硫酸對甲酚作為健康性老化的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】使用基于NMR/MS的代謝組學(xué)和靶向脂質(zhì)組學(xué)方法，本發(fā)明人在包括百歲老人、較年長者和年輕成年人的群組中研究了老化和長壽的代謝表型。本發(fā)明人鑒定了用于降低的老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，提出使用對甲酚硫酸作為生物標(biāo)志物診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的體外方法。
【專利說明】硫酸對甲齡作為健康性老化的生物標(biāo)志物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一般涉及健康生活方式和老化相關(guān)慢性病癥的預(yù)防。特別地，本發(fā)明涉及 生物標(biāo)志物及其在檢測生活方式的改善中的應(yīng)用。由此，本發(fā)明提供例如硫酸對甲酷作為 生物標(biāo)志物，還提供使用生物標(biāo)志物硫酸對甲酷診斷生活方式的方法，其中所述生活方式 允許延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥。

【背景技術(shù)】
[0002] 老化被定義為：時間依賴性的功能性能力（化nctional capacity)和壓力抵抗 (stress resistance)的下降，與增加的發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。此外，人類的老化表型具有 非常大的異質(zhì)性，可W描述為因各種各樣環(huán)境的、隨機(jī)的和遺傳-后生的變量的相互作用 引起的復(fù)雜鑲嵌（complex mosaic)。幾十年的老化研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與老化過程相關(guān)的數(shù)百個 基因和許多生物學(xué)過程，但是同時，許多基本問題仍未回答、或是激烈爭議的對象。
[0003] 該些問題常常不能通過檢查單個基因或單個途徑來解決，但是可W在系統(tǒng)水平得 到較好的解決，體現(xiàn)了老化是一個復(fù)雜的多因素過程。此外，老化可W伴有慢性的低度炎性 狀態(tài)，該狀態(tài)因促炎和抗炎過程之間的失衡引起，是一種致病性狀況，已經(jīng)被掲示在主要的 年齡相關(guān)慢性疾病如動脈粥樣硬化、2型糖尿病和神經(jīng)變性的發(fā)病中具有關(guān)鍵性。
[0004] 在此看法中，后天獲得的健康老化和長壽可能不僅反映了較低的炎性反應(yīng)累積傾 向，也反映了有效的抗炎網(wǎng)絡(luò)發(fā)育。此外，越來越多地意識到腸道微生物群（microbiota) 的變化因其對宿主哺乳動物系統(tǒng)的影響而具有重要性，腸道微生物群已經(jīng)在幾種疾病如 膜島素抗性、克羅恩氏病、腸易激惹綜合征、服胖和也血管疾病的病因?qū)W中展示了直接的影 響。
[0005] 代謝組學(xué)（Met油onomics)現(xiàn)今被認(rèn)為是表征代謝表型的一種成熟系統(tǒng)方法，代 謝表型由針對各種內(nèi)在和外在參數(shù)的協(xié)同生理學(xué)反應(yīng)引起，所述參數(shù)包括環(huán)境、藥物、飲食 模式、生活方式、遺傳和微生物組（microbiome)。與基因表達(dá)和蛋白組數(shù)據(jù)指示生理學(xué)改變 的可能性不同，代謝物及其濃度在細(xì)胞、組織和器官中的動力學(xué)變化是生理調(diào)節(jié)過程的真 正終點(diǎn)。
[0006] 代謝物組學(xué)（Met油olomics)已經(jīng)成功地應(yīng)用于小鼠、狗和非人靈長類動物中研 究營養(yǎng)干預(yù)后老化過程的調(diào)節(jié)（包括卡路里限制誘導(dǎo)的代謝變化）。特別地，在犬群中腸道 微生物群代謝的顯著改變與老化相關(guān)。盡管有該些發(fā)現(xiàn)，但是對影響老化過程的分子機(jī)制 的全面描繪尚未見報(bào)道。此外，仍然缺少對長壽的代謝表型研究。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的是，向本領(lǐng)域提供可W體外進(jìn)行檢測且允許對如下生活方式 作出診斷的生物標(biāo)志物，所述生活方式可能允許健康性老化，且尤其允許延遲和/或避免 老化相關(guān)的慢性炎性病癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題，他們能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。從 屬權(quán)利要求進(jìn)一步拓展本發(fā)明的構(gòu)思。
[0009] 在尿中使用組合的整體電核磁共振（NMR)光譜學(xué)方法，在血清中使用祀向質(zhì)譜 (M巧和脂質(zhì)組學(xué)（Iipidomic)方法，本發(fā)明人可W在包括百歲老人、較年長者和年輕成年 人的一個明確限定的老化群組中檢測代謝譜的改變。
[0010] 所選的老化組是意大利北部的一個限制性地理區(qū)域中的均質(zhì)群體，包括年輕成 年人（平均31歲）、較年長者（70歲）和百歲老人（100歲）。在該H個老化組中，百歲 老人是公認(rèn)的健康性老化和長壽的模型[Sansoni P,等，Exp Gerontol. 2008;43:61-65; Franceschi C,等，Mech Ageing Dev.2007 ; 128:92-105 ;Cevenini E,等，Expert Opin Biol Ther. 2008 :8:1393-1405]。他們后天獲得的成功老化似乎是由促炎力和抗炎力之間 的最佳平衡驅(qū)動的[hanceschi C,等，Mech Ageing Dev. 2007; 128:92-10引。
[0011] 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在較年長者和百歲老人的表型之間存在顯著差異，其中腸道 微生物群和宿主之間相互作用的動力學(xué)W及中立平衡的炎癥反應(yīng)在長壽表型中要顯著得 多。
[0012] 本發(fā)明人通過使用互補(bǔ)的NMR-MS代謝物組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)（IipidomiC)方法，在尿 和血清兩者中表征了老化和長壽的代謝表型（代謝型，met油Otype)。
[0013] 因?yàn)楠?dú)特的延遲疾病和傷殘進(jìn)入其生命后期歲月的能力，百歲老人達(dá)到人類壽命 的最極限。經(jīng)典臨床參數(shù)顯示（表1)，百歲老人具有非常低的膜島素抗性發(fā)生率，具有對于 其年齡而言最佳的人體測量值炬MI)、代謝值（膽固醇、、甘油H醋）。此外，使 用簡易精神狀態(tài)檢查表（MMS巧測量了他們的認(rèn)知功能，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重認(rèn)知衰退的低發(fā)生率。
[0014] 特別地，百歲老人表現(xiàn)出獨(dú)特的代謝表型。尿的代謝譜分析掲示了，長壽表型受到 腸道微生物組的高度影響，表現(xiàn)出更高的硫酸對甲酷（PCS)、苯己醜谷氨醜胺（PAG)排泄。 本發(fā)明人提出，腸道微生物群大量代謝蛋白質(zhì)和芳族氨基酸，包括苯丙氨酸和酪氨酸，W形 成苯己醜谷氨醜胺和硫酸對甲酷。
[0015] 基于MS的祀向代謝組學(xué)綜合分析掲示了血清中與長壽和健康性老化相關(guān)的重要 生物學(xué)改變。此外，H個年齡組之間，百歲老人是具吸引力的用于表征的長壽模型，因?yàn)楠?dú) 特的延遲疾病和傷殘進(jìn)入其生命后期歲月的能力，他們達(dá)到人類壽命的最極限。在年齡進(jìn) 程中，本發(fā)明人觀察到溶血磯脂醜膽堿（LPC 18:2，LPC 20:4)的降低，其濃度在百歲老人 中降低更多。尤其是，LPC 18:018.0的減少看上去是百歲老人所特有的。盡管有必要注意 到LysoPC基于脂肪酸鏈長和飽和度具有不同種類，其物理學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)不同，但是磯脂 類通常是促炎性的[Aiyar N，等，Mol Cell Biochem. 2007;295:113-120]，具有導(dǎo)致動脈 粥樣硬化的性質(zhì)[Schmitz G,等，Atherosclerosis. 2010;208:10-18],常常在2型糖尿病 患者中見到其水平增加[R油ini RA,等，Di油etes. 1994;43:915-919]。
[0016] 相對于較年長者，百歲老人表現(xiàn)出幾種醜基離PC濃度的平衡改變，其中H種 PC-0,即PC-O 34:3、PC-O 36:4和PC-O 40:1的含量顯著降低，而兩種離PC，即PC-O 32:1 和PC-O 34:1顯著更高。盡管對離磯脂的生理學(xué)作用了解較少，但是含有連接sn-1脂族鏈 至甘油主鏈的己帰基離鍵的縮酵磯脂是豐度最大的離磯脂。在此，醜基離磯脂醜膽堿類分 子的水平差異可能由處理氧化損傷方面的差異造成。
