一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法
【專利摘要】一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法，屬于納米生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明包括：磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián)，DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子在DNA酶的作用下進(jìn)行組裝，磁性納米粒子組裝體應(yīng)用磁共振信號(hào)對(duì)Pb2+濃度進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供了一種基于Pb2+依賴的DNA酶組裝磁性納米粒子檢測(cè)Pb2+的方法，應(yīng)用DNA修飾的磁性納米粒子作為探針，DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子在DNA酶的作用下組裝成多聚體，根據(jù)不同Pb2+濃度下磁共振信號(hào)的差異對(duì)Pb2+進(jìn)行檢測(cè)。本方法檢測(cè)限低、靈敏度高、特異性好，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)需求。
【專利說明】 一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法，屬于納米生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域。【背景技術(shù)】
[0002]鉛是一種有毒的重金屬，鉛污染主要來源于各種油漆、涂料、蓄電池、冶煉、五金、機(jī)械、電鍍、化妝品、染發(fā)劑、釉彩碗碟、餐具、燃煤、膨化食品、自來水管等。它通過皮膚、消化道、呼吸道進(jìn)入體內(nèi)與多種器官親和，主要毒性效應(yīng)是貧血癥、神經(jīng)機(jī)能失調(diào)和腎損傷，易受害的人群有兒童、老人、免疫低下人群。它可以破壞兒童的神經(jīng)系統(tǒng)，它可以導(dǎo)致血液循環(huán)系統(tǒng)和腦的疾病。長(zhǎng)期接觸鉛和它的鹽(尤其是可溶的和強(qiáng)氧化性的PbO2)可以導(dǎo)致腎病和類似絞痛的腹痛。攝入過多的鉛及其化合物會(huì)導(dǎo)致心悸，易激動(dòng)，并會(huì)使神經(jīng)系統(tǒng)受損，甚至?xí)掳┖椭禄?。鉛對(duì)水生生物的安全濃度為0.16mg/L，用含鉛0.1?4.4mg/L的水灌溉水稻和小麥時(shí)，作物中鉛含量明顯增加。國(guó)家環(huán)保部的調(diào)查顯示，我國(guó)水體重金屬污染問題十分突出，江河湖庫(kù)底質(zhì)的污染率高達(dá)80.1%。針對(duì)重金屬污染的特點(diǎn)，對(duì)其發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)是致關(guān)重要的。
[0003]傳統(tǒng)的Pb2+檢測(cè)方法主要是儀器分析方法，包括電感偶合等離子體法(ICP)和原子吸收光譜法，雖然這些方法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性，但是這些方法需要昂貴的儀器、復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程、專業(yè)的操作人員，從而導(dǎo)致較高的分析成本。近年來，隨著納米技術(shù)在分析檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，納米生物傳感器的高靈敏度、高特異性、低成本的優(yōu)勢(shì)，引起了人們廣泛的研究興趣，由納米粒子所制備的各種生物傳感器如:比色傳感器、手性傳感器、表面等離子共振傳感器、核磁共振傳感器等，在各種食品危害因子的檢測(cè)中都進(jìn)行了大量的研究。磁納米粒子具有順磁性的特性，不同狀態(tài)的磁納米粒子具有不同的橫向弛豫時(shí)間T2，可以借助于磁納米粒子的磁共振信號(hào)對(duì)目標(biāo)有害物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。
[0004]DNA酶是經(jīng)體外篩選得到的一種功能化的DNA分子，可以識(shí)別目標(biāo)物并且催化發(fā)生特定的生物化學(xué)反應(yīng)，重金屬依賴的DNA酶一般由兩條鏈組成，一條是酶鏈，一條是底物鏈，在重金屬存在的條件下，會(huì)導(dǎo)致底物鏈發(fā)生相應(yīng)的連接或斷裂，Pb2+依賴的DNA酶被稱作“8 - 17” DNA酶，酶的底物鏈包含有RNA切割位點(diǎn)，當(dāng)存在Pb2+的條件下，底物鏈的切割位點(diǎn)處會(huì)發(fā)生斷裂，從而表明Pb2+的存在。
