一種檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙及制備方法。本發(fā)明的金標試紙，含有底板和底板上依次銜接的加樣吸收墊、由吸附有金標抗原的玻璃纖維素膜構(gòu)成的免疫金標墊、硝酸纖維膜和吸水墊，在硝酸纖維膜上含有檢測線和質(zhì)控線，免疫金標墊上檢測線由原核表達經(jīng)優(yōu)化后N基因部分重組蛋白N1-N4構(gòu)成，質(zhì)控線為抗N1-N4重組蛋白的兔IgG抗體。本發(fā)明具有快速、簡便、直觀、靈敏、準確、檢測成本相對較低的特點。
【專利說明】一種檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病原體的檢測試紙及其制備方法，確切講本發(fā)明涉及一種檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小反會獸疫是由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疫病毒屬(Morbolivirus)的小反會獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起的，主要感染小反會獸，特別是山羊和綿羊高度易感，是一種烈性、接觸性傳染病。世界糧農(nóng)組織(FAO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將小反芻獸疫列為法定報告動物疫病，我國將其劃分為I類動物疫病。(龍云鳳，劉曉慧，周曉黎，等.小反芻獸疫流行病學及防控研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2012，33(5): 94-98.)。PPRV于1942年在西非科特迪瓦首次發(fā)現(xiàn)(Gargadennec L,Lalanne A.La peste des petits ruminants.Bull Serv Zoo AOF, 1942, 5: 15-21.),近年來，小反芻獸疫((PPR)呈擴散的趨勢，成為重要的跨國動物傳染病之一，并且我國周邊國家頻繁暴發(fā)該病，2007年7月，我國西藏自治區(qū)阿里地區(qū)日土縣發(fā)生小反芻獸疫疫情，造成了巨大的經(jīng)濟損失(王志亮，包靜月，吳曉東，等我國首例小反當獸疫診斷報告[[J].中國動物檢疫，2007，24 (8):24-26.)。小反當獸疫(PPR)具有很高病死率，在初次發(fā)病動物群中病死率可高達50%?80%，羊在我國畜牧養(yǎng)殖中占了不小的比重，因此，預(yù)防和控制小反芻獸疫的發(fā)生對我國的畜牧業(yè)健康的發(fā)展具有重要的意義(Banvard A C，Parida S，Batten C， et al.Global distribution of peste des petits ruminants virus andprospects for improved diannosis and control.J Gen Virol, 2010, 91 (Pt 12):2885-2897.)。目前本病控制主要是通過早期診斷和免疫預(yù)防(Chauhan H C，Lambade P,Sen S，et al.The use of patholoaiealand histopatholoaicaltechniques in thediagnosis of peste des petits ruminants in India[J].Veterinaria Italiana,2011，47(1): 41-47.)。
[0003]小反當獸疫防控主要采用免疫接種及血清學監(jiān)測和疫情發(fā)生后撲殺策(黃華欣，李剛，史利軍，等。小反芻獸疫病毒M蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達及鑒定[J].中國獸醫(yī)科學，2013,43 (03):266-270.)。在血清學檢測方法中，病毒中和試驗(VNT)是國際貿(mào)易中檢測金標準，其靈敏度高、特異性強，但非常耗時(龍云鳳，劉曉慧，周曉黎，等.小反芻獸疫流行病學及防控研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2012，33 (5):94-98.)。ELISA是口前PPR最常用血清學檢測方法，敏感性和特異性較高。目前，國內(nèi)外建立的檢測PPRV的ELISA方法主要是以PPRV N (邱文英，李偉，李剛，等.小反芻獸疫N蛋白單克隆抗體的制備及競爭ELIAS方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2011，19 (5) =967-972.)、PPRV H(Singh R P, Sreenivasa B P, Dhar P, et al.Development of a monoclonal antibodybased competitive—ELISA for detection and titration ol antibodies to peste despetits ruminants (PPR) virus [J].Vet Microbial, 2004, 98 (I): 3-15.)