yù)先存儲到計算機(jī)18的存儲裝置中，在裝置的使用者實施單個粒子檢測時能夠適當(dāng)?shù)乩盟鎯Φ年P(guān)系的信息。
[0159]這樣，在通過光檢測區(qū)域在樣本溶液中進(jìn)行掃描來逐個檢測粒子的反轉(zhuǎn)型掃描分子計數(shù)法中，通過上述的處理過程，能夠進(jìn)行樣本溶液中的粒子的計數(shù)、濃度的確定等。特別地，在本發(fā)明的情況下，分別進(jìn)行發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的計數(shù)，確定各自的粒子濃度，由此能夠確定每個種類的粒子的濃度。
[0160](4)檢測固定信號數(shù)的單個粒子檢測處理
[0161]在上述的單個粒子檢測處理中，在某設(shè)定的時間內(nèi)執(zhí)行光測量之后，在所獲得的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上檢測單個粒子的信號。在這種情況下，在樣本溶液中的粒子濃度未知時，在某固定的測量時間內(nèi)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量的情況下，如果粒子的濃度低，則測量時間被設(shè)定得足夠長。另一方面，在樣本溶液中的粒子的濃度高的情況下，超過以可允許的或要滿足的精度確定濃度等特性所需要的時間地持續(xù)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量。另外，在樣本溶液中的粒子濃度低于實驗者所設(shè)想的濃度而所設(shè)定的測量時間不足的情況下，導(dǎo)致結(jié)果的誤差變大。因此，作為單個粒子檢測處理的另一方式，可以重復(fù)進(jìn)行一邊移動光檢測區(qū)域一邊進(jìn)行的光強(qiáng)度的測量和單個粒子的信號的檢測直到信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)為止，測量信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間，根據(jù)所述單個粒子的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間來確定粒子濃度。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在樣本溶液中的粒子濃度高的情況下，光強(qiáng)度的測量所需要的時間縮短，在樣本溶液中的粒子濃度低的情況下，能夠持續(xù)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量直到獲得達(dá)成結(jié)果(即，粒子濃度)所要求的精度為止。而且，通過將單個粒子的信號的個數(shù)要達(dá)到的預(yù)先決定的個數(shù)設(shè)定為達(dá)成結(jié)果所要求的精度的粒子數(shù)，將達(dá)成結(jié)果所要求的精度的粒子數(shù)反映到單個粒子的信號的個數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間，因此可以期待基于該時間確定的粒子的濃度值具有可允許的或要滿足的精度。此外，在所述結(jié)構(gòu)中也同樣，在本發(fā)明的情況下，針對多個檢測波長中的每個檢測波長執(zhí)行從光測量至粒子濃度的估算的處理。
[0162]⑴基本原理
[0163]粒子的濃度值與信號數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)所需要的時間被賦予如下的關(guān)系。即，在某粒子濃度C的樣本溶液中，在時間τ內(nèi)使光檢測區(qū)域以掃描速度U移動的情況下，當(dāng)將光檢測區(qū)域的截面積設(shè)為S時，檢測的粒子信號的個數(shù)X為
[0164]X = CSutNa...(12)。
[0165]在此，Na是阿伏伽德羅數(shù)。因而，當(dāng)設(shè)信號數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)XE需要時間T時，粒子濃度C作為時間T的函數(shù)而通過下式給出。
[0166]C = XE/ (STuNa)...(13)
[0167]此外，每單位時間的粒子的檢測速度V根據(jù)信號數(shù)達(dá)到預(yù)先決定的個數(shù)XE所需要的時間T和粒子檢測數(shù)XE，通過下式給出，
[0168]V = ΧΕ/Τ …(14)
[0169]因此，粒子濃度C表示為
[0170]C = V/ (SuNa)...(15)。
[0171]在該式(15)中，粒子濃度C與檢測速度V成線性比例，容易獲知粒子濃度C與檢測速度V的對應(yīng)關(guān)系，因此在實際的實驗中，也可以使用檢測速度V來確定粒子濃度C。
[0172](?)處理操作過程
[0173]例如可以通過圖7的流程圖所示的處理過程來執(zhí)行檢測固定信號數(shù)的單個粒子檢測處理。在該圖的例子中，如果清楚地進(jìn)行描述，則光檢測區(qū)域的位置的移動、來自光檢測區(qū)域的光的檢測、單個粒子的信號的檢測以及所檢測出的粒子信號的計數(shù)的一系列處理按解析時間間隔t (規(guī)定的時間間隔)反復(fù)執(zhí)行直到所檢測出的粒子數(shù)X達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE(單個粒子數(shù)要達(dá)到的預(yù)先決定的個數(shù))為止。此外，應(yīng)該理解為通過計算機(jī)18的處理動作實現(xiàn)下面記述的一系列的處理和結(jié)構(gòu)。
[0174](a)初始設(shè)定