[0005]本發(fā)明是借助于Pb2+依賴的DNA酶將磁納米粒子探針組裝成多聚體，在不同濃度Pb2+存在的條件下，酶的底物鏈發(fā)生斷裂從而導(dǎo)致磁納米粒子多聚體發(fā)生不同程度的解聚，隨著Pb2+濃度的增加，解聚程度越大，相應(yīng)的橫向弛豫時(shí)間T2隨之降低，根據(jù)T2弛豫時(shí)間與Pb2+濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，達(dá)到檢測(cè)Pb2+含量的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種核磁共振傳感器對(duì)Pb2+進(jìn)行檢測(cè)與定量，借助于Pb2+依賴的DNA酶將磁性納米粒子探針組裝成多聚體，在不同濃度Pb2+存在的條件下，多聚體發(fā)生不同程度的解聚，最后通過核磁共振信號(hào)對(duì)磁性納米粒子組裝體進(jìn)行測(cè)定，從而間接檢測(cè)目標(biāo)Pb2+的含量。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法，包括:磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián)，DNA偶聯(lián)后的磁性納米粒子在DNA酶的作用下進(jìn)行組裝，磁性納米粒子組裝體應(yīng)用磁共振信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；具體步驟為:
(1)磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián)
所用的分散性良好的磁納米粒子為羧基功能化的磁性納米粒子，粒徑為10.3±1.6nm，首先磁納米粒子表面的羧基用碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)進(jìn)行活化，即:0.15mg磁性納米粒子用100 UL 0.01M的PBS (包含50mM NaCl)進(jìn)行溶解，然后將0.0746mg EDC和0.12mg NHS加入到上述溶液中；活化15min后，取兩份上述磁性納米粒子，向其中分別加入一對(duì)DNA探針SI及S2之一種，使DNA探針的終濃度均為I U M，在室溫振蕩反應(yīng)4h ；DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子用截留分子量為3000的超濾管超濾三次，以完全去除未反應(yīng)的DNA分子,每次在10000r/min的條件下離心5 min ;最終將DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子重懸到25mM pH7.2的Tris-乙酸緩沖液中，從而得到偶聯(lián)DNA的磁性納米粒子探針磁性納米粒子-SI及磁性納米粒子-S2 ；
S1:5，-TCACAGATGA GT- NH2_3’ ；
S2:5’- NH2-CACGAGTTGA CA-3’ ；
所述的磁性納米粒子是Fe3O4納米粒子，表面含有羧基基團(tuán)，所用的DNA探針SI的3’端用NH2基團(tuán)進(jìn)行修飾，所用的DNA探針S2的5’端用NH2基團(tuán)進(jìn)行修飾；
(2)DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子在DNA酶的作用下進(jìn)行組裝
整個(gè)組裝過程在100 u L的反應(yīng)體系中進(jìn)行，主要包括:以上偶聯(lián)好的50 y L磁納米粒子-Sl、50iiL磁納米粒子-S2、終濃度分別為IiiM的底物鏈(簡(jiǎn)稱Sub)和2iiM酶鏈(簡(jiǎn)稱17E)，反應(yīng)緩沖液為25 mM pH 7.2的Tris-乙酸溶液(包含100 mM NaCl)，將混合溶液加熱到70°C，然后將其緩慢降至室`溫以促進(jìn)磁性納米粒子的組裝；過夜反應(yīng)后得到組裝好的磁納米粒子組裝體，再用截留分子量為3000的超濾管超濾3次以去除未雜交的DNA分子，將純化好的磁納米粒子用于Pb2+的檢測(cè)；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；
17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ；
(3)磁性納米粒子組裝體應(yīng)用磁共振信號(hào)對(duì)Pb2+濃度進(jìn)行檢測(cè)