、PPRV F(田康樂，李剛，邱文英，等。小反當獸疫病毒F蛋白的原核表達及其多克隆抗體的制備[J].中國生物制品學雜志，2012，25 (9):1185-1189.)和中國發(fā)明專利申請CN102967710A公開的一種小反芻獸疫抗體檢測的競爭ELISA試劑盒及其制備方法，這些方法主要是以重組蛋白作為診斷抗原的檢測技術(shù)，而 Brning-Richardson A 等(Bruning-Richardson A, AkerblomI，Klingeborn B，et al.1mprovement and development ο I rapid chromatographicstrip tests for the diagnosis ol rinderpest and peste des petits ruminantsviruses [J].Virol Methods, 2011，174(1-2):42-46.)在制備特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了一種層析試紙條快速檢測PPRV的方法，給小反芻獸疫的檢測帶來了革命性的飛躍。我國對小反芻獸疫的抗體檢測方法和技術(shù)仍處于試驗和摸索的階段，用小反芻獸疫全病毒作為抗體診斷試劑，雖然在特異性和靈敏性上較好，但全病毒的獲得較為困難，且成本較高。而用分子生物學構(gòu)建表達的蛋白具有很好的優(yōu)勢。面對我國基層檢測機構(gòu)條件簡陋并且缺乏相應(yīng)的技術(shù)人員的現(xiàn)實，發(fā)展一種快速、簡便、檢測成本相對較低、無需要專業(yè)人員，可在檢測現(xiàn)場操作的新型診斷方法已成為要面對的任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的，可用于檢測小反芻獸疫抗體檢測金標試紙條。
[0005]本發(fā)明的一種檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙，含有底板和底板上依次銜接的加樣吸收墊、由吸附有金標抗原的玻璃纖維素膜構(gòu)成的免疫金標墊、硝酸纖維膜和吸水墊，在硝酸纖維膜上含有檢測線和質(zhì)控線，其中免疫金標墊上檢測線由原核表達經(jīng)優(yōu)化后N基因部分重組蛋白N1-N4構(gòu)成，質(zhì)控線為抗N1-N4重組蛋白的兔IgG抗體。
[0006]本發(fā)明的檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙制備方法是:以pUC57-Simple-N為模板、以引物SEQ ID Na USEQ ID Na2,SEQ ID Ns3和SEQ ID Ns4擴增得到pMD19_T Simple-NjPpMD19-T Simple- N4 和 pMD19_T Simple-N1-N4JfpMDig-T Simple-N1-M 質(zhì)粒雙酶切后，克隆至經(jīng)過同樣酶切處理的原核表達載體pET-32a中，獲得重組質(zhì)粒PETIZa-N1-N4 ；將重組質(zhì)粒PETIZa-N1-N5表達宿主菌中表達，將表達蛋白加入膠體金溶液中，再在其中加入緩沖液，然后再將前述溶液噴涂于玻璃纖維素膜上，再將重組N1-N4蛋白，噴于NC膜上為檢測帶；將兔抗N1-N4蛋白IgG抗體噴于NC膜上為質(zhì)控帶，然后依次將吸水墊、硝酸纖維膜、免疫膠體金墊、樣品吸收墊粘貼在PVC底板上，再按要求切條得到檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙。
[0007]本發(fā)明的檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙制備方法中的pMD19-T Simple- N1質(zhì)粒制備方法是:以pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增NI基因的反應(yīng)條件分別為:94°C 5min ；94°C 45s, 60°C 45s, 72°C lmin，共 35 個循環(huán)，72°C 10min，4°C結(jié)束反應(yīng)，將目的基因進行切膠回收后與PMD19-T Simple Vector進行連接，克隆出目的基因
N10