[0017] 在年齡進(jìn)程中，觀察到銷磯脂（SM)類分子的增加，其中SM24:1和SM16:0明顯地 增加。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在百歲老人中SM24:0和SM-O肥2:1濃度的特異減低。SM類分子是重 要的細(xì)胞膜組成成分，在構(gòu)建、代謝和運(yùn)輸中與膽固醇緊密結(jié)合，富集在脂俊中。SM的生理 學(xué)作用仍不清楚，先前的研究顯示了升高的SM水平和動脈粥樣硬化之間的關(guān)系怔ummerow FA，等，J Nutr Biochem. 2001;12:602-607]，而其它研究顯示血漿銷磯脂水平與增加的 CVD事件風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。最后，盡管大多數(shù)二醜基磯脂醜膽堿類分子（PC-O)的水平?jīng)]有顯著改 變，但百歲老人表現(xiàn)出單獨(dú)PC-O 36:2水平的改變。
[0018] PC和PC-O含量的變化可能影響花生四帰酸代謝物合成（前列腺素、血栓素、白H 帰）的活性，該些代謝物是宿主生理反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)和調(diào)節(jié)劑，參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞調(diào)亡和 免疫及炎癥功能的調(diào)節(jié)。事實(shí)上，百歲老人還顯示出具有抗炎和促炎性質(zhì)的脂質(zhì)介質(zhì)的獨(dú) 特平衡網(wǎng)絡(luò)。
[0019] 與較年長者相比，觀察到更高濃度的白H帰類分子LTB-4和LTE-4。百歲老人展 示出更高水平的15-輕基-二十碳四帰酸（IS-HETC) -15-脂加氧酶（15-L0幻的主要產(chǎn) 物。15-HETE抑制5-脂加氧酶形成，減少白H帰B4和12-HETE的產(chǎn)生，抑制免疫反應(yīng)。與 較年長者相比，在百歲老人中還觀察到CYP途徑活化的增加，其中8, 9-E祀T巧產(chǎn)生增加而 11，12-Di肥hE的濃度降低。ffiT是也臟和也外組織中許多細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要成分。研 究已經(jīng)證實(shí)，E祀T巧通過抑制核因子（NF) - K B介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的激活而表現(xiàn)出抗炎作用。 此外，它們還在血管系統(tǒng)中顯示出溶血栓和血管發(fā)生性質(zhì)。邱ETrEs可W被可溶性環(huán)氧化物 水解酶（SEH)進(jìn)一步代謝為二輕基-二十碳H帰酸值i肥Tr巧。
[0020] -般，當(dāng)化ET巧被sEH代謝為Di肥TrEs時，它們的生物學(xué)活性將變得較不顯著， 因此，在此11，12-D肥T濃度的降低可能掲示了 sEH對其前體11，12-E祀hE作用的減少。
[0021] 百歲老人顯示出9-H0DE(-種生物學(xué)活性分子，脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物）和9-氧 代-HODE(亞油酸的穩(wěn)定氧化產(chǎn)物，當(dāng)氧化應(yīng)激增加時，其產(chǎn)生增加）的明顯降低。大多數(shù) 亞油酸W PC和膽固醇亞油酸脂的醋化形式存在，兩者均是LDL的主要成分，并持續(xù)暴露于 許多類型氧化應(yīng)激W產(chǎn)生氨氧化y化oxy)和過氧氨化y化operoxy)類分子。
[0022] 增加水平的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，例如9-氧代ODE先前曾在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動脈 粥樣硬化的患者血漿樣品中被檢測到。
[0023] 此外，與較年長者相比，百歲老人顯示出二十碳五帰酸巧PA)的耗竭。盡管在人體 中EPA可W從a -亞油酸合成、或W更大的量直接從含油魚或魚油補(bǔ)充物獲得，但是EPA可 W轉(zhuǎn)化為n-3類二十焼酸，其具有多種多樣的功能。EPA的耗竭可能反映了 n-3類二十焼酸 的生物合成增加。
[0024] 因此，本發(fā)明部分地涉及診斷生活方式的體外方法，所述生活方式允許延遲和/ 或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥，所述方法包括：
[00巧]-從受試者獲得尿樣品；
[0026] -確定樣品中硫酸對甲酷（PC巧的水平，和
[0027] -將受試者的PCS水平與預(yù)定參考值比較，
[0028] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均尿PCS水平為基礎(chǔ)，和
[0029] 其中相比于該預(yù)定參考值，樣品中升高的尿PCS水平指示延遲和/或避免老化相 關(guān)的慢性炎性病癥的可能性增加。
[0030] 本方法具有例如其是非侵入的優(yōu)點(diǎn)。其可W在體外尿樣品中進(jìn)行。
[0031] 樣品中硫酸對甲酷（PC巧水平可W通過本領(lǐng)域已知的任何方式進(jìn)行檢測和定量。 例如，可W使用質(zhì)譜如UPLC-ESI-MS/MS或NMR譜如Ih-NMR譜。兩種方法均在實(shí)施例中出 現(xiàn)了。其它方法，例如其它光譜方法、色譜方法、標(biāo)記技術(shù)、或定量化學(xué)方法也可W使用。
[0032] 預(yù)定參考值W對照群體中平均尿PCS水平為基礎(chǔ)。對照群體可W是至少3個，優(yōu) 選至少10個，更優(yōu)選至少50個具有相似遺傳背景、年齡和平均健康狀況的人組成的組。
[0033] 對照群體也可W是相同個體，由此預(yù)定參考值為先前從相同受試者獲得的值。該 將例如允許直接比較目前的生活方式和先前的生活方式，可W直接評估生活方式的改善。
[0034] 典型的老化相關(guān)慢性炎性病癥是本領(lǐng)域熟知的。大部分的老化表型可W 通過炎性和抗炎網(wǎng)絡(luò)之間的失衡來解釋，該失衡導(dǎo)致老化的低度慢性促炎狀態(tài)， "inflamm-ageing" (Candore G.,等，Biogerontology. 20100ct ; 11巧）：565-73)。
[0035] 典型的老化相關(guān)炎性病癥有；例如，動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、癡呆、2型糖尿病、骨 質(zhì)疏松和也血管疾病。例如，對于該些病癥，炎癥被視為是連接老化和年齡相關(guān)病理過程的 分子改變的可能潛在基礎(chǔ)（Chung 等，ANTI0XIDANTS&RED0X SIGNALING, Volume 8, Numbers 3&4, 2006, 572-581)。
[0036] 對于本發(fā)明的目的，硫酸對甲酷（PC巧可W作為唯一標(biāo)志物使用。
[0037] 盡管對于本發(fā)明診斷方法而言硫酸對甲酷（PC巧作為唯一標(biāo)志物是有效工具，但 是如果診斷依賴于一個W上標(biāo)志物，則可W提高所述診斷的質(zhì)量和/或預(yù)測力。
[0038] 因此，可W與苯己醜谷氨醜胺（PAG)組合使用一種或多種用于延遲和/或避免老 化相關(guān)的慢性炎性病癥的可能性的其它標(biāo)志物。
[0039] 本發(fā)明人驚奇地觀察到，苯己醜谷氨醜胺（PAG)也可W用作生物標(biāo)志物檢測延遲 和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥的可能性。
[0040] 因此，本發(fā)明方法可W進(jìn)一步包括確定樣品中硫酸對甲酷（PCS)的水平，并將受 試者的PCS水平與預(yù)定參考值比較。預(yù)定參考值W對照群體中尿PCS的平均水平為基礎(chǔ)。 與預(yù)定參考值比較，樣品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示，延遲和/或避免老化相關(guān)慢 性炎性病癥的可能性增加。
[0041] 如果尿PCS和PAG水平均升高，則其強(qiáng)烈地指示延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎 性病癥的可能性增加。
[0042] 本發(fā)明方法可W另外地或備選地用于診斷允許健康和/或更健康的老化的生活 方式?？蒞通過將實(shí)際的PAG和/或PCS水平與先前從相同受試者獲得的預(yù)定參考值比較， 診斷更健康的老化。因此，在將相同受試者用作對照群體的情況下，可W直接觀察生活方式 的改善，從而消除了在其它平均對照群體中由稍微不同的條件而引起的不確定性。
[0043] 本發(fā)明方法還可W用于診斷長壽；和/或長壽的可能性。該具有優(yōu)點(diǎn)一可W直 接檢測更健康生活方式的后果，可W監(jiān)測健康生活方式的維持，W及可W在不健康的生活 方式發(fā)生第一次臨床表現(xiàn)出現(xiàn)前糾正不健康的生活方式。
