一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素e的雙抗體夾心法
【專利摘要】一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明應(yīng)用購于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的重組金黃色葡萄球菌腸毒素E（SEE）免疫8周齡BALB/c小鼠，經(jīng)過正常的免疫、細(xì)胞融合、篩選后得到12株SEE單克隆抗體。12株抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶并進(jìn)行兩兩配對。最后選定以1E5（CGMCCNo.7214）、2E3（CGMCCNo.7215）分別為包被抗體和酶標(biāo)抗體，以SEE為標(biāo)準(zhǔn)品建立了SEE的雙抗體夾心法。LOD為0.04ng/mL，線性范圍0.1-10ng/mL。本發(fā)明采用理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可大量制備的單克隆抗體，建立的雙抗體夾心法靈敏度高，成本低，與金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D無交叉反應(yīng)，為食品中SEE的檢測提供了快速高效的分析手段。
【專利說明】—種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的食源性致病菌,金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素SEA、SEB、SEC、SED, SEE引起的中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%。
[0003]在食品加工過程中，經(jīng)過熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產(chǎn)生外分泌的腸毒素，那么存在于食物中的腸毒素非常穩(wěn)定，100°c 30min不被破壞，攝入人體后可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，并引起人體的嘔吐、腹瀉等癥狀。2011年我國公布速凍面米制品新國標(biāo)GB19295—2011，金黃色葡萄球菌由原來的不得檢出變?yōu)橄蘖繖z出，因此為了杜絕食品中金黃色葡萄球菌活菌數(shù)合格而腸毒素超標(biāo)的情況，腸毒素的快速檢測對于保障食品安全具有更加重要的意義。
[0004]近年來，ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點(diǎn)越來越多地用于腸毒素的檢測，雖然膠體金試紙條具有操作簡單、穩(wěn)定性高、不需要借助專門儀器、適合現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點(diǎn)，但ELISA比膠體金試紙條具有更好的靈敏度，而且更適合高通量檢測，因此ELISA也具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005](一 )要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，用于食品中SEE的批量、快速檢測。
[0006]( 二 )技術(shù)方案
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E (SEE)的雙抗體夾心法，該方法包括對檢測方法的優(yōu)化。
[0007]其中，單克隆抗體是采用重組SEE經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。
[0008]其中，用于配對的抗體是通過優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對，并通過多次試驗篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。
[0009]其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。LOD達(dá)到0.04ng/mL, R2為0.992。
[0010]本發(fā)明方法的檢測分析原理是:
酶標(biāo)板上包被了包被抗體1E5，即CGMCC N0.7214，合適的濃度下可以最大限度捕獲SEE ;洗板3次，洗去未結(jié)合的包被抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品及對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體2E3-HRP，即CGMCCN0.7215-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色15min。如果樣品中SEE濃度≥0.1ng/mL,那么祥品中SEE被包被抗體1E5捕獲并與酶標(biāo)抗體2E3-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，并被判定為陽性；如果樣品中SEE濃度< 0.1ng/mL那么樣品中SEE不被包被抗體1E5捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性。
[0011](I) SEE單克隆抗體的制備
以重組表達(dá)的SEE (北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，IOyg/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，10 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，8 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測效價，選擇效價最高的老鼠；第八周進(jìn)行沖刺免疫，4 μ g/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進(jìn)行融合。篩選采用間接ELISA進(jìn)行，共篩選到12個細(xì)胞株。
[0012](2)單克隆抗體的配對篩選
將純化后的12株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對。配對參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度50ng/mL，標(biāo)品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用。在此條件下，實(shí)驗成功得到了 6對P/N值>10的配對。
[0013](3)夾心法的建立
選擇檢測限最穩(wěn)定的配對，即以1E5為包被抗體，以2E3作為酶標(biāo)抗體建立夾心法。具體參數(shù)如下:
抗體包被濃度:6 μ g/mL,
包被液:0.01M, pH9.6碳酸鹽緩沖液，
標(biāo)品稀釋液:0.01M、ρΗ7.2的PBS,
檢測抗體濃度:2μ g/mL,