將一系列不同濃度的Pb2+加入到上述組裝好的磁性納米粒子中，Pb2+依賴的DNA酶在Pb2+的作用下誘導(dǎo)底物鏈發(fā)生斷裂，從而使得磁性納米粒子聚集體發(fā)生不同程度的解聚，再用磁共振信號(hào)測(cè)定不同樣品的橫向弛豫時(shí)間T2，隨著Pb2+濃度的增加，磁性納米粒子的解聚程度越大，從而使得橫向弛豫時(shí)間T2越小；得到橫向弛豫時(shí)間T2與Pb2+濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；從而應(yīng)用磁共振信號(hào)對(duì)Pb2+的濃度進(jìn)行定量測(cè)定。
[0008]所述的磁性納米粒子是Fe3O4納米粒子，表面含有羧基基團(tuán)，所用的DNA探針用NH2基團(tuán)進(jìn)行修飾，磁性納米粒子和DNA探針通過EDC法進(jìn)行偶聯(lián)。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種磁共振傳感器對(duì)Pb2+進(jìn)行檢測(cè)與定量，借助于Pb2+依賴的DNA酶將磁性納米粒子與DNA探針組裝成多聚體，在不同濃度Pb2+存在的條件下，多聚體發(fā)生不同程度的解聚，最后通過核磁共振信號(hào)對(duì)磁性納米粒子組裝體進(jìn)行測(cè)定，從而間接檢測(cè)目標(biāo)Pb2+的含量?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0010]圖1 Pb2+檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2 Pb2+檢測(cè)的磁共振成像。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法，包括:磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián)，DNA偶聯(lián)后的磁性納米粒子在DNA酶的作用下進(jìn)行組裝，磁性納米粒子組裝體應(yīng)用磁共振信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；具體步驟為:
(1)磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián)
所用的分散性良好的磁納米粒子為羧基功能化的磁性納米粒子，粒徑為10.3±1.6nm，首先磁納米粒子表面的羧基用碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)進(jìn)行活化，即:0.15mg磁納米粒子用100 UL 0.01M的PBS (包含50mM NaCl)進(jìn)行溶解，然后將0.0746mg EDC和0.12mg NHS加入到上述溶液中；活化15min后，取兩份上述磁性納米粒子，向其中分別加入一對(duì)DNA探針SI及S2之一種，使DNA探針的終濃度均為I U M，在室溫振蕩反應(yīng)4h ；DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子用截留分子量為3000的超濾管超濾三次，以完全去除未反應(yīng)的DNA分子,每次在10000r/min的條件下離心5 min ;最終將DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子重懸到25mM pH7.2的Tris-乙酸緩沖液中，從而得到偶聯(lián)DNA的磁性納米粒子探針磁性納米粒子-SI及磁性納米粒子-S2 ；
S1:5，-TCACAGATGA G`T- NH2_3’ ；
S2:5’- NH2-CACGAGTTGA CA-3’ ；
所述的磁性納米粒子是Fe3O4納米粒子，表面含有羧基基團(tuán)；
(2)DNA探針偶聯(lián)后的磁性納米粒子在DNA酶的作用下進(jìn)行組裝
整個(gè)組裝過程在100 u L的反應(yīng)體系中進(jìn)行，主要包括:以上偶聯(lián)好的50 y L磁性納米粒子-Sl、50iiL磁性納米粒子-S2、終濃度分別為IiiM的底物鏈(簡(jiǎn)稱Sub)和2iiM酶鏈(簡(jiǎn)稱17E)，反應(yīng)緩沖液為25 mM pH 7.2的Tris-乙酸溶液(包含100 mM NaCl)，將混合溶液加熱到70°C，然后將其緩慢降至室溫以促進(jìn)磁性納米粒子的組裝；過夜反應(yīng)后得到組裝好的磁性納米粒子組裝體，再用截留分子量為3000的超濾管超濾3次以去除未雜交的DNA分子，將純化好的磁性納米粒子用于Pb2+的檢測(cè)；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；
17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ；