[0044] 本發(fā)明方法還可W備選地和/或另外地用于診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主 相互作用。腸道微生物組對宿主發(fā)揮著多種重要的生物化學(xué)功能，微生物組的奈亂與許多 且多樣的人類疾病過程相關(guān)化inross等，Genome Medicine 2011, 3:14)。不利的腸道微生 物菌群-宿主相互作用可W具有許多臨床表現(xiàn)，例如系統(tǒng)疾病狀態(tài)，如服胖和也血管疾?。?或腸道狀況，如炎癥性腸病。
[0045] 可W在任何受試者中診斷腸道微生物菌群-宿主相互作用，但是可能尤其重要的 是在成年人或較年長者中監(jiān)測健康的微生物菌群-宿主相互作用。
[0046] 因此，可W在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0047] 如果受試者超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前二分之一，優(yōu)選地其超過其來源 國的平均預(yù)期壽命的前H分之二，更優(yōu)選地其超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前四分之 H，最優(yōu)選地其超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前五分之四，則該受試者被視為一較年長 者Il。
[004引例如，如果受試者是人，則本發(fā)明方法可W在至少45歲，至少60歲，或至少75歲 的成年人上實(shí)施。
[0049] 待使用本發(fā)明方法檢查的受試者可W是人或動物，尤其是例如哺乳動物。典型的 動物可W是例如陪伴動物如貓或狗或農(nóng)場動物。
[0050] 本發(fā)明方法可W另外地或備選地用于檢測生活方式改變的結(jié)果。因此，可能有利 的是，將PAG和/或PCS水平與先前（例如在生活方式改變之前或生活方式改變的較早期） 獲自受試者的PAG和/或PCS水平進(jìn)行比較。
[0051] 因此，本發(fā)明方法可W診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值W從生活方式改 變前的受試者獲得的尿PAG和/或PCS水平為基礎(chǔ)。
[0052] 生活方式改變可W是任何改變，例如不同的工作、更多的睡眠、較少的飲酒、更多 的挑戰(zhàn)、較少的壓力、較少的吸煙、更多的運(yùn)動、不同的工作和/或生活環(huán)境，等等。
[0053] 生活方式的改變還可W是飲食的變化。
[0054] 飲食變化可W是例如使用先前未用過的或W不同量使用的至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品。
[0055] 由此，本發(fā)明方法可W用于檢查新營養(yǎng)方案、營養(yǎng)產(chǎn)品和/或藥物的有效性。
[0056] 營養(yǎng)產(chǎn)品可W是例如聲稱對健康性老化和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥有 作用的產(chǎn)品。
[0057] 典型地，營養(yǎng)產(chǎn)品可W是食品、飲品、寵物食品、食物增補(bǔ)物、營養(yǎng)藥、食物添加劑、 或營養(yǎng)配方產(chǎn)品。
[005引樣品中生物標(biāo)志物的水平例如PAG和/或PCS水平可W通過本領(lǐng)域已知的任何方 式檢測和定量。例如，可W使用質(zhì)譜如UPLC-ESI-MS/MS，或NMR光譜如Ih-NMR光譜。
[0059] 其它方法，例如其它光譜方法、色譜方法、標(biāo)記技術(shù)或定量化學(xué)方法也可W使用。
[0060] 本發(fā)明方法包括將測試的受試者的PAG和/或PCS水平與預(yù)定參考值比較，所述 預(yù)定參考值可W源自可比對照受試者的尿中的PAG和/或PCS水平。
[0061] 其PAG和/或PCS水平在對照值W上或在參考值的較高范圍的測試受試者具有增 加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0062] 此外，受試者的PAG和/或PCS水平與對照值之間的差異程度也可W用于表征風(fēng) 險(xiǎn)程度，并由此確定哪些受試者將最為得益于某些治療。
[0063] 參考值優(yōu)選使用與表征從測試的受試者獲得的PAG和/或PCS水平時使用的單位 相同的單位度量。因此，如果PAG和/或PCS水平是絕對值，例如PAG和/或PCS的單位依 據(jù)ymol/mol肌酸酢，則參考值也W-般群體或選擇的受試者對照群體中的個體的PAG和 /或PCS的單位（y mol/mol肌酸?。榛A(chǔ)。
[0064] 此外，參考值可W是單個截?cái)嘀担缰兄祷蚱骄?。在獲得的尿樣品中PAG和 /或PCS的參考值，例如平均水平、中值水平或一截?cái)郔l水平，可W通過分析一般群體或 所選群體中的大樣本個體，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型而建立，例如預(yù)測值方法用于選擇陽性標(biāo)準(zhǔn)， 或受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve)定義最佳特異性 (最高的真陰性率）和靈敏度（最高的真陽性率），描述見并入此處作為參考的Knapp, R. G.和 Miller, M. C. (1992).Clinical Epidemiology and Biostatistics. William and Wilkins, Harual Publishing Co. Malvern, Pa.。
[0065] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何分派正確的參考值，例如其將隨著性別、種族、基因遺 傳、健康狀況或年齡等而變。
[0066] 例如，預(yù)定參考值可W是尿中63 y mol/mmol肌酸酢的PCS和81 y mol/mmol肌酸 酢的PAG。更高的值指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能。
[0067] 評估的生物標(biāo)志物越多，本發(fā)明的診斷方法將具有更強(qiáng)的預(yù)測能力。
[0068] 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)用于診斷生活方式的血清中的其它生物標(biāo)志物，所述生活方 式允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥。
[0069] 由此，本發(fā)明人鑒定了增加血清濃度的
[0070] 1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 32: 1，
[0071] 1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 34:1，
[007引 15-輕基-二十碳四帰酸（15-地ETC)，
[0073] 白 H帰 E-4(LTE4)，
[0074] 白H帰 B-4(LTB4),和 / 或
[00巧]8, 9-環(huán)氧二十碳H帰酸巧,犯pETre)
[0076] 允許診斷如下生活方式，所述生活方式允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病 癥，而降低血清濃度的
[0077] 輕基-銷磯脂（SM-OH) 22: 1，
[0078] 溶血磯脂醜膽堿（LPC) 18:0 [007引銷磯脂（SM) 24:0，
[0080] 1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 34: 3，
[0081] 1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 36: 4，
[0082] 1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 40: 1，
[0083] 磯脂醜膽堿（PC) 36:2，
[0084] 輕基十八碳二帰酸巧-HOD巧，
[0085] 9-氧代-十八碳二帰酸（9-氧代-H0DE)，和/或
[0086] 11，12-環(huán)氧二十碳H帰酸（11，12-Di肥Tr巧
[0087] 允許診斷如下生活方式，所述生活方式允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病 癥。
[0088] 個體脂質(zhì)類別如下注釋：
[0089] [脂質(zhì)類別][碳原子總數(shù)]:[雙鍵總數(shù)]。例如，PC 34:1指包含34個碳原子和 1個雙鍵的磯脂醜膽堿類別。
[0090] 因而，在本發(fā)明的方法中，可W通過與事先獲得的參考值比較，評估血清中一種 或多種下述生物標(biāo)志物的濃度是否增加來提高診斷的精確性；PC-O 32:1、PC-O 34:1、 15-地ETE、LTE4、LTB4、8、犯祀Tre ;和/或通過與事先獲得的參考值比較，評估血清中一種 或多種下述生物標(biāo)志物的濃度是否降低來提高診斷的精確性；SM-OH 22:1、LPC 18:0、SM 24:0、PC-0 34:3、PC-0 36:4、PC-0 40:1、PC 36:2、9-H0DE、9-氧代-冊06、11，12-01肥化6。
[0091] 本發(fā)明也延及新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，所述新生物標(biāo)志物可W用于診斷允許延遲和 /或避免老化慢性炎性病癥的生活方式。
