用于分析核酸序列的組件和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及借助所謂的合成測(cè)序法分析核酸序列的組件和方法。根據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)在核苷酸與待測(cè)序的核酸序列結(jié)合的過(guò)程中釋放的化學(xué)物質(zhì)群。借助于噴霧裝置將試劑施加至檢測(cè)所釋放的物質(zhì)群的傳感器。這樣做的優(yōu)勢(shì)在于，不會(huì)發(fā)生橫向流動(dòng)。假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的比例得以顯著降低。此外，少量的試劑就足以浸潤(rùn)所述傳感器。就流動(dòng)室而言不必要充填輸送管道和排放管道。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于分析核酸序列的組件和方法
[0001]本發(fā)明涉及通過(guò)所謂的合成測(cè)序法(sequencing-by-synthesis)分析核酸序列的組件和方法。
[0002]在“下一代測(cè)序技術(shù)”(NGS) ( “next generat1n sequencing”)的領(lǐng)域中主要追求兩個(gè)目的。第一，應(yīng)顯著縮短分析的持續(xù)時(shí)間。這應(yīng)使分析人類(lèi)基因組的價(jià)格低于1000美元。第二，應(yīng)保持所獲得的數(shù)據(jù)的質(zhì)量或者進(jìn)而在進(jìn)行快速分析的同時(shí)進(jìn)一步改進(jìn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
[0003]所述NGS方法包括合成測(cè)序(sequencing-by-synthesis),例如焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)和“離子半導(dǎo)體測(cè)序”(“ 1n semiconductor sequencing，，)。
[0004]焦磷酸測(cè)序的基礎(chǔ)是在DNA鏈中納入核苷酸。提供作為結(jié)合至微球(或“微珠”)的單鏈形式的待測(cè)序的DNA并將其用作模板。一個(gè)接一個(gè)地加入四種類(lèi)型的核苷酸。當(dāng)添加匹配模板的核苷酸時(shí)，通過(guò)DNA聚合酶會(huì)釋放焦磷酸(鹽)(pyrophosphate)。這導(dǎo)致了由酶級(jí)聯(lián)而觸發(fā)的閃光，其可以光學(xué)的方式被檢測(cè)到。為了能平行分析，將微球布置在陣列中的微凹部(micro-depress1ns)或“微孔”中。然后分析各個(gè)孔的光學(xué)信號(hào)。
[0005]離子半導(dǎo)體測(cè)序法也是基于核苷酸的納入。質(zhì)子的釋放表明DNA矩陣(matrix)鏈中成功地納入了核苷酸。為此，具體地，使用化學(xué)敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(chemicallysensitive field effect transistors) (chemFETs)(其也被稱(chēng)為離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管(1n-selective field effect transistors) (ISFETs))來(lái)測(cè)量 pH 值。
[0006]US 2009/0026082 Al則結(jié)合了這兩種方法。在該過(guò)程中，將具有DNA單鏈的微球布置在凹部。借助于由chemFET測(cè)得的pH值來(lái)檢測(cè)各個(gè)核酸的裝配(installat1n)。