[0175]參照圖7，在操作處理中，具體地說，首先，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺上后，當(dāng)使用者向計算機(jī)18輸入開始光強(qiáng)度的測量和粒子的檢測、計數(shù)的處理的指示時，作為初始設(shè)定，計算機(jī)18進(jìn)行結(jié)束粒子數(shù)XE的設(shè)定(步驟10)和解析時間間隔t的設(shè)定(步驟20)?？梢杂墒褂谜呷我獾卦O(shè)定結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時間間隔t。能夠參考使用粒子濃度已知的溶液通過預(yù)備實驗得到的結(jié)果來適當(dāng)決定結(jié)束粒子數(shù)XE以能夠達(dá)成粒子濃度的結(jié)果值所要求的精度。作為解析時間間隔t，可以考慮裝置I的處理速度等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定與從處理開始后起至粒子數(shù)(X)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)(XE)為止的時間相比充分短的任意的時間間隔。另外，結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時間間隔t也可以分別為參考使用粒子濃度已知的溶液通過預(yù)備實驗得到的結(jié)果而預(yù)先決定的值，將其存儲在裝置I中，自動地或者通過使用者的選擇來使用所述存儲值。
[0176](b)粒子數(shù)的檢測
[0177]當(dāng)如上述那樣設(shè)定結(jié)束粒子數(shù)XE和解析時間間隔t時，如下述那樣按解析時間間隔t，反復(fù)執(zhí)行在整個解析時間間隔t內(nèi)利用掃描分子計數(shù)法進(jìn)行的光強(qiáng)度的測量處理及基于所測量出的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的粒子信號的檢測和粒子數(shù)X的檢測(步驟30)以及對在步驟30中檢測出的粒子數(shù)X進(jìn)行累加來估算粒子的總數(shù)X(tn)的處理(步驟40)，直到粒子的總數(shù)X(tn)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE為止(步驟50)。此外，可以在反復(fù)執(zhí)行步驟30?50的處理之前存儲一系列處理的開始時間Ts (步驟25)。
[0178]步驟30中的光檢測、粒子數(shù)檢測的處理可以與圖3或圖6所示的處理相同。如果清楚地進(jìn)行描述，則一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(樣本溶液內(nèi)的掃描)，一邊在整個解析時間間隔t內(nèi)進(jìn)行光強(qiáng)度的測量，然后，計算機(jī)18通過依照存儲在存儲裝置中的程序的處理，來執(zhí)行所獲得的解析時間間隔t的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的表示單個粒子的存在的信號的檢測以及檢測數(shù)的計數(shù)。
[0179]這樣，當(dāng)對整個解析時間間隔t內(nèi)的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的粒子數(shù)X進(jìn)行了檢測時，通過下式計算單個粒子的檢測總數(shù)X (tn)(圖7-步驟40)。
[0180]X(tn) = X (V1) +X...(16)
[0181]此外，X(V1)為直到前一次的解析時間間隔t為止檢測出的粒子的檢測總數(shù)，其初始值為O。而且，按解析時間間隔t反復(fù)進(jìn)行步驟30?40直到單個粒子的檢測總數(shù)X (tn)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)XE為止、SP
[0182]X(tn)彡 XE...(17)
[0183]成立為止(步驟50)。而且，當(dāng)在反復(fù)進(jìn)行步驟30?50的期間式(17)成立時，結(jié)束樣本溶液的光強(qiáng)度的測量和粒子的檢測、計數(shù)的處理。當(dāng)步驟30?50的反復(fù)處理結(jié)束時，可以存儲結(jié)束時間TE (步驟60)。
[0184](c)粒子數(shù)和測量結(jié)束時間的顯示
[0185]另外，在按解析時間間隔t反復(fù)執(zhí)行步驟30?50的期間(式(17)成立之前)，可以在計算機(jī)18的監(jiān)視器上等顯示器上顯示粒子的檢測總數(shù)X(tn)和/或測量結(jié)束時間TE或者測量剩余時間Tr。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，使用者通過查看這些顯示能夠預(yù)測正在執(zhí)行的測量何時結(jié)束，在這一點上是有利的。
[0186]在執(zhí)行如上所述的顯示的情況下，在圖7的步驟50的判斷中式(17)沒有成立的情況下，執(zhí)行圖中虛線所示的各處理。具體地說，首先，在顯示器上顯示在步驟40中估算出的最新的粒子的檢測總數(shù)X(tn)(步驟52)。此外，在已經(jīng)反復(fù)執(zhí)行了步驟30?50的情況下，更新到目前為止的粒子的檢測總數(shù)X(tn)的值。接著，為了計算測量結(jié)束時間TE或測量剩余時間Tr而計算步驟30?50的處理開始后的粒子的檢測速度V(步驟54)。當(dāng)前的粒子的檢測速度V可以通過下式給出。
[0187]V = X(tn)/ (Tp-Ts)...(18)
[0188]在此，Tp是當(dāng)前的時刻。這樣，使用粒子的檢測速度V，通過下式來估計測量剩余時間Tr (直到步驟30?50的處理結(jié)束為止的時間)，
[0189]Tr= (XE-X (tn)) /v...(19)
[0190]另外，通過下式估計測量結(jié)束時間TE (步驟30?50的處理結(jié)束的時間)(步驟56)。