[0092] 因此，本發(fā)明包括用于診斷允許延遲和/或避免老化慢性炎性病癥的生活方式的 生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是苯己醜谷氨醜胺（PAG)。
[0093] 該生物標(biāo)志物可W在尿中檢測，其具有待測樣品能夠非侵入地獲得的優(yōu)點(diǎn)。
[0094] 本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，盡管在文中將生物標(biāo)志物及其在診斷方法中的應(yīng)用描 述為
[0095] -診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式，
[0096] -診斷允許健康老化的生活方式，
[0097] -診斷長壽，和/或
[0098] -診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，
[0099] 但是所述生物標(biāo)志物同樣也可W應(yīng)用于方法中W
[0100] -診斷促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，
[0101] -診斷可能防止健康老化的生活方式，
[0102] -診斷壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或
[0103] -診斷較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0104] 在其它方面，本發(fā)明提供方法用于：
[0105] -延遲、避免和/或防止老化相關(guān)慢性炎性病癥的發(fā)生，
[0106] -促進(jìn)健康老化，
[0107] -促進(jìn)長壽，
[010引-降低壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，
[0109] -促進(jìn)更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，和/或
[0110] -防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0111] 典型地該些方法包括步驟：對受試者實(shí)施本文描述的診斷方法；和基于其結(jié)果， 改變受試者的生活方式。例如，該方法可W包括；如果診斷步驟的結(jié)果指示；在受試者中
[0112] -增加的發(fā)生老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性，
[0113] -可能防止健康老化的生活方式，
[0114] -壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或
[0115] -較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用；
[0116] 則改變受試者的生活方式。
[0117] 受試者生活方式的改變可W是本文所述的任何改變，例如飲食變化、不同工作、更 多睡眠、較少飲酒、更多挑戰(zhàn)、較少壓力、較少吸煙、更多運(yùn)動、不同的工作和/或生活環(huán)境， 等等。
[0118] 優(yōu)選地，所述改變是使用先前未用過或W不同量用過的至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品，例如 對健康老化和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥有作用的營養(yǎng)產(chǎn)品（包括食品、飲料、寵物食 品、食物補(bǔ)充物、營養(yǎng)藥、食物添加劑或營養(yǎng)配方產(chǎn)品）。
[0119] 改變受試者生活方式也包括指明受試者需要改變他/她的生活方式，例如向受試 者開處方、推薦和/或建議如上所述的生活方式改變。例如，該方法可W包括步驟：向受試 者施用或提供至少一種上述營養(yǎng)產(chǎn)品。
[0120] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，他們可W自由地組合本文描述的所有本發(fā)明特征，而不 偏離所公開的本發(fā)明的精神。尤其是，針對本發(fā)明方法描述的特征可W應(yīng)用于本發(fā)明的生 物標(biāo)志物，反之亦然。
[0121] 從下面的表格、實(shí)施例和附圖，本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將是明顯的。
[0122] 表1顯示募集的老化群組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征。數(shù)值表示為平均值（±SD)，括 號中顯示范圍。Ibmi =身體質(zhì)量指數(shù)，2糖尿?。禾悄虿∈?、空腹血漿葡萄糖> i26mg/di， 3HDL=高密度脂蛋白，4LDL=低密度脂蛋白，5MMSE=使用簡易精神狀態(tài)檢查表（MM沈）的認(rèn) 知功能量度。分析中使用的分值對于老年人通過年齡和受教育年數(shù)進(jìn)行校正。對于較年長 者的認(rèn)知損傷，MMSE分級為重度（分值0-17)、輕度（分值18-23)、或不存在（分值24-30)。 對于百歲老人，MMSE > 20不存在嚴(yán)重認(rèn)知下降；<12存在嚴(yán)重認(rèn)知下降。6CRP = C反應(yīng)蛋 白；7A-SAA =血清淀粉樣蛋白A(SAA)蛋白質(zhì)。
[0123] 表2展示所選老化群之間的辨別模型的特征和模型總結(jié)。
[0124] 表3顯示通過Ih-NMR檢測到的3個年齡組在尿中的所有被顯著調(diào)節(jié)的 代謝物。為了獲得半定量信息，針對所述H個代謝物，進(jìn)行原始光譜中的峰面積的 積分，通過使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的差異，并標(biāo)記如下： *p<0. 05. , **p<0. 01, ***p<0. 001。
[01巧]表4展示通過LC-MS檢測到的3個年齡組在血清中的所有被顯著調(diào)節(jié)的代謝物。 數(shù)值表示為平均值±SD，并標(biāo)記如下：*p<0. 05.，**p<0. 01，***p<0. 001。
[0126] 表5展示通過UPLC-ESI-MS/MS分析的3個年齡組在血清中的炎性標(biāo)志物的濃度水 平（ng/100y 1)。數(shù)值表示為平均值 ±SD，并標(biāo)記如下：*p<0. 05.，**p<0. 01，***p<0. 001。
[0127] 圖I為來自老化群組的典型尿eOOMhz譜，顯示由主要低分子量分子引起的峰，所 述主要低分子量分子為例如麗體、有機(jī)酸、氨基酸、W及源自哺乳動物和腸道微生物代謝的 代謝物（PAG和PC巧。
[0128] 圖2顯示（A)來自較年長者和百歲老人及炬）來自年輕成年人和百歲老人的尿 Ih-NMR譜的OPLS-DA分值。濃度計(jì)為uM。
[0129] 圖3顯示自較年長者和百歲老人的尿Ih-NMR譜產(chǎn)生的系數(shù)圖。
[0130] 圖4顯示有關(guān)半定量信息的盒式圖，源自原始光譜中PAG和PCS的峰面積（曲線 下面積）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證，并列于表3中。
[013。 圖5a和化顯示通過祀向UPLC-ESI-MS/MS代謝組學(xué)分析測量的、H個老化時間點(diǎn) 之間脂質(zhì)組譜（平均脂質(zhì)濃度）的差異。盒式圖反映變化，從左到右指示百歲老人、較年長 者和年輕個體。濃度為U M。平均值+SD來自H個老化組的祀向MS，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過使 用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證并列于表4中。僅顯示顯著差異，并通過Mann-Whitney U檢驗(yàn) 進(jìn)行了評估。
[0132] 圖6顯示通過祀向UPLC-ESI-MS/MS代謝組學(xué)分析測量的、H個老化時間點(diǎn)之間脂 質(zhì)組學(xué)譜的差異（結(jié)果表示為ng/100 y 1，代表平均脂質(zhì)濃度）。盒式圖反映變化，從左到右 指示百歲老人、較年長者和年輕個體。平均值+SD來自H個老化組的祀向MS，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 性通過使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證并列于表5中。僅顯示顯著差異，并通過Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行了評估。 實(shí)施例：
[0133] 受試者和研究組別
[0134] 對于要進(jìn)行的研究，每個個體和他們的家庭均給出了知情同意書。總共，在意大利 北部（包括博洛尼亞、佛羅倫薩、帕爾馬、米蘭），入選了屬于不同年齡組的541名受試者用 于本研究。百歲老人組由156名個體（125名女性和31名男性）組成，較年長者組由363 名個體（205名女性和158名男性）組成，年輕成年人組由22名個體（10名女性和12名男 性）組成。