[0007]所述測(cè)序技術(shù)需要大量的不同試劑，其被相繼輸送至相應(yīng)的分析單元。這些試劑特別包括四種類(lèi)型的核苷酸中的一種或核苷三磷酸(NTP)。試劑的進(jìn)料通常在流動(dòng)室(flow cells)中進(jìn)行。此處發(fā)生的試劑在傳感器陣列上方的橫向流動(dòng)對(duì)焦磷酸(鹽)(pyrophosphate)物質(zhì)群或所釋放的質(zhì)子是不利的。這些物質(zhì)可以在流動(dòng)方向上從第一凹部流向第二凹部并在那里導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果。此外，由于橫向的流動(dòng)，在第一凹部形成了測(cè)試組分的濃度的降低，這導(dǎo)致了假陰性的結(jié)果。質(zhì)子擴(kuò)散遠(yuǎn)離chemFET也會(huì)導(dǎo)致極低的pH值變化并且會(huì)不利地導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。此外，不利的是，由于極小的測(cè)量效果，使得對(duì)均聚物的分辨率不足。此處的均聚物指的是類(lèi)型相同的幾個(gè)核苷酸附著在一起。
[0008]上述測(cè)序技術(shù)的另一缺點(diǎn)是試劑的高使用率。這是因?yàn)楸仨殞⒚糠N新的試劑充滿包括所有輸送管道和排放管道的流動(dòng)室的整個(gè)體積。此外，陣列上方的液體層的厚度必須為約100 μ m以使新的試劑能夠被輸送至陣列中所有的凹部。
[0009]本發(fā)明的目的是提供克服上述缺點(diǎn)的用于分析核酸序列的組件和方法。
[0010]與組件相關(guān)的這一目的是通過(guò)權(quán)利要求1所述的組件來(lái)實(shí)現(xiàn)的。與方法相關(guān)的目的是通過(guò)具有權(quán)利要求10的特征的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。從屬權(quán)利要求涉及本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。
[0011 ] 根據(jù)本發(fā)明的組件被設(shè)計(jì)用來(lái)通過(guò)所謂的合成測(cè)序法分析核酸序列。在通過(guò)合成的核酸序列的測(cè)序中，檢測(cè)在核苷酸與待測(cè)序的核酸序列結(jié)合的過(guò)程中釋放的化學(xué)物質(zhì)群。為此，該組件包括用于檢測(cè)所釋放的物質(zhì)群的傳感器。最后，該組件包括用于將試劑施加至該傳感器的噴霧裝置(spraying device)。
[0012]在本發(fā)明的通過(guò)合成測(cè)序法分析核酸序列的方法中，將至少一種試劑施加至該傳感器。以將試劑噴霧到所述傳感器上的方式來(lái)施加試劑。
[0013]在該組件和該方法中，有利的是不會(huì)發(fā)生橫向流動(dòng)。因此，有利的是減少了假陰性和假陽(yáng)性的結(jié)果。因此，獲得了更大的測(cè)量效果從而改善了均聚物的分析。此外，少量的試劑就足以完全浸潤(rùn)傳感器。傳感器上試劑的液體層的厚度優(yōu)選為I μ Π1。另外，對(duì)于流動(dòng)室來(lái)說(shuō)無(wú)需充填輸送管道和排放管道。這也有利地減少了試劑的使用。
[0014]在本發(fā)明優(yōu)選的發(fā)展和構(gòu)造中，組件包括被設(shè)置成可相對(duì)于所述噴霧裝置旋轉(zhuǎn)的傳感器支架。將傳感器牢靠地連接在所述傳感器支架上。有利的是，甚至通過(guò)旋轉(zhuǎn)傳感器支架來(lái)實(shí)現(xiàn)傳感器的浸潤(rùn)。此外，通過(guò)高速的旋轉(zhuǎn)可將過(guò)量的試劑，特別是清洗液運(yùn)送至傳感器支架的外邊緣。優(yōu)選地，在施加含核苷酸的試劑期間不旋轉(zhuǎn)或僅是緩慢地旋轉(zhuǎn)所述傳感器支架。由此，有利地防止了橫向流動(dòng)。有利的是，在傳感器支架中可內(nèi)置電子裝置，其接收來(lái)自于所述傳感器的電子的傳感信號(hào)并將它們傳遞至外部的測(cè)量值記錄系統(tǒng)。
[0015]所述傳感器被適當(dāng)?shù)丶蛇M(jìn)芯片中。
[0016]在本發(fā)明另一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，傳感器為離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFET)。由此，在合成期間可以檢測(cè)所釋放的質(zhì)子。在進(jìn)行分析之前，將待測(cè)序的核酸序列連同引物一起施加至ISFET。此外，將用于核酸合成的酶加入待測(cè)序的核酸序列中。在核酸序列為DNA的情況下，例如添加DNA聚合酶。在其它核酸序列的情況下，添加相應(yīng)的合成酶?？商娲鼗蝾~外地，可使用測(cè)量化學(xué)發(fā)光光信號(hào)(chemiluminescence light signal)的傳感器。優(yōu)選地，所述傳感器測(cè)量由以焦磷酸(鹽)的釋放為基礎(chǔ)的酶級(jí)聯(lián)產(chǎn)生的光信號(hào)。