[0191]TE = Tp+Tr...(20)
[0192]然后，將所估計出的測量結(jié)束時間TE或測量剩余時間Tr顯示在顯示器上(步驟58)。此外，在已經(jīng)反復(fù)執(zhí)行了步驟30?50的情況下，更新已經(jīng)顯示的值。另外，在X(tn)=0時，式(18)或(19)運算不出，可以顯示為Tr和TE不明。
[0193]如已經(jīng)記述的那樣，按解析時間間隔t反復(fù)進(jìn)行上述圖7的步驟30?50的處理。關(guān)于該點，可以從測量開始至結(jié)束為止在圖3或圖6的步驟100以外的信號處理步驟的執(zhí)行過程中也連續(xù)地執(zhí)行步驟100的光強(qiáng)度的測量。即，當(dāng)在光檢測、粒子數(shù)檢測的處理中一個循環(huán)的整個解析時間間隔t內(nèi)的光強(qiáng)度的測量完成時，直接連續(xù)地執(zhí)行下一個循環(huán)的整個解析時間間隔t內(nèi)的光強(qiáng)度的測量，同時在計算機(jī)18中基于在已完成的循環(huán)的整個解析時間間隔t內(nèi)獲取到的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測粒子的信號、執(zhí)行計數(shù)處理。由此，實時地進(jìn)行粒子的檢測、計數(shù)。
[0194](d)濃度計算等分析
[0195]這樣，當(dāng)粒子數(shù)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)時，可以使用粒子數(shù)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)為止的時間T( = TE-Ts)或者根據(jù)所檢測出的粒子的信號而獲得的其它信息，來執(zhí)行濃度計算等分析(步驟70)。如已經(jīng)記述的那樣，利用式(12)，根據(jù)達(dá)到結(jié)束粒子數(shù)為止的時間T和結(jié)束粒子數(shù)XE來計算粒子的檢測速度V，根據(jù)粒子的檢測速度V，利用式(13)的關(guān)系來確定粒子濃度。
[0196]此外，式(12)?(15)中的光檢測區(qū)域的通過區(qū)域的截面積S可以根據(jù)激勵光或檢測光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)在理論上進(jìn)行估算，但是也可以根據(jù)通過實驗、例如針對粒子濃度已知的溶液(對照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測量條件相同的條件進(jìn)行上述所說明的光強(qiáng)度的測量、粒子的檢測、計數(shù)而檢測出的粒子的個數(shù)和對照溶液的單個粒子的濃度來決定。具體地說，例如當(dāng)針對粒子濃度C的對照溶液，將以移動速度UO在某個時間τ O中執(zhí)行的光強(qiáng)度的測量中的粒子的檢測數(shù)設(shè)為N時，光檢測區(qū)域的通過區(qū)域的截面積S通過下式給出。
[0197]S = N/ (C.Na.U0.το)...(21)
[0198]另外，可以準(zhǔn)備粒子的濃度不同的多個溶液作為對照溶液，針對多個溶液分別執(zhí)行測量，采用計算出的S的平均值作為光檢測區(qū)域的截面積S。
[0199]為了驗證上述所說明的本發(fā)明的有效性而進(jìn)行了如下的實驗。此外，下面的實施例例示本發(fā)明的有效性，應(yīng)該理解不是限定本發(fā)明的范圍。
[0200]實施例1
[0201]驗證了在通過本發(fā)明的掃描分子計數(shù)法的光測量獲得的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中能夠識別并檢測表示發(fā)光粒子的存在的信號以及表示非發(fā)光粒子的存在的信號。
[0202]作為樣本溶液，調(diào)制出使2fM的非熒光微珠(CP-40-10:spherotec(D:4000nm))作為非發(fā)光粒子分散在包含3.25nM的熒光色素ATT0488的20%聚乙二醇溶液中得到的溶液、使2fM的熒光微珠(FP-4052-2:spherotec(D:4000nm))作為發(fā)光粒子分散在上述聚乙二醇溶液中得到的溶液以及使IfM的非熒光微珠和IfM的熒光微珠分散在上述聚乙二醇溶液中得到的溶液。在光的測量中，作為光分析裝置，利用具備共焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測量裝置MF20 (奧林巴斯株式會社)，依照在上述的“(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測量”中所說明的方式，針對上述各個樣本溶液獲取了時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計數(shù)數(shù)據(jù))。此時，激勵光使用50 μ W的488nm的激光，利用帶通光學(xué)濾波器535BP測量510nm-560nm的波長頻帶的光，生成了時序光子計數(shù)數(shù)據(jù)。此外，共焦區(qū)組織的直徑設(shè)定為大約4μπι。樣本溶液中的光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)為9000rpm(67.5mm/秒)JfBINTIME設(shè)為50 μ s，關(guān)于各溶液各進(jìn)行了三次100秒的測量。