[0135] 研究方案得到Sant '化sola-Malpi曲i大學(xué)醫(yī)學(xué)院（Bolo即a, Italy)的倫理委員 會批準(zhǔn)。得到的生物學(xué)樣品（血清和尿）在進(jìn)行代謝組學(xué)分析前儲存在-8(TC。
[0136] 臨床化學(xué)
[0137] 使用Roche Diagnostics的相應(yīng)酶學(xué)試劑盒，采用自動分析儀（Roche Dia 即 ostics Hitachi 917, Hitachi Ltd, Tokyo, Japan),測量了血清總的、高密度脂蛋白 膽固醇（皿U和甘油H醋濃度。使用Rriedewald的公式（Rriedewald WT等，Clinical 化emistrylS (6) :499 - 502)，計(jì)算了低密度脂蛋白膽固醇（LDL)濃度。細(xì)胞因子，包括小 鼠干擾素Y (INFy)、白介素1目（比-1目）、白介素6(比-6)、白介素10(比-10)、白介素 12p70(IL-l化70)、角質(zhì)細(xì)胞來源的趨化因子化C)和腫瘤壞死因子（TNF)，使用小鼠促炎多 重試劑盒（Meso Scale Discoveries, Gaithersburg, Ma巧land, USA)測量。根據(jù)制造商的 手冊，進(jìn)行測定試驗(yàn)。高靈敏C反應(yīng)蛋白（CR巧使用靈敏的雙重抗體夾也化ISA W兔抗人 CRP和過氧化物酶綴合的兔抗人CRP測量。
[0138] 用于咱NMR光譜的樣品準(zhǔn)備。S個老化組的Iml尿在凍干設(shè)備 (Rreeze-Diyer Fisher Scientific)中干燥，并使用含有ImM的3-( H甲基甲娃焼 基）-巧，2, 3, 3-2H4]-l-丙酸軸（TSP)的580 y L磯酸鹽緩沖溶液（K肥P04,終濃度0. 2M) 調(diào)整至抑6. 8,并放入5mm NMR管。在配備反向5mm低溫探頭的化址er Avance III 600MHz 光譜儀上 W 300K炬ruker Biospin, Mieinstetten, Germany)測量代謝譜。對于 每個尿樣品，使用脈沖序列（包括標(biāo)準(zhǔn)IH檢測，帶水峰壓制），記錄IH NMR譜。該標(biāo)準(zhǔn) 譜采用4s的馳豫延遲和IOOms的混合時間tm獲取。獲取的IH NMR譜采用Topspin軟 件包（2. 1版；Bruker Biospin, Mieinstetten,德國）處理，并參照在5 = 0. 0的標(biāo)準(zhǔn) (TSP)。使用內(nèi)部化合物文庫和文獻(xiàn)，給峰分派特定代謝物，并通過在選定的樣品上的標(biāo) 準(zhǔn)二維NMR譜（JRES，T0CSY，服QC，HMBC)驗(yàn)證。對于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將所有NMR譜轉(zhuǎn)化為在 5 0. 4-10. 0 范圍上的 12K數(shù)據(jù)點(diǎn)，并輸入MATLAB 軟件（7. 11.0 版巧2010b) Jhe MathWorks Inc.，化tick, M)，排除水殘基（水5 = 4. 7120-4.84)。該譜相對于規(guī)定范圍內(nèi)的所有強(qiáng) 度的總和進(jìn)行標(biāo)化。
[0139] 用于Biocrates Life Sciences絕對IDQTM試劑盒分析的樣品準(zhǔn)備
[0140] 如先前公布的（R6misch -Margl, W.，C. Prehn, R. Bogumil, C. RShring， K. Su虹e，J. Adamski，用于高通量祀向代謝物組學(xué)的組織樣品準(zhǔn)備和代謝物提取的程 序(Procedure for tissue sample preparation and metabolite extraction for high-throughput targeted metabolomics)，Metabolomics, 2011，首先網(wǎng)上公布），在 來自所選老化群組的血清樣品上使用BiocratesLife Sciences絕對IDQTM試劑盒。根 據(jù)制造商的說明，進(jìn)行孔板準(zhǔn)備和樣品施用及提取。將IOy 1終體積的血清上樣至所提 供的96孔板上，板包含同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。在Dionex Ultimate 3000超高壓液體色譜 (U冊LC)系統(tǒng)值ionex AG, Olten, Switzerland)上進(jìn)行液相色譜，其中所述色譜系統(tǒng)與安 裝有化rboV離子源W電噴霧離子化巧SI)模式運(yùn)行的3200Q TRAP質(zhì)譜儀（AB Sciex ; Foster City, CA, USA)偶聯(lián)。使用梯度流速 0-2. 4min: 30 yl/min, 2.4-2. 8min: 200 yl/ min, 2. 9-3min:30ia/min，通過直接輸注，注射樣品提取物（20ia)兩次（W正和負(fù)ESI模 式）。MS源參數(shù)設(shè)置為：脫溶劑溫度（TEM) :20(TC，高電壓；-4500V(ESI-) ,5500V (ESI+)， 氣簾仰R)和霧化器（GSl和GS。氣體；氮?dú)猓?0, 40,和50psi ;分別地，氮?dú)馀鲎矚鈮海?SmTorr。W計(jì)劃的反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM)進(jìn)行MS/MS獲取，其中對于本測定試驗(yàn)中篩選的 163種代謝物具有優(yōu)化的去簇電位值（potential values)。將原始數(shù)據(jù)文件（Analyst軟 件，版本1. 5. 1 ;AB Sciex,化Ster City, CA, USA)輸入提供的分析軟件MetIQ, W計(jì)算代 謝物濃度。所有可檢測代謝物的列表可從Biocrates Life Sciences, Austria(ht1:p:// biocrates, com)獲得。使用同位素稀釋技術(shù)通過UPLC-ESI-MS/MS進(jìn)行樣品準(zhǔn)備和炎癥標(biāo) 志物定量。
[OMU 基于先前公布的工作（化ga 等，PROG. LIPID RESEARCH, 2001，40, 199-299)，內(nèi)部 開發(fā)了測量一組63個炎癥標(biāo)志物的方法。來自H個年齡組（n= 15個百歲老人，n = 30 個較年長者，n = 50個年輕成年人）的剩余可獲得的生物材料的300 y 1血清樣品，使用 FastPrep? 24系統(tǒng)，W 10 y 1 BHT緩沖液（下基化輕基甲苯；79. 2mg/ml PB巧勻漿。對 于每個樣品，總共50 U 1血清與5 y 1內(nèi)標(biāo)溶液化Ing/ y 1)混合。添加15 y 1巧樣酸（IN) 酸化混合物。為了沉淀蛋白質(zhì)，加入550 y 1體積的甲醇/己醇（1:1，v:v)，4°C混合樣品15 分鐘，之后離也（350化pm, IOmin, 4°C )。在恒定氮?dú)饬飨抡舭l(fā)有機(jī)相至干，殘余物用SOy 1 水溶解，之后加入20 y 1己膳，然后4°C 350化pm離也Imin。將上清液轉(zhuǎn)移至LC-MS小瓶中， 然后分析。通過與串聯(lián)質(zhì)譜偶聯(lián)的液相色譜（LC-MS/M巧，進(jìn)行分析。LC在Dionex Ultimate 3000超高壓液相色譜（UHX)系統(tǒng)值ionex AG, Olten, Switzerland)上進(jìn)行。MS檢測在W ESI 模式運(yùn)行的 5500Q TRAP 質(zhì)譜儀（AB Sciex ;Foster City, CA, USA)上進(jìn)行。在 Acquity 邸H C18柱（2. Ix 150mm，1.7ym;Waters，Milford，USA)上，進(jìn)行梯度色譜分離。注射體積 5U 1，柱子維持在5(TC。流動相由含有1%己酸（洗脫劑A)和己膳（洗脫劑B)的水組成， 設(shè)定在450 y 1/min的恒定流速。梯度洗脫開始于20% B，線性增加，在6分鐘至50% B，在 13分鐘從50 %至95% B，在95% B保持3分鐘，之后在16. 1分鐘返回到20% B，重新平衡 柱子另外11分鐘。分析物W Analyst軟件（版本1. 5. 1 ;AB Sciex,化Ster City, CA, USA) 中提供的計(jì)劃選擇反應(yīng)監(jiān)測（sche化led SRM)模式監(jiān)測。所有質(zhì)量變遷（mass transition) 和MS源參數(shù)在補(bǔ)充數(shù)據(jù)中提供。SM檢查窗時間設(shè)置為120sec，祀掃描時間0. 5sec。使 用氮?dú)庾鳛闅夂熀兔撊軇?，壓力分別為CUR ;20, GSl: 70, GS2:20 (任意單位）。Block源 溫度維持在60(TC，電壓分別為：ISV:-4000V，EP:-10V，CXP:-5V。在樣品分析前，通過測 量不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0-1化g)，繪出15點(diǎn)的校準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)處理使用Analyst軟件 (版本1.5. 1;AB Sciex,F'oster City,CA,USA)進(jìn)行。計(jì)算每個分析物相對于其對應(yīng)內(nèi) 標(biāo)或替代標(biāo)志物的峰面積比。值得提及的是，血清樣品中PGJ2, PGF2a，PGE2, PGE1，15-氧 代-HETE，15-脫氧-A 12, 14-PGJ2, 6-麗基PGFla,和5-氧代-ETE低于其檢測限，因此在 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中未加考慮。