[0017]在本發(fā)明又一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，組件包括兩個(gè)傳感器。因此，有利的是可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)測(cè)量，從而可實(shí)施眾多序列的快速、平行的檢測(cè)。有利地，在一個(gè)操作中同時(shí)對(duì)兩個(gè)傳感器進(jìn)行試劑的噴霧。優(yōu)選將傳感器布置在傳感器陣列中。
[0018]在本發(fā)明另一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，在每?jī)蓚€(gè)傳感器之間布置疏水的邊界層。該疏水邊界層用作傳感器上試劑的隔離。由此，有利地防止了相鄰排列的傳感器上的試劑的交錯(cuò)(running together)。此外,有利地避免了將待測(cè)序的核酸布置在微孔中。
[0019]在本發(fā)明又一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，疏水邊界層包括金屬，特別是金。
[0020]在本發(fā)明另一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，疏水邊界層為用于離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管的參比電極(reference electrode)。有利的是，隨后布置所述參比電極使其在空間上接近傳感器。因此，在傳感器和參比電極之間僅產(chǎn)生小的電阻，從而有利地降低了信號(hào)噪曰?
[0021]在本發(fā)明又一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，噴霧裝置為超聲波霧化器(ultrasonicatomizer)。有利的是，由此可實(shí)現(xiàn)小于Iym的霧滴尺寸(droplet sizes)。
[0022]在本發(fā)明另一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，試劑是含核苷酸的溶液、清洗液或保護(hù)液。有利的是，在用于分析核酸序列的方法中首先將含核苷酸的溶液，特別是dNTP溶液施加至傳感器。該溶液僅含一種類(lèi)型的核苷酸。在施加含核苷酸的溶液期間可緩慢地旋轉(zhuǎn)傳感器支架。有利地是，施加核苷酸溶液的方式使得在每個(gè)傳感器上形成與其相鄰的傳感器局部分離的液體體積，并且所述液體體積在傳感器和參比電極的邊緣之間形成電化學(xué)接觸。如果待測(cè)序的核酸序列納入所述核苷酸，那么之后就產(chǎn)生了質(zhì)子。這些質(zhì)子僅在各自的傳感器中產(chǎn)生信號(hào)。從而有利地防止質(zhì)子從第一傳感器向第二傳感器轉(zhuǎn)移(carry-over)。在接受信號(hào)之后，優(yōu)選顯著增加旋轉(zhuǎn)速度并將通常體積大于核苷酸溶液的清洗液噴霧至傳感器并離心(spun off)。清洗液通常為能完全除去第一溶液中存在的核苷酸的類(lèi)型。旋轉(zhuǎn)傳感器支架直至清洗液幾乎全干。隨后，將作為試劑的另一含核苷酸的溶液噴霧至傳感器。所述含核苷酸的溶液也只包含一種類(lèi)型的核苷酸。隨后，再次通過(guò)清洗液除去含核苷酸的溶液。
[0023]可替代地，傳感器可設(shè)有保護(hù)液。所述液體包括水溶性成膜劑(water-solublefilm-forming agent),其有利地防止了所釋放的物質(zhì)群在測(cè)序期間的橫向擴(kuò)散。
[0024]在本發(fā)明另一有利的實(shí)施方式和發(fā)展中，將所述試劑作為氣溶膠噴霧在傳感器上。
[0025]通過(guò)參考在附圖中示出的示例性的實(shí)施方式將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
[0026]圖1示出了使用ISFET傳感器和參比電極來(lái)分析核酸序列的組件的示意圖。
[0027]圖2示出了用于分析核酸序列的方法的示意圖。
[0028]圖3示出了使用ISFET傳感器和使用疏水邊界結(jié)構(gòu)作為參比電極來(lái)分析核酸序列的組件的示意圖。