[0008]本發(fā)明的檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙制備方法中的pMD19-T Simple- N4質(zhì)粒制備方法是:以pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增N4基因的反應(yīng)條件分別為:94°C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 個循環(huán)，72°C 10min，4°C 結(jié)束反應(yīng)，將目的基因進行切膠回收后與PMD19-T Simple Vector進行連接，克隆出目的基因N4。其中優(yōu)選的方法是以pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增N1-N4基因的反應(yīng)條件分別為:94°C 5min ；94°C I min,60°C lmin, 72°C 90s，共 35 個循環(huán)，72°C10min，4°C結(jié)束反應(yīng)，將目的基因進行切膠回收后與pMD19-T Simple Vector進行連接，克隆出目的基因NrN4。
[0009]本發(fā)明中，N蛋白是PPRV病毒粒了中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒粒了中含量最豐富且免疫原性最強的結(jié)構(gòu)蛋白(Libeau q Prehaud C，Lancelot R, et al.Development ofa competitive ELISA for detecting antibodies of the peste des petits ruminantsvirus using a recombinant nucleoprotein.Res Vet Sci,1995, 58(1): 50-55.)。PPRV N蛋白序列可以根據(jù)其保守性的不同而劃分為4個區(qū)域，分別為I (I~120 aa)區(qū)、II (122 ~145 aa)區(qū)、III (146 ~398 aa)區(qū)和 IV(421 ~25 aa)區(qū)。當 PPRV 感染宿主動物后，宿主的血清中針對N蛋白的抗體占據(jù)主導地位(Balamurugan V, SenA, SsrrsvananP, et al.0ne step multiplex RT-PCR assay for the detection of peste des petitsruminants virus in clinical samples.Vet Res Commu, 2006, 30(6): 655-666),雖然該抗體不是中和抗體，不能起到中和病毒粒了的作用，但是可以用于PPRV疫苗的疫苗免疫效果的監(jiān)測。本發(fā)明分別構(gòu)建了 pET-SZa-N'pET-SZa-N^pET-SZa-N^pET-SZa-N^pET-SSa-N4,并分別進行了表達和免疫印跡檢測，結(jié)果顯示未優(yōu)化過的N基因構(gòu)建表達的Ν、ΝρΝ2、Ν3、N4蛋白均為不溶性包涵體，其中只有N、N1、N4蛋白有免疫反應(yīng)性。通過本發(fā)明基因優(yōu)化構(gòu)建的PETIZa-N1、pET-32a-N4、PETIZa-N1-N4，表達的蛋白具有免疫反應(yīng)性且表達的蛋白為可溶性，通過免疫學實驗結(jié)果顯示PET^Za-N1-N4蛋白具有較好的生物學活性，對優(yōu)化后％、N4, N1-N4基因表達的蛋白分別作為抗原建立小反芻獸疫N蛋白抗體檢測金標法，N1-N4蛋白建立的金標法陽性檢出率和特異性要明顯高于K、N4蛋白。
[0010]本發(fā)明的試劑盒制備方法簡單，而采用本發(fā)明的方法進行小反芻獸疫N蛋白抗體檢測時，不需要復雜的儀器設(shè)備和專業(yè)人員，而且不受檢測場所條件的限制，經(jīng)試驗表明，本發(fā)明具有快速、簡便、直觀、靈敏、準確、檢測成本相對較低的特點。
【具體實施方式】
`[0011]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行解說。
[0012]本發(fā)明的小反芻獸疫N基因為基因優(yōu)化后人工合成的序列，其中N蛋白基因的優(yōu)化和人工合成，將人工合成的N基因與pUC57-Simple克隆載體相連接后，構(gòu)建pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒中，pUC57-Simple_N重組質(zhì)粒由南京金斯瑞合成構(gòu)建。
[0013]本發(fā)明的小反芻獸疫N1-N4的基因是以優(yōu)化好N基因人工合成的序列進行搭橋PCR法連接，采用的兩對連接引物分別為:
SEQ ID Na I JPPRV-N1 - F:CCGGAATTCATGGCGACATTATTAA ；
SEQ ID Na 2 =PPRV-N1 - R:CCGGAGGAACCACCCGCACCACGACTTGCGAAAGT ；
SEQ ID Na 3:PPRV-N4 - F:CGTGGTGCGGGTGGTTCCTCCG ；
SEQ ID Na 4:PRV-N4 - R:ATTTGCGGCCGCGCTCAGCAAGTCCTTATCGTTGT,分別弓丨入 ^boR1、Notl限制性酶切位點，通過酶切方法構(gòu)建原核表達載體PETjZa-N1-Np