[0142] 多變量數(shù)據(jù)分析（MVA)
[0143] 在幾種軟件環(huán)境中進(jìn)行MVA。因此，對于IH NMR和祀向MS數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)輸入和預(yù)處 理步驟使用寫在MATLAB(版本7. 11. 0, The MathworksInc.，化tick, MA, USA)中的一內(nèi)部 Il 程序完成。在NMR數(shù)據(jù)分析中，使用SIMCA-P+軟件（版本12. 0, Umetrics AB，Ume各， Sweden),實(shí)施 OPLS-DA 模型。通過隨機(jī)森林（Random Forests),使用'randomForest '包 (A. Liaw and M. Wiener(2002). Classification and Regression by randomForest. R News2 (3), 18-22.)，在 R 環(huán)境中運(yùn)行巧 Development Core Team(2011). R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, UI?L ht1:p://www. R-project.org/.)， 分析祀向MS數(shù)據(jù)。最后，用于驗(yàn)證的單變量顯著性檢驗(yàn)也在R中進(jìn)行。
[0144] 老化群組的臨床特征
[0145] 表1顯示老化群組的身體和生物化學(xué)特征。與較年長者相比，BMI (p<0. 001)， 穩(wěn)態(tài)模型評估化0MA) (P<〇. 001)，總膽固醇（P = 0. 001)，甘油H醋（P = 0. 004)，皿L(p = 0.001)，和LDUp = 0.04)在百歲老人中較低，而血清淀粉樣蛋白A(A-SAA)蛋白質(zhì) (p<0. 001)和C反應(yīng)蛋白（CRP) (p<0. 001)在百歲老人中更高。與年輕個體相比，較年長者 表現(xiàn)出更高的 BMI(p<0.001)，總膽固醇（p<0.001)，甘油H醋（p<0.001)，LDL(p<0.05)，和 CRP (p<0. 001) O
[0146] 來自H個老化組（92名百歲老人，283名較年長者，和21名年輕成年人）的可得 樣品的尿600MHz iH-NMR，用于代謝譜分析。為了探索H個年齡組之間年齡誘導(dǎo)的改變和代 謝差異W及最小化無關(guān)代謝物變異性的任何影響，在來自H個時間點(diǎn)的全分辨率NMR數(shù)據(jù) 集合上應(yīng)用尿NMR譜的監(jiān)督式化學(xué)計(jì)量分析。隱變量正交投影-辨別分析（OPLS-DA)在單 位方差尺度歸一化數(shù)據(jù)（unit variance scaled data)上進(jìn)行（圖2)。百歲老人和年輕 成年人組之間的辨別模型，通過使用13. 7 %的光譜方差（spectral variance, R2X),提供 了 1. 0的分類詞驗(yàn)證錯誤（表達(dá)為ROC曲線下面積，AuROC (Fawcett, T. , An introduction to ROC analysis, Pattern Reco 即.Lett. ,2006, 27:861-874))(表 2)。同樣地，再次使用 13. 7%的總X方差，百歲老人和較年長者組之間的模型產(chǎn)生了具有0. 93的AuROC驗(yàn)證錯誤 的模型（表2)。為了確定與年齡組之間差異相關(guān)的代謝物標(biāo)簽，使用了 OPLS-DA模型的第 一性預(yù)測成分的加載值（loadings),根據(jù)變量的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行顏色編碼（圖3)。由此，百 歲老人和較年長者個體之間的尿辨別模型展示相對更高量的苯己醜谷氨醜胺（PAG)、硫酸 對甲酷（PCS)。為了獲得半定量信息，針對該H種代謝物，對原始光譜上的峰面積進(jìn)行積分， 通過使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的差異（圖4,表3)。總之，該些結(jié) 果顯示，腸道微生物高度參與長壽過程。祀向的和定量的LC-MS代謝組學(xué)展示了血清中與 老化相關(guān)的代謝改變。
[0147] 為了確定血清中年齡相關(guān)的代謝差異，在H個老化組（143名百歲老人，90名較 年長者和20名年輕成年人）的可得生物樣品上應(yīng)用祀向LC-MS/MS代謝組學(xué)方法。使用 隨機(jī)森林（RF?)炬reiman, L. , Random !^rests, Machine Learning, 2001, 45:5-32)，在 160 種代謝物的預(yù)處理半定量數(shù)據(jù)上，進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析，其中所述代謝物包括氨基酸、糖、 醜基-肉毒堿、銷脂類和甘油磯脂類。使用在RF?中實(shí)行的變量重要性特征，可W確定更 好地區(qū)分H個老化組的代謝物標(biāo)簽。為了評價標(biāo)簽的每個組分的各自辨別能力，在該些年 齡組中進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（表4中列出了所有顯著調(diào)節(jié)的代謝物）。盡管甘油磯脂 類和銷脂類的總體濃度隨著脂肪酸組成而增加和減少，但H種一致傾向是明顯的（圖3): 隨著年齡增加或減少（統(tǒng)計(jì)學(xué)有效）的化合物集合，例如減少濃度的溶血磯脂醜膽堿（LPC 18:2，LPC 20:4)，增加水平的PC32:0和增加濃度的銷磯脂（SM 24:1，SM 16:0);(ii)僅 特異于百歲老人的化合物集合，在較年長者和年輕個體之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)改變，如銷磯脂和特 定甘油磯酸脂類（SM-0H 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-O 34:3, PC-O 36:4, PC-O 40:1，PC 36:2)的減少和特定甘油磯酸脂類（PC-O 32:1，PC-O 34:1)的增加。
[014引此外，在3個老化組的剩余可得血清樣品（12名百歲老人，37名較年長者和18名 年輕成年人）上，使用祀向LC-MS/MS方法，W調(diào)查類二十焼酸合成的濃度改變。在此，在定 量數(shù)據(jù)上的RF?顯示H個年齡組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)改變（圖6)。通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn) 評價年齡組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（增補(bǔ)表5中列出了所有顯著調(diào)節(jié)的代謝物）。百歲老人展 示出較低濃度的11，12-二輕基-二十碳H帰酸（11，12-Di肥T巧）、9-輕基-十八碳二帰酸 巧-HOD巧和9-氧代-十八碳二帰酸（9-氧代-H0DE)，W及同時增加濃度的15-輕基-二十 碳四帰酸（15-HET巧和白H帰E4(LTE4)。與較年長者相比，百歲老人中二十碳五帰酸巧PA) 的水平降低。此外，在百歲老人和較年長者之間進(jìn)行成對MRC分析W最大化兩個年齡組中 的變化，展示出在百歲老人中增加血清濃度水平的8, 9-環(huán)氧二十碳H帰酸巧，9-邸10和白 H帰 B4 (LTB4)。
[0149] 本發(fā)明還提供下述編號段落中公開的其它實(shí)施方案：
[0150] 1.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的方法，包括
[0151] -從受試者獲得血清樣品
[0152] -確定樣品中9-氧代-HODE水平，和
[0153] -比較受試者中的9-氧代-HODE水平與預(yù)定參考值，
[0154] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均血清9-氧代-HODE水平為基礎(chǔ)，和
[0巧引其中與預(yù)定參考值相比樣品中血清9-氧代-HODE水平的降低指示延遲和/或避 免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性增加。
[0156] 2.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的方法，包括
[0157] -從受試者獲得血清樣品，
[015引-確定樣品中PC-O 40:1的水平，和
[0159] -比較受試者的PC-O 40:1水平與預(yù)定參考值，