[0029]圖1示出了用于核酸合成的組件的示意圖。該組件包括超聲波霧化裝置1、微陣列芯片2、傳感器支架9和用于旋轉(zhuǎn)的電動(dòng)機(jī)10。微陣列芯片2包括離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFETs)3、參比電極4和信號(hào)處理單元5。使用第一裝置6將所述微陣列芯片2固定至傳感器支架9。所述第一裝置優(yōu)選為夾緊裝置(clamping device)?？商娲?可以通過(guò)負(fù)壓將所述微陣列芯片2固定至傳感器支架9。陣列的面積通常為Icm2，其中陣列優(yōu)選包括多達(dá)1，000, 000個(gè)傳感器。傳感器支架9包括電源8和針對(duì)ISFETs 3的數(shù)據(jù)處理單元7。通過(guò)超聲波霧化裝置I將第一試劑11噴霧在微陣列芯片2上。所述第一試劑通常為清洗液。
[0030]由于使用相對(duì)大體積的清洗液，因此可替代的是以噴射的形式從噴嘴中噴霧所述清洗液。將第一試劑11噴霧至微陣列芯片2的同時(shí)旋轉(zhuǎn)電動(dòng)機(jī)10。由于旋轉(zhuǎn),第一試劑11均勻地分布在微陣列芯片2上。隨后增加轉(zhuǎn)速以將第一試劑11徑向甩出。通過(guò)改變旋轉(zhuǎn)速度可以設(shè)置所限定的干燥狀態(tài)。
[0031]圖2示意性地示出了用于操作分析核酸序列用的組件的方法。該組件對(duì)應(yīng)于圖1所示的布置。所述微陣列芯片2還包括主動(dòng)的ISFETs (active 1n-selective field effecttransistors) 18 和被動(dòng)的(passive) ISFETs 19。主動(dòng)的 ISFETs 18 包括含用于 DNA 合成的引物的DNA序列14。此外，使DNA聚合酶結(jié)合至待查的DNA序列14。所述微陣列芯片2優(yōu)選包括主動(dòng)的ISFETsl8。
[0032]在使用第一試劑11清洗微陣列芯片2并且接下來(lái)干燥所述微陣列芯片2之后，在下一步驟中將第二試劑13 (保護(hù)液)施加至微陣列芯片2。保護(hù)液通常為洗滌緩沖液，其含有增加粘度的物質(zhì)，特別是成膜劑，例如聚乙烯卩比咯燒酮(polyvinylpyrrolidone)。設(shè)置電動(dòng)機(jī)10的轉(zhuǎn)速使得含第二試劑13的第一層21優(yōu)選具有I μ m的厚度。
[0033]如圖2中的A部分所示，將第三試劑12施加至含第二試劑13的第一層21。第三試劑12包括第一核苷酸類(lèi)型(通常為腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤，各自作為脫氧核苷三磷酸(dNTP))。此時(shí)，第三試劑12基本上垂直地細(xì)密分布在第一層21上。設(shè)置電動(dòng)機(jī)10的轉(zhuǎn)速使得含第三試劑12的第二層20優(yōu)選具有I μ m的厚度。
[0034]在施加第三試劑12之后將電動(dòng)機(jī)10減速。第三試劑12在垂直于層平面的方向上均勻地?cái)U(kuò)散進(jìn)第一層21中。由第二試劑13和第三試劑12形成了混合層15。這在圖2中的B部分被不出。
[0035]第三試劑12中的核苷酸可以與待查的DNA序列14連接。這在圖2中的C部分被示出。通過(guò)與引物14相匹配的核苷酸的連接(attachment)，質(zhì)子被釋放。借助于ISFET傳感器可以測(cè)量質(zhì)子的濃度。所測(cè)量的變量即為PH值。由于橫向的擴(kuò)散被成膜劑所限制，從而在很大程度上防止了所釋放質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。在核苷酸順利地連接于引物14的情況下產(chǎn)生了信號(hào)16。
[0036]在信號(hào)處理之后，顯著增加旋轉(zhuǎn)速度并且再次施加作為第一試劑11的清洗液。由此，微陣列芯片2得以被液體或試劑清洗?？商娲氖?，通過(guò)超聲波霧化裝置I噴霧潮濕的空氣來(lái)清洗傳感器。