[0203]以與圖6關(guān)聯(lián)說明的基于光強(qiáng)度變化的產(chǎn)生概率的單個粒子信號的逐個檢測的方式進(jìn)行了單個粒子信號的檢測。圖8的(A)是獲得的時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的一部分，圖8的(B)是假定為存在非發(fā)光粒子的情況下的產(chǎn)生概率的比值比，圖8的(C)表示假定為存在發(fā)光粒子的情況下的比值比。如從圖中理解的那樣，在(A)中，觀察到認(rèn)為是非發(fā)光粒子(α)通過的光強(qiáng)度的下降以及認(rèn)為是發(fā)光粒子(β)通過的光強(qiáng)度的增加，與這些對應(yīng)地，各自的比值比增大。當(dāng)觀察時序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)整體時，觀察到具有背景光的-87%?-2%的峰值強(qiáng)度的非發(fā)光粒子的信號和具有背景光的8%?720%的峰值強(qiáng)度的發(fā)光粒子的信號。
[0204]圖9示出對于不含粒子的溶液(0:0)、僅含非發(fā)光粒子的溶液(2:0)、僅含發(fā)光粒子的溶液(0:2)、包含發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的溶液(1:1)通過上述的處理檢測出的發(fā)光粒子的信號數(shù)(凸)和非發(fā)光粒子的信號數(shù)(凹)各自的平均值(直方圖)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差條)。如從圖中理解的那樣，分別檢測出與樣本溶液中包含的粒子的比對應(yīng)的個數(shù)的發(fā)光粒子的信號和非發(fā)光粒子的信號。該情形表示，根據(jù)本發(fā)明的光分析技術(shù)、即在發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子包含在同一樣本溶液中的情況下在適當(dāng)?shù)谋尘肮獯嬖谙聢?zhí)行掃描分子計數(shù)法，能夠分別識別并檢測出樣本溶液中的發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子。另外，示出了還能夠估計各粒子的含有量。
[0205]這樣，如從上述實施例的結(jié)果理解的那樣，根據(jù)依照本發(fā)明的教導(dǎo)的掃描分子計數(shù)法，能夠按粒子的種類進(jìn)行分散于樣本溶液中的發(fā)光粒子和非發(fā)光粒子的檢測以及與其濃度有關(guān)的信息的獲取。特別地，本發(fā)明逐個檢測單個粒子的信號，因此即使樣本溶液中的粒子濃度低于FCS等光分析技術(shù)所要求的濃度區(qū)域，也能夠檢測粒子，所述特征在對醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下是有利的。
【權(quán)利要求】
1.一種單個粒子檢測裝置，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的單個粒子，該單個粒子檢測裝置的特征在于，包括: 光檢測區(qū)域移動部，其使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動； 光檢測部，其檢測來自上述光檢測區(qū)域的光；以及 信號處理部，其生成一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動一邊由上述光檢測部檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的光的按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在上述按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測表示各個上述單個粒子的存在的信號， 其中，由上述光檢測部檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的光包含實質(zhì)固定的背景光，上述單個粒子包含具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個粒子和具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個粒子，上述第一單個粒子的上述信號為在上述第一單個粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、由上述光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的增大，上述第二單個粒子的上述信號為在上述第二單個粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、由上述光檢測部檢測出的光強(qiáng)度的下降。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個粒子檢測裝置，其特征在于， 上述信號處理部對逐個檢測出的表示上述第一單個粒子和上述第二單個粒子的存在的信號的個數(shù)分別進(jìn)行計數(shù)，來對在上述光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測出的上述第一單個粒子和上述第二單個粒子的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單個粒子檢測裝置，其特征在于， 從每單位體積的上述第一單個粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，從每單位體積的上述第二單個粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中的任一項所述的單個粒子檢測裝置，其特征在于， 上述背景光是由在上述樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光，或是照明光。