[0160] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均血清PC-O 40:1水平為基礎(chǔ)，且
[016。 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低的血清PC-O 40:1水平指示增加的延遲和/ 或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0162] 3.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的方法，包括
[0163] -從受試者獲得血清樣品，
[0164] -確定樣品中SM-OH 22:1的水平，和
[0165] -比較受試者的SM-OH 22:1水平與預(yù)定參考值，
[0166] 其中預(yù)定參考值W對照群體中平均血清SM-OH 22:1水平為基礎(chǔ)，且
[0167] 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低血清SM-OH 22:1水平指示增加的延遲和/或 避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[016引 4.段落1至段落3任一的方法，還包括
[0169] -確定 PC-O 40:1，SM-OH 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-O 34:1，9-H0DE, 9-氧 代-H0DE，或LTE4中的至少一種在樣品中的水平，和
[0170] -將受試者中 PC-O 40:1 ,SM-OH 22:1 ,LPC 18:0 ,SM 24:0, PC-034:1，9-冊DE，9-氧代-冊DE，或LTE4的至少一種的水平與預(yù)定參考值比較，
[0171] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均血清PC-O 40:1，SM-OH 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-O 34:1，9-冊DE, 9-氧代-HODE 或 LTE4 水平為基礎(chǔ)，且
[017引其中與預(yù)定參考值相比，樣品中降低的血清PC-O 40:1，SM-OH 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-O 40:1，9-H0DE，和/或9-氧代-HODE水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān) 慢性炎性病癥的可能性，和/或
[0173] 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中增加的血清LTE4和/或PC-O 34:1水平指示增加 的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0174] 5.段落1至4之一的方法，其中還通過與先前獲得的參考值比較，評價生物標(biāo)志物 PC-O 32:1，15-地ETE，LTB4, 8,犯祀Tre的一個或多個在血清中是否增加，和/或評價生物 標(biāo)志物PC-O 34:3, PC-O 36:4, PC 36:2, 11，12-Di肥Tre的一個或多個在血清中是否降低， 來增加診斷的準(zhǔn)確性。
[01巧]6.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的非侵入式 方法，包括
[0176] -從受試者獲得尿樣品，
[0177] -確定樣品中苯己醜谷氨醜胺（PAG)的水平，和
[0178] -比較受試者的苯己醜谷氨醜胺（PAG)水平與預(yù)定參考值，
[0179] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均尿PAG水平為基礎(chǔ)，且
[0180] 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PAG水平指示增加的延遲和/或避免老 化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0181] 7.段落6的方法，還包括
[0182] -確定樣品中硫酸對甲酷（PC巧的水平，和
[0183] -比較受試者的PCS水平與預(yù)定參考值，
[0184] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均尿PCS水平為基礎(chǔ)，且
[0185] 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PAG和PCS水平指示增加的延遲和/或 避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0186] 8.段落1至7之一的方法，用于診斷允許健康老化的生活方式。
[0187] 9.段落1至8之一的方法，用于診斷長壽。
[018引10.段落1至9之一的方法，用于診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0189] 11.段落10的方法，其中在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互 作用。
[0190] 12.段落1至11之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值W從生 活方式改變前的受試者獲得的血清或尿水平為基礎(chǔ)。
[0191] 13.段落12的方法，其中生活方式的改變是飲食的改變。
[0192] 14.段落13的方法，其中飲食的改變是使用先前未用過的或W不同量用過的至少 一種營養(yǎng)產(chǎn)品。
[0193] 15.段落13或14的方法，用于檢查新的營養(yǎng)方案的有效性。
[0194] 16.段落1至15之一的方法，其中通過Ih-NMR和/或質(zhì)譜在樣品中及在參照中確 定生物標(biāo)志物的水平。
[0195] 17.段落1至16之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考平均值為
[0196] 2 U M的1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 32:1，
[0197] 7. 80 y M的1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 34:1，
[019引 1. 25 U g/100 U 1血清的15-輕基-二十碳四帰酸（IS-HpETC),
[0199] 0. 013U g/100y 1 血清的白H帰 E4(LTE4),
[0200] 0. 020 y g/100 y 1 血清的白H帰 B4 (4LTB)，和 / 或
[0201] 0. 070 y g/100 y 1血清的8, 9-環(huán)氧二十碳H帰酸巧，犯祀Tre)
[0202] 16. 07 y M 的輕基-銷磯脂（SM-OH) 22: 1，
[020引 52. 00 U M的溶血磯脂醜膽堿（LPC) 18: 0，
[0204] 25. 00 U M 的銷磯脂（SM) 24: 0，
[0205] 5. 07 y M的1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 34: 3，
[0206] 14. 30 U M的1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 36: 4，
[0207] 1. 41 y M的1-0-焼基-2-醜基甘油磯酸膽堿（PC-O) 40: 1，
[020引 10. 00 U M的磯脂醜膽堿（PC) 36: 2，
[0209] 0. 34 U g/100 U 1血清的輕基十八碳二帰酸巧-HO呢)，
[0210] 0. 043 y g/100 y 1的9-氧代-十八碳二帰酸（9-氧代-HO呢)，和/或
[0211] 0. 017U g/100y 1 血清的 11，12-環(huán)氧二十碳S帰酸（11，12-Di肥Tre)。 郵1引 18.段落1至17之任何的方法，還包括：
[0213] -從受試者獲得尿樣品，
[0214] -確定樣品中苯己醜谷氨醜胺（PAG)和/或硫酸對甲酷（PCS)的水平，和
[0215] -比較受試者的苯己醜谷氨醜胺（PAG)和/或PCS水平與預(yù)定參考值，
[0216] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均尿PAG和/或PCS水平為基礎(chǔ)，且其中與預(yù) 定參考值相比，樣品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān) 慢性炎性病癥的可能性。
[0217] 19.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志 物，其中所述生物標(biāo)志物是9-氧代-H0DE。
[021引 20.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志 物，其中所述生物標(biāo)志物是PC-O 40:1。
[0219] 21.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志 物，其中所述生物標(biāo)志物是SM-OH 22:1.