反應(yīng)時間:包被、封閉37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品，37°C，Ih ;檢測抗體37°C，Ih ;顯色15min。
[0014]優(yōu)化后SEE 夾心法，LOD:0.04ng/mL (檢測限 0.1ng/mL)。
[0015](三)有益效果
本發(fā)明提供的檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEE雙抗體夾心法采用了理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可以大量制備的單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，穩(wěn)定性好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測大量樣品，適合食品行業(yè)大規(guī)模、高通量、快速、靈敏的檢測要求，具有推廣和應(yīng)用價值。
[0016]生物材料樣品保藏
1、一株單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞株14號，株號為1E5，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，登記編號為CGMCC N0.7214，保藏曰期為2013年I月23日。
[0017]2、一株單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞株15號，株號為2E3，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，登記編號為CGMCC N0.7215，保藏曰期為2013年I月23日?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0018]圖1金黃色葡萄球菌腸毒素SEE雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方案
[0019]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0020]一、儀器:
TGL — 40B臺式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；
KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司；
ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠；
96孔8X 12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實(shí)驗器材有限公司；
MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司；
可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司；
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠；
二、試劑:
四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；
其他試劑均為分析純試劑；
三、步驟
1.單克隆抗體的制備
1)實(shí)驗動物:選5只8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫；
2)抗原配置:將免疫原用生理鹽水稀釋，配成lmg/mL的溶液；
3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全后皮下多點(diǎn)注射小鼠；
免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價，效價達(dá)到要求后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合；
4)采血:第三次免疫后I周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效
價；
5)融合、篩選:采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，采用間接ELISA篩選陽性細(xì)胞孔，采用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行亞克??；
6)抗體的純化和保存:采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采用微量紫外方法測定其濃度后分裝后放入-20°C保存。
[0021]2、ELISA 反應(yīng)過程:
抗體效價測定步驟:
1)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100μ L/孔，于4 °C冰箱過夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200 UL PBST溶液，搖床上振蕩3 min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同；
2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200μ L/孔，于37 °C溫育箱內(nèi)溫育2 h后取出烘干待用；
3)將陽性血清系列稀釋對應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，100μ L/孔，37 °C孵育I h后洗滌、拍干；4)每孔加入100μ L，1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育I h后洗滌、拍
干;
5)每孔加入100μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37V反應(yīng)15 min，取出后每孔加入50 μ L終止液(2 mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)僅測定吸光值A(chǔ)45。。
[0022]金黃色葡萄球菌腸毒素E雙抗體夾心法測定步驟:
a、包被:用6μ g/mL的1E5包被酶標(biāo)板，100 μ L /孔，4°C過夜；
b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μ L /孔，然后甩干反應(yīng)板，所述PBST為含0.05%吐溫-20的PBS ；
C、封閉:含0.2%酪蛋白酸鈉的0.01M, pH9.6 CBS, 200 μ L /孔，37°C封閉2h ；
d、洗漆:同b;
e、樣品:用樣品稀釋液0.01M，pH7.2 PBS將SEE母液稀釋成0.04，0.12,0.37,1.11，
3.33，10ng/mL系列濃度，另設(shè)一個PBS空白對照。酶標(biāo)板1_6列每孔加入100 μ L系列濃度樣品，第8列加入空白對照，于37°C溫育Ih ；
f、洗漆:同b;
g、加酶標(biāo)抗體(2E3-HRP，2μ g/mL) ,IOOyL / 孔，37°C反應(yīng) Ih ；