[0014]本發(fā)明所述的兩對引物是經(jīng)過大量試驗比對，充分考慮了搭橋部分重疊的特異性，使得可以通過一次擴增反應(yīng)就可以擴增出3段目的基因，分別為％、N4, N1-N4,擴增條件要求低，普通的PCR就能完成，擴增出的基因特異，只擴增出與目的相符的目的基因，獲得目的基因的時間僅為傳統(tǒng)方法的三分之一，大大節(jié)省了時間。pET-32a-Nl-N4蛋白具有較好的生物學活性，對優(yōu)化后N1、N4、N1-N4基因表達的蛋白分別作為抗原建立小反芻獸疫N蛋白抗體檢測金標法，N1-N4蛋白建立的金標法陽性檢出率和特異性要明顯高于N1、N4蛋白。
[0015]以下是本發(fā)明試紙制備與應(yīng)用的實例。
[0016](一)試紙制備
I)小反芻獸疫N蛋的N1和N4基因的擴增和搭橋PCR法連接
根據(jù)pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒中N基因堿基序列分別設(shè)計了兩對特異的引物用于擴增K、N4, N1-N4片段基因，這兩對引物還可以用于搭橋PCR將NI和N4基因相連接，參見表I引物序列。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙，含有底板和底板上依次銜接的加樣吸收墊、由吸附有金標抗原的玻璃纖維素膜構(gòu)成的免疫金標墊、硝酸纖維膜和吸水墊，在硝酸纖維膜上含有檢測線和質(zhì)控線，其特征在于免疫金標墊上檢測線由原核表達經(jīng)優(yōu)化后N基因部分重組蛋白N1-N4構(gòu)成，質(zhì)控線為抗N1-N4重組蛋白的兔IgG抗體。
2.權(quán)利要求1所述的檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙制備方法，其特征在于以pUC57-Simple-N 為模板、以引物 SEQ ID Na USEQ ID Na 2,SEQ ID Ns 3 和 SEQ ID Ns 4 擴增得到 PMD19-T Simple- N1 和 pMD19_T Simple- N4 和 pMD19_T Simple-N1-N4,將 pMD19_TSimple-N1-M質(zhì)粒雙酶切后，克隆至經(jīng)過同樣酶切處理的原核表達載體pET-32a中，獲得重組質(zhì)粒PETIZa-N1-N4 ;將重組質(zhì)粒PETIZa-N1-N5表達宿主菌中表達，將表達蛋白加入膠體金溶液中，再在其中加入緩沖液，然后再將前述溶液噴涂于玻璃纖維素膜上，再將重組N1-N4j蛋白，噴于NC膜上為檢測帶；將兔抗N1-N4蛋白IgG抗體噴于NC膜上為質(zhì)控帶，然后依次將吸水墊、硝酸纖維膜、免疫膠體金墊、樣品吸收墊粘貼在PVC底板上，再按要求切條得到檢測小反芻獸疫抗原的金標試紙。
3.權(quán)利要求2所述方法中所述的pMD19-TSimple- N1質(zhì)粒制備方法，其特征在于以pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增NI基因的反應(yīng)條件分別為:94°C5min ；94°C 45s, 60°C 45s, 72°C lmin，共 35 個循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)，將目的基因進行切膠回收后與PMD19-T Simple Vector進行連接，克隆出目的基因K。
4.權(quán)利要求2所述方法中所述的pMD19-TSimple- N4質(zhì)粒制備方法,其特征在于以pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增N4基因的反應(yīng)條件分別為:94°C5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 個循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)，將目的基因進行切膠回收后與PMD19-T Simple Vector進行連接，克隆出目的基因N4。
5.權(quán)利要求2所述方法中所述的pMD19-TSimple-N1-N4質(zhì)粒制備方法，其特征在于以pUC57-Simple-N重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增N1-N4基因的反應(yīng)條件分別為:94°C5min ；94°C I min,60°C lmin,72°C 90s，共 35 個循環(huán)，72°C lOmin，4°C結(jié)束反應(yīng)，將目的基因進行切膠回收后與PMD19-T Simple Vector進行連接，克隆出目的基因NrN4。
【文檔編號】G01N33/68GK103760364SQ201410013609
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】祁光宇, 蔣韜, 劉斌, 王超英, 牟克斌, 劉學榮, 杜平, 董金杰, 智曉瑩, 武發(fā)菊 申請人:祁光宇