(3)磁性納米粒子組裝體應(yīng)用磁共振信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)
將一系列不同濃度的Pb2+加入到上述組裝好的磁納米粒子中，Pb2+依賴的DNA酶在Pb2+的作用下誘導(dǎo)底物鏈發(fā)生斷裂，從而使得磁性納米粒子聚集體發(fā)生不同程度的解聚，再用磁共振信號(hào)測(cè)定不同樣品的橫向弛豫時(shí)間T2，隨著Pb2+濃度的增加，磁性納米粒子的解聚程度越大，從而使得橫向弛豫時(shí)間T2越??；得到橫向弛豫時(shí)間T2與Pb2+濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；從而應(yīng)用磁共振信號(hào)對(duì)Pb2+的濃度進(jìn)行定量測(cè)定。
[0012](4)檢測(cè)靈敏度研究 根據(jù)每個(gè)目標(biāo)Pb2+濃度下對(duì)應(yīng)的核磁共振信號(hào)，以Pb2+濃度為橫坐標(biāo)，T2弛豫時(shí)間為縱坐標(biāo)做出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Pb2+的檢測(cè)限為0.05 ng mL—1。
[0013](5)特異性研究
以Mn2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Hg2+、Cu2+代替Pb2+作為檢測(cè)對(duì)象，進(jìn)行特異性分析，每種重金屬的加入濃度均為5 ng mL—1，將反應(yīng)體系的核磁共振信號(hào)與空白樣品即未加入任何重金屬離子的核磁共振信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明兩者沒有明顯的差別，由此得出其它重金屬離子不能識(shí)別Pb2+依賴的DNA酶，此方法的特異性良好。
[0014](6)添加回收實(shí)驗(yàn)
將不同濃度的Pb2+加入到陰性自來水中，用以上方法建立的Pb2+檢測(cè)磁共振傳感器進(jìn)行水樣品中的添加回收測(cè)定，最終得到的回收率范圍在92.7%- 97.6%，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。S1:5，-TCACAGATGA GT- NH2_3’ ；
S2:5’- NH2-CACGAGTTGA CA-3’ ；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ；
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定鉛離子的磁共振成像傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于包括:磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián)，DNA偶聯(lián)后的磁性納米粒子在DNA酶的作用下進(jìn)行組裝，磁性納米粒子組裝體應(yīng)用磁共振信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；具體步驟為: (1)磁性納米粒子分別與一對(duì)DNA探針偶聯(lián) 所用的分散性良好的磁性納米粒子為羧基功能化的磁性納米粒子，粒徑為10.3±1.6nm,首先磁性納米粒子表面的羧基用碳二亞胺EDC和N-羥基硫代琥珀酰亞胺NHS進(jìn)行活化，即:0.15mg磁性納米粒子用100 u L包含50mM NaCl的0.01M的PBS進(jìn)行溶解，然后將，0.0746mg EDC和0.12mg NHS加入到上述溶液中；活化15min后，取兩份上述磁性納米粒子，向其中分別加入一對(duì)DNA探針SI及S2之一種，使DNA探針的終濃度均為I U M，在室溫振蕩反應(yīng)4h ；DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子用截留分子量為3000的超濾管超濾三次，以完全去除未反應(yīng)的DNA分子,每次在10000r/min的條件下離心5 min ;最終將DNA偶聯(lián)的磁性納米粒子重懸到25mM pH7.2的Tris-乙酸緩沖液中，從而得到偶聯(lián)DNA的磁性納米粒子探針磁性納米粒子-SI及磁性納米粒子-S2 ；
【文檔編號(hào)】G01N24/08GK103760184SQ201410019078
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】徐麗廣, 胥傳來, 尹紅紅, 匡華, 馬偉, 宋珊珊, 劉麗強(qiáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)