[0037]在接下來(lái)的步驟中，施加作為保護(hù)液的第二試劑13并且施加含第二核苷酸類(lèi)型的第三試劑12。由于液體的垂直施加以及相關(guān)的橫向擴(kuò)散的預(yù)防，因此不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[0038]圖3示出了可替代的用于分析核酸序列的組件的示意圖。該組件包括用于霧化試劑的噴嘴裝置100、微陣列芯片2和用于旋轉(zhuǎn)的電動(dòng)機(jī)10、信號(hào)處理單元5、電源8和數(shù)據(jù)處理單元7。微陣列芯片2包括場(chǎng)效應(yīng)晶體管3。通過(guò)疏水邊界層17將各個(gè)ISFETs 3彼此分離開(kāi)來(lái)。所述疏水邊界層17含金。因此它可以用作各個(gè)ISFETs 3的參比電極。微陣列芯片2還包括主動(dòng)的ISFETsl8和被動(dòng)的ISFETsl9。將含核苷酸的第三試劑12霧化在微陣列芯片2上。通過(guò)緩慢地旋轉(zhuǎn)傳感器支架9使得第三試劑分布在微陣列芯片2上。疏水邊界層17防止了多個(gè)ISFETs上的第三試劑12流淌到一起。所形成的霧滴具有約I μ m3的尺寸。
[0039]在待查的DNA14順利納入第三試劑12中的核苷酸的情況下，借由所釋放的質(zhì)子產(chǎn)生信號(hào)16。在順利地處理完信號(hào)16之后，將作為清洗液的第一試劑11噴霧在微陣列芯片2上。通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)，微陣列芯片2得以被第三試劑3清洗。在清洗完成之后(這可由pH信號(hào)來(lái)確定)，噴霧含另一核苷酸類(lèi)型的第四試劑。以這種方式，使得快速的流程執(zhí)行因短時(shí)噴霧(在秒的范圍內(nèi))而成為可能。
【權(quán)利要求】
1.一種借助所謂的合成測(cè)序法分析核酸序列的組件，其中能夠檢測(cè)在核苷酸與待測(cè)序的核酸序列(14)結(jié)合的過(guò)程中釋放的化學(xué)物質(zhì)群，所述組件包括: -用于檢測(cè)所釋放的物質(zhì)群的傳感器(3)和 -用于將試劑(11，12，13)施加至所述傳感器(3)的噴霧裝置(1，100)。
2.如權(quán)利要求1所述的組件，包括能夠相對(duì)于所述噴霧裝置(1，100)旋轉(zhuǎn)的傳感器支架(9)。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組件，其中將所述傳感器(3)集成進(jìn)芯片(2)中。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組件，其中所述傳感器(3)為離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFETs) (3)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組件，包括至少兩個(gè)傳感器(3)。
6.如權(quán)利要求5所述的組件，其中在兩個(gè)傳感器(3)之間布置疏水邊界層(17)。
7.如權(quán)利要求6所述的組件，其中所述疏水邊界層(17)包括金屬，特別是金。
8.如權(quán)利要求6或7所述的組件，其中所述疏水邊界層(17)為所述離子選擇性場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFETs) (3)的參比電極。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組件，其中所述噴霧裝置為超聲波霧化裝置(I)。
10.一種借助所謂的合成測(cè)序法分析核酸序列的方法，其中將至少一種試劑(11，12，13)施加至傳感器(3)，其特征在于，將所述試劑(11，12，13)噴霧在所述傳感器(3)上。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述試劑為含核苷酸的溶液、清洗液或保護(hù)液。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中傳感器支架(9)相對(duì)于噴霧裝置(1，100)旋轉(zhuǎn)。
13.如權(quán)利要求10?12中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述試劑(11，12，13)作為氣溶膠噴霧在所述傳感器(3)上。
【文檔編號(hào)】G01N27/414GK104379767SQ201380032302
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月18日
【發(fā)明者】W.岡布雷赫特, O.海登 申請(qǐng)人:西門(mén)子公司