硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜熒光檢測(cè)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜熒光檢測(cè)，方法其主要是由甲醇鈉、甲醇、乙醇肼按一定用量配比，并通過(guò)新的合成方法合成了硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)液相色譜熒光的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜熒光檢測(cè)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種硝基呋喃類藥物代謝物的制備，尤其涉及一種硝基呋喃代謝物AOZ的制備方法及其利用高效液相色譜熒光方法檢測(cè)Α0Ζ。
【背景技術(shù)】
[0002]硝基呋喃類抗生素(Nitrofurans)是人工合成的具有5_硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，該類抗生素對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲均有抑制作用，曾經(jīng)廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)、蜂等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療，但是硝基呋喃類藥物的副作用已引起人們的高度關(guān)注。例如呋喃唑酮對(duì)治療腸炎和痢疾等效果非常顯著，而且又比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，所以，有些養(yǎng)殖企業(yè)把呋喃唑酮作為預(yù)防動(dòng)物腹瀉和霍亂等疾病的主要用品，長(zhǎng)期使用，使得藥物殘留在被飼喂動(dòng)物的肌肉組織與內(nèi)臟組織中，人在食用這些動(dòng)物性食品后也會(huì)出現(xiàn)類似于藥物過(guò)敏的癥狀，重者會(huì)出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)速、血壓升高、胸悶和煩燥等。孕婦在長(zhǎng)時(shí)間食用這些肉食品后還有可能造成新生兒畸形的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見(jiàn)，對(duì)呋喃唑酮進(jìn)行監(jiān)測(cè)是保障人類食品安全的重要組成部分，是保障人類身體健康與生命安全的重要措施。
[0003]硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，而硝基呋喃類藥物代謝迅速，致使在血漿水平中相應(yīng)的母體化合物在幾分鐘至幾小時(shí)內(nèi)降解。但其代謝物會(huì)以結(jié)合態(tài)形式在體內(nèi)殘留較長(zhǎng)時(shí)間，是硝基呋喃類藥物的標(biāo)記殘留物。因此硝基呋喃抗生素代謝物可在動(dòng)物喂食的殘留污染食物中和動(dòng)物肌肉中檢測(cè)到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種硝基呋喃類藥物代謝物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)的制備方法，并建立了 AOZ動(dòng)物源殘留量的高效液相色譜熒光測(cè)定方法。本方法以2-羥基-1-萘醛為AOZ的熒光衍生試劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)AOZ的定量分析，建立了 AOZ的液相色譜-熒光檢測(cè)方法，該方法靈敏度滿足國(guó)際上動(dòng)物源性食品和水產(chǎn)品中AOZ的殘留要求，操作方便高效穩(wěn)定，易于推廣，適合工商部門、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)及相關(guān)產(chǎn)品養(yǎng)殖加工企業(yè)對(duì)硝基呋喃代謝物AOZ的快速檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明正是出于上述目的，通過(guò)新的合成方法合成了硝基呋喃類藥物代謝物Α0Ζ，并采用高靈敏度、高選擇性的熒光衍生試劑柱前衍生、高效液相色譜分離檢測(cè)Α0Ζ，建立了AOZ的液相色譜-熒光檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)2-羥基-1-萘甲醛作為衍生試劑進(jìn)行衍生化，其與AOZ結(jié)合后產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。用乙酸乙酯萃取，以乙腈硼酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，梯度洗脫，將該代謝產(chǎn)物完全分離并進(jìn)行測(cè)定，建立了一種新型硝基呋喃類抗生素代謝物AOZ的檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明所述的硝基呋喃代謝物AOZ與衍生試劑2-羥基-1-萘甲醛反應(yīng)后，光譜性質(zhì)研究表明生成了較強(qiáng)的熒光化合物，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)AOZ的液相色譜-熒光檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物，其特征在于:它包括下列用量的組合物: 甲醇鈉0.1128g 甲醇0.23ml乙醇肼1.35ml 碳酸二甲酯2.53ml 2-羥基-1-萘甲醛0.344g乙醇25ml。