[0220] 22.段落19-21任一的生物標(biāo)志物，其中在血清中檢巧Ij所述生物標(biāo)志物。
[0221] 23.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志 物，其中所述生物標(biāo)志物是苯己醜谷氨醜胺（PAG)。
[0222] 24.段落23的生物標(biāo)志物，其中在尿中檢測所述生物標(biāo)志物。
[0223] 25.用于診斷（i)促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，（ii)可能防止健 康老化的生活方式，（iii)壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿 主相互作用的方法，包括
[0224] -從受試者獲得血清樣品，
[022引-確定樣品中9-氧代-H0DE，PC-O 40:1和/或SM-OH 22:1的水平和
[0226] -比較受試者的9-氧代-冊DE，PC-O 40:1和/或SM-OH 22:1水平與預(yù)定參考值，
[0227] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均血清9-氧代-冊DE，PC-O 40:1和/或SM-OH 22:1水平為基礎(chǔ)，且
[022引其中與預(yù)定參考值相比，樣品中增加的血清9-氧代-H0DE，PC-O 40:1和/或 SM-OH 22:1水平指示（i)促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，（ii)可能防止健 康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌 群-宿主相互作用。
[0229] 26.用于診斷（i)促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，（ii)可能防止健 康老化的生活方式，（iii)壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿 主相互作用的方法，包括
[0230] -從受試者獲得尿樣品，
[0231] -確定樣品中PAG的水平，和
[0232] -比較受試者的PAG水平和預(yù)定參考值，
[0233] 其中預(yù)定參考值W對照群體中的平均尿PAG水平為基礎(chǔ)，且
[0234] 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低的尿PAG水平指示（i)促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎 性病癥發(fā)生的生活方式，（ii)可能防止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風(fēng) 險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0235] 27.用于（i)延遲、避免和/或防止老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生，（ii)促進(jìn)健康老 化，（iii)促進(jìn)長壽，（iv)降低壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，（V)促進(jìn)更健康的腸道微生物菌群-宿主 相互作用，和/或（Vi)防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括：
[0236] (a)實(shí)施段落25或26所述的診斷方法；和
[0237] 化）如果受試者具有a)增加的老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的可能性，扣）可能 防止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微 生物菌群-宿主相互作用，則改變受試者的生活方式。
[023引 28.段落27的方法，其中受試者的生活方式改變包括飲食改變。
[0239] 29.段落28的方法，其中飲食的改變包括向受試者施用至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品，其中 所述營養(yǎng)產(chǎn)品對健康老化和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥有作用。
[0240] 表 1:
[0241]

【權(quán)利要求】
1. 診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的體外方法，包括 -從受試者獲得尿樣品， -確定樣品中對甲酚硫酸（PCS)的水平，和 -比較受試者的PCS水平與預(yù)定參考值， 其中預(yù)定參考值以對照群體中的平均尿PCS水平為基礎(chǔ)，且 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相 關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括 -確定苯乙酰谷氨酰胺（PAG)在樣品中的水平，和 -比較受試者的PAG水平與預(yù)定參考值， 其中預(yù)定參考值以對照群體中的平均尿PAG水平為基礎(chǔ)，且 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PCS和PAG水平指示增加的延遲和/或避免 老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷允許健康老化的生活方式。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷長壽。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作 用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相 互作用。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值以從 生活方式改變前的受試者獲得的尿PCS和/或PAG水平為基礎(chǔ)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中生活方式的改變是飲食的改變。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中飲食的改變是使用先前未用過的或以不同量用過的至 少一種營養(yǎng)產(chǎn)品。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9之一的方法，用于檢查新的營養(yǎng)方案的有效性。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其中通過1H-NMR和/或質(zhì)譜在樣品中及在參照中 確定PCS和/或PAG的水平。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值為尿 中63 y mol/mmol肌酸酐的PCS和81 y mol/mmol肌酸酐的PAG,且較高的值指示增加的延遲 和/或避免老化相關(guān)病癥的可能性。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其中還通過與事先獲得的參考值比較，評估血 清中一種或多種下述生物標(biāo)志物是否增加來提高診斷的精確性：PC-0 32:1、PC-0 34:1、 15-HpETE、LTE4、LTB4、8、9EpETre ;和/或通過與事先獲得的參考值比較，評估血清中一種 或多種下述生物標(biāo)志物是否降低來提高診斷的精確性：SM-0H 22:1、LPC 18:0、SM 24:0、 PC-034:3、PC-0 36:4、PC-0 40:1、PC 36:2、9-H0DE、9-氧代-H0DE、ll，12-DiHETre。
14. 用于診斷允許延遲和/或避免老化慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中 所述生物標(biāo)志物是對甲酚硫酸（PCS)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的生物標(biāo)志物，其中在尿中檢測所述生物標(biāo)志物。
16. 用于診斷（i)促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，（ii)可能防止健康老 化的生活方式，（iii)壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相 互作用的方法，包括 -從受試者獲得尿樣品， -確定樣品中PCS的水平，和 -比較受試者的PCS水平與預(yù)定參考值， 其中預(yù)定參考值以對照群體中的平均尿PCS水平為基礎(chǔ)，且 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低的尿PCS水平指示（i)促進(jìn)老化相關(guān)慢性炎性病 癥發(fā)生的生活方式，（ii)可能防止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和 /或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
17. 用于（i)延遲、避免和/或防止老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生，（ii)促進(jìn)健康老 化，（iii)促進(jìn)長壽，（iv)降低壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，（v)促進(jìn)更健康的腸道微生物菌群-宿主 相互作用，和/或（vi)防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括： (a) 實(shí)施權(quán)利要求16所述的診斷方法；和 (b) 如果受試者具有（i)增加的老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的可能性，（ii)可能防止 健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)，和/或（iv)較不健康的腸道微生物 菌群-宿主相互作用，則改變受試者的生活方式。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中受試者的生活方式改變包括飲食改變。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中飲食的改變包括向受試者施用至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品， 其中所述營養(yǎng)產(chǎn)品對健康老化和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥有作用。
【文檔編號】G01N33/68GK104335049SQ201380026616
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日
【發(fā)明者】S·科里諾, I·蒙托柳魯拉, F-P·馬丁, P·A·蓋伊, S·A·D·萊茲 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司