5.一種單個粒子檢測方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的單個粒子，該單個粒子檢測方法的特征在于，包括以下過程: 使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動； 一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測來自上述光檢測區(qū)域的光并生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 在上述按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測表示各個上述單個粒子的存在的信號， 其中，檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的上述光包含實質(zhì)固定的背景光，上述單個粒子包含具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個粒子和具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個粒子，上述第一單個粒子的上述信號為在上述第一單個粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，上述第二單個粒子的上述信號為在上述第二單個粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單個粒子檢測方法，其特征在于， 還包括以下過程:對逐個檢測出的表示上述第一單個粒子和上述第二單個粒子的存在的信號的個數(shù)分別進(jìn)行計數(shù)，來對在上述光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測出的上述第一單個粒子和上述第二單個粒子的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的單個粒子檢測方法，其特征在于， 從每單位體積的上述第一單個粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，從每單位體積的上述第二單個粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。
8.根據(jù)權(quán)利要求5?7中的任一項所述的單個粒子檢測方法，其特征在于， 上述背景光是由在上述樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光，或是照明光。
9.一種單個粒子檢測用計算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測在樣本溶液中分散且隨機(jī)運動的單個粒子，該單個粒子檢測用計算機(jī)程序使計算機(jī)執(zhí)行以下步驟: 使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動； 一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測來自上述光檢測區(qū)域的光并生成按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 在上述按時間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個檢測表示各個上述單個粒子的存在的信號； 其中，檢測出的來自上述光檢測區(qū)域的上述光包含實質(zhì)固定的背景光，上述單個粒子包含具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度高的發(fā)光強(qiáng)度的第一單個粒子和具有比上述背景光的發(fā)光強(qiáng)度低的發(fā)光強(qiáng)度的第二單個粒子，上述第一單個粒子的上述信號為在上述第一單個粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的增大，上述第二單個粒子的上述信號為在上述第二單個粒子進(jìn)入到上述光檢測區(qū)域內(nèi)時產(chǎn)生的、被檢測出的光強(qiáng)度的下降。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的單個粒子檢測用計算機(jī)程序，其特征在于， 還包含以下步驟:對逐個檢測出的表示上述第一單個粒子和上述第二單個粒子的存在的信號的個數(shù)分別進(jìn)行計數(shù)，來對在上述光檢測區(qū)域的位置移動的過程中檢測出的上述第一單個粒子和上述第二單個粒子的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的單個粒子檢測用計算機(jī)程序，其特征在于， 從每單位體積的上述第一單個粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度超過從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度，從每單位體積的上述第二單個粒子釋放的發(fā)光強(qiáng)度低于從上述每單位體積的上述光檢測區(qū)域內(nèi)發(fā)出的背景光強(qiáng)度。
12.根據(jù)權(quán)利要求9?11中的任一項所述的單個粒子檢測用計算機(jī)程序，其特征在于， 上述背景光是由在上述樣本溶液內(nèi)分散的物質(zhì)產(chǎn)生的熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或散射光，或是照明光。
【文檔編號】G01N21/64GK104246479SQ201380020726
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日
【發(fā)明者】葉梨拓哉 申請人:奧林巴斯株式會社