2.一種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物的制備方法，其特征在于:它包括下列步驟: (1)稱取甲醇鈉0.1128g，量取甲醇0.23ml，乙醇肼1.35ml，加入50ml三口燒瓶中，充分?jǐn)嚢?0min，使甲醇鈉充分溶解，燒瓶?jī)?nèi)為無(wú)色透明溶液； (2)加入碳酸二甲酯2.53ml，70°C保溫lh，緩慢攪拌升溫至75°C，敞口回流蒸出甲醇，回流2h至甲醇蒸餾完畢，結(jié)束反應(yīng)，得到AOZ的合成液； (3)稱量0.344820mmoL 2-羥基-1-萘甲醛，用25mL乙醇溶解，將此溶液滴加到AOZ合成液中，滴加時(shí)要注意速度，約3s —滴，邊攪拌邊滴加，濾液逐漸變渾濁，溶液為淡黃色，70°C回流2小時(shí)，三口燒瓶?jī)?nèi)上層為淡黃色液體，下層為白色沉淀，趁熱過(guò)濾后，將淡黃色濾液結(jié)晶得到淡黃色晶體，水洗3次，再用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，最后用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，干燥稱重，即得代謝物，質(zhì)量為0.2815g ；
1HNMR(^OMHzjOr6-DMSO) δ: 12.08 (s, 1H)，8.67 (s, IH)) ,8.58 (d,/=4.4Hz, 1H)，7.89 (q,/=5.7Hz，2H)，7.55-7.59 (m, 1H) ,7.40 (t, /=4.3Hz, 1H)，.22 (d，/=4.5Hz, 1H) ,4.59 (t，/=4.3Hz，2H)，4.14(t, /=4.2Hz，2H) ；ES1-MSm/z257.38[M+H]+ ;元素分析實(shí)測(cè)值 C15H12N2O3:C，65.72; Η, 4.69 ;N, 10.94.理論值:C,65.62; Η, 4.72 ;N, 10.93 ;0,18.73。
3.一種高效液相色譜熒光檢測(cè)的方法，其特征在于:它包括下列步驟: (1)配制溶液 稱取動(dòng)物源性和水產(chǎn)品樣品5.0Og,加入IOmL甲醇-0.40mol/L鹽酸混合溶液7+3，體積比，充分水解，再加入200 μ L2-羥基-1-萘甲醛甲醇溶液25mmol/L于50°C水浴衍生2h，用乙酸乙酯萃取，萃取液在40°C下用N2吹干后，用ImL的乙腈水溶液乙腈:水=8: 2/v:v重新溶解，該溶液采用高效液相色譜熒光儀測(cè)定，外標(biāo)法定量； (2)試樣制備 從原始樣品取出有代表性樣品500g，用搗碎機(jī)搗碎混勻，裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，將試樣置于_18°C冷凍避光保存，在制樣的操作過(guò)程中，應(yīng)防止樣品污染或殘留物含量發(fā)生變化； (3)樣品處理 ①水解和衍生化 稱取5.0Og試樣精確至0.01g于50mL塑料離心管中，加入IOmL甲醇-0.40mol/L鹽酸混合溶液7+3，體積比充分?jǐn)嚢韬螅?0min使其充分水解，加入0.20g氯化鉀，充分?jǐn)嚢韬?，再超?0min，然后以7200r/min離心40min，傾倒上清液于IOmL玻璃試管中，再加入200 μ L2-羥基-1-萘甲醛的甲醇溶液25mmol/L，振蕩搖勻后超聲lOmin，置50°C恒溫水浴鍋中反應(yīng)2h ； ②提取和凈化 將衍生化后的溶液，冷卻至室溫，在60°C下用氮?dú)獯抵羖mL，加入4mL純凈水，再加入5mL乙酸乙酯,振蕩提取5min后，以1000r/min離心5min,收集乙酸乙酯層,殘留物用5mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯層，收集液在40°C下用N2吹干，將濃縮物用ImL的乙腈水溶液乙腈:水=8: 2/v:v重新溶解,用0.45μηι有機(jī)濾膜過(guò)濾后,轉(zhuǎn)移入進(jìn)樣瓶待進(jìn)樣；(4)測(cè)定 液相色譜條件:
色譜柱:YMC_Pack PolymerC18, 250 X 4.Bmml.D.S_6Mm ； 柱溫:40°C ； 流速:0.7mL/min ； 進(jìn)樣量:20yL ; 熒光檢測(cè)條件:靈敏度(EUFS):500 ;增益(Gain): 10 ;通道1:激發(fā)波長(zhǎng)(Ex):395nm發(fā)射波長(zhǎng)(Em): 463nm ;通道2:激發(fā)波長(zhǎng)(Ex):260nm發(fā)射波長(zhǎng)(Em): 463nm ； (5)工作曲線 移取AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到IOmL甲醇-0.45mol/L鹽酸混合溶液7+3，體積比中，使其濃度分別為 0.5ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL 和 20.0ng/mL,用高效液相色譜儀測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，或采用與待測(cè)物相近濃度的標(biāo)樣進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)定； (6)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 以陰性控制樣品為測(cè)試樣品，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定，在1.0、5.0和.10.0yg/kg3個(gè)濃度水平 上進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，對(duì)應(yīng)工作曲線法計(jì)算每個(gè)樣品的濃度，并計(jì)算回收率。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103808821SQ201410014115
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】盛良全, 徐華杰, 杜娜娜, 劉昭第, 宋崇富, 陳明明, 胡小娟 申請(qǐng)人:阜陽(yáng)師范學(xué)院