h、洗漆:同b;
1、顯色:加顯色液100μ L /孔,顯色15min ；
顯色液應(yīng)在使用前，按照顯色液A:顯色液B體積比=5:1的比例配置使用；
顯色液 A:0.933 g 檸檬酸，3.68 g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30%H202, IOOmL 水；
顯色液B:60 mg四甲基聯(lián)苯胺TMB溶于100 mL乙二醇； j、終止:加2 mol/L硫酸終止液，50 μ L /孔;
k、測定:用酶標(biāo)儀檢測0D45(lnm，繪制SEE雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定時從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上0D45(lnm值對應(yīng)求得樣品中SEE含量。
[0023]3、交叉率的測定
將金黃色葡 萄球菌腸毒素SEA、SEB、SEC、SED母液精確稀釋成10 μ g/mL、100ng/mL，在建立的SEE雙抗體夾心法體系中檢測吸光值，并設(shè)空白孔，每個濃度做6次測定平均值，做3次重復(fù)實(shí)驗；
試驗結(jié)果如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:本實(shí)驗所獲得的抗原檢測的線性范圍是為0.1~10ng/mL，R2=0.992具體請見說明書附圖；
2、LOD:L0D是空白的平均吸收值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的抗原濃度，SEE雙抗體夾心法 LOD 為 0.04ng/mL ；
3、交叉反應(yīng)率(CR%)
結(jié)果:100ng/mL以下金黃色葡萄球菌腸毒素SEE夾心法與腸毒素SEA、SEB、SEC、SED無交叉反應(yīng)，特異性良好，在10 μ g/mL與SEA的交叉反應(yīng)為0.08%。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，金黃色葡萄球菌腸毒素E縮寫為SEE，其特征在于:酶標(biāo)板上包被了包被抗體1E5 JPCGMCC N0.7214，合適的濃度下最大限度捕獲SEE ;洗板3次，洗去未結(jié)合的包被抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品及對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體2E3-HRP:BPCGMCC N0.7215-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色15min ； 樣品中SEE濃度> 0.1ng/mL，樣品中SEE被包被抗體1E5捕獲并與酶標(biāo)抗體2E3-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，被判定為陽性； 樣品中SEE濃度< 0.1ng/mL，樣品中SEE不被包被抗體1E5捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性； (1)SEE單克隆抗體的制備
以北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的重組表達(dá)的SEE為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、細(xì)胞融合、篩選，共篩選到12個細(xì)胞株； (2)單克隆抗體的配對篩選 將純化后的12株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對，配對參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度50ng/mL，標(biāo)品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實(shí)驗成功得到了 6對P/N值>10的配對； (3)夾心法的建立 選擇檢測限最穩(wěn)定的配對，即以1E5為包被抗體，以2E3作為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下: 抗體包被濃度:6 μ g/mL, 包被液:0.01M, pH9.6碳酸鹽緩沖液， 標(biāo)品稀釋液:0.01M、ρΗ7.2的PBS, 檢測抗體濃度:2 μ g/mL, 反應(yīng)時間:包被、封閉37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品，37°C，Ih ;檢測抗體37°C，Ih ;顯色15min ； 優(yōu)化后SEE夾心法，LOD:0.04ng/mL，檢測限0.1ng/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的金黃色葡萄球菌腸毒素E的雙抗體夾心法，其特征在于:測定步驟為: a、包被:用6μ g/mL的1E5包被酶標(biāo)板，100 μ L /孔，4°C過夜； b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μ L /孔，然后甩干反應(yīng)板，所述PBST為含0.05%吐溫-20的PBS ； C、封閉:含0.2%酪蛋白酸鈉的0.01M，pH9.6 CBS, 200 μ L /孔，37°C封閉2h; d、洗漆:同b; e、樣品:用樣品稀釋液0.01M，pH7.2 PBS將SEE母液稀釋成0.04，0.12,0.37,1.11，3.33，10ng/mL系列濃度，另設(shè)一個PBS空白對照，酶標(biāo)板1_6列每孔加入100 μ L系列濃度樣品，第8列加入空白對照，于37°C孵育Ih ； f、洗漆:同b; g、加2 μ g/mL 的酶標(biāo)抗體 2E3-HRP，100 μ L / 孔，37°C孵育 Ih ； h、洗漆:同b;i、顯色:加顯色液IOOyL /孔,顯色15min; 顯色液應(yīng)在使用前，按照顯色液A:顯色液B體積比=5:1的比例配置使用；
顯色液 A:0.933 g 檸檬酸，3.68 g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30%H202, IOOmL 水； 顯色液B:60 mg四甲基聯(lián)苯胺TMB溶于100 mL乙二醇； j、終止:加2 mo I/L硫酸終止液，50 μ L /孔; k、測定:用酶標(biāo)儀檢測0D45(lnm，繪制SEE雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定時從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上0D45( lnm值對應(yīng)求得樣品中SEE含量。
【文檔編號】G01N33/02GK103760311SQ201410019576
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】匡華, 胥傳來, 孔德昭, 馬偉, 徐麗廣, 宋珊珊, 劉麗強(qiáng) 申請人:江南大學(xué)