一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素d的雙抗體夾心法
【專利摘要】一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明應(yīng)用購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的重組金黃色葡萄球菌腸毒素D（SED）免疫8周齡BALB/c小鼠，經(jīng)正常的免疫、細(xì)胞融合、篩選后得到10株SED單克隆抗體。10株抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶并進(jìn)行兩兩配對(duì)。最后選定以5F2（CGMCC?No.7212）、10F1（CGMCC?No.7213）分別為包被抗體和酶標(biāo)抗體，以SED為標(biāo)準(zhǔn)品建立了SED的雙抗體夾心法。LOD為0.006ng/mL，線性范圍0.02-2.5ng/mL。本發(fā)明采用理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可大量制備的單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，成本低，與金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、E無(wú)交叉反應(yīng)，為食品中SED的檢測(cè)提供了快速高效的分析手段。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見(jiàn)的食源性致病菌,雖然近年來(lái)不斷有新型的金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin, SE)被發(fā)現(xiàn),但腸毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。從生牛乳、生肉及乳酪中分離的金黃色葡萄球菌以產(chǎn)生D型腸毒素為主。
[0003]在食品加工過(guò)程中，經(jīng)過(guò)熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產(chǎn)生外分泌的腸毒素，那么存在于食物中的腸毒素非常穩(wěn)定，100°c 30min不被破壞，攝入人體后可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，并引起人體的嘔吐、腹瀉等癥狀。2011年我國(guó)公布速凍面米制品新國(guó)標(biāo)GB19295—2011，金黃色葡萄球菌由原來(lái)的不得檢出變?yōu)橄蘖繖z出，因此為了杜絕食品中金黃色葡萄球菌活菌數(shù)合格而腸毒素超標(biāo)的情況，腸毒素的快速檢測(cè)對(duì)于保障食品安全具有更加重要的意義。
[0004]近年來(lái)，ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點(diǎn)越來(lái)越多地用于腸毒素的檢測(cè)，雖然膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、不需要借助專門(mén)儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，但ELISA比膠體金試紙條具有更好的靈敏度，而且更適合高通量檢測(cè)，因此ELISA也具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005](一 )要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，用于食品中SED的批量、快速檢測(cè)。
[0006]( 二 )技術(shù)方案
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D (SED)的雙抗體夾心法，該方法包括對(duì)檢測(cè)方法的優(yōu)化。
[0007]其中，單克隆抗體是采用重組SED經(jīng)過(guò)特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。
[0008]其中，用于配對(duì)的抗體是通過(guò)優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對(duì)，并通過(guò)多次試驗(yàn)篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。
[0009]其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。LOD達(dá)到0.006ng/mL, R2為0.992。
[0010]本發(fā)明方法的檢測(cè)分析原理是:酶標(biāo)板上包被了包被抗體5F2，即CGMCC N0.7212，合適的濃度下可以最大限度捕獲SED ;洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液200μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品及對(duì)照，37 °C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體10F1-HRP，即CGMCCN0.7213-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色15min。如果樣品中SED濃度^ 0.02ng/mL,那么樣品中SED被包被抗體捕獲并與酶標(biāo)抗體IOFl-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，并被判定為陽(yáng)性；如果樣品中SED濃度< 0.02ng/mL，那么樣品中SED不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號(hào)，被判定為陰性。
[0011](I) SED單克隆抗體的制備
以重組表達(dá)的SED (北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、細(xì)胞融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株；
(2)單克隆抗體的配對(duì)篩選
將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，配對(duì)參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度30ng/mL標(biāo)品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋800倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 11對(duì)P/N值>10的配對(duì)；
(3)夾心法的建立
選擇檢測(cè)限最穩(wěn)定的配對(duì)，即以5F2為包被抗體，以IOFl作為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下:
抗體包被濃度:1 μ g/mL,
包被液:0.01M、pH9.6碳酸鹽緩沖液，
標(biāo)品稀釋液:0.01M、ρΗ7.2的PBS,
檢測(cè)抗體濃度:1 μ g/mL,
反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品，37°C，Ih ;檢測(cè)抗體37°C，Ih ;顯色15min ； 優(yōu)化后 SED 夾心法，LOD:0.006ng/mL，檢測(cè)限 0.02ng/mL。
[0012](三)有益效果
本發(fā)明提供的檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素SED雙抗體夾心法采用了理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可以大量制備的單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，穩(wěn)定性好、成本低，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)檢測(cè)大量樣品，適合食品行業(yè)大規(guī)模、高通量、快速、靈敏的檢測(cè)要求，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。
[0013]生物材料樣品保藏
1、一株單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞株12號(hào)，株號(hào)為5F2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，登記編號(hào)為CGMCC N0.7212，保藏曰期為2013年I月23日。
[0014]2、一株單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞株13號(hào)，株號(hào)為10F1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，登記編號(hào)為CGMCC N0.7213，保藏曰期為2013年I月23日。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1金黃色葡萄球菌腸毒素SED雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方案
[0016]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0017]—、儀器:
TGL — 40B臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；
KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司；
ZD - 9556水平搖床，太倉(cāng)科教器材廠；
96孔8X 12可拆酶標(biāo)板，廈門(mén)怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司；
MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司；
可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司；
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠；
二、試劑:
四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；
其他試劑均為分析純?cè)噭?br> 三、步驟
1、單克隆抗體的制備
1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選5只8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫；
2)抗原配置:將免疫原用生理鹽水稀釋，配成lmg/mL的溶液；
3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全后皮下多點(diǎn)注射小鼠；
免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合；
4)采血:第三次免疫后I周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗血清效
價(jià)；
5)融合、篩選:采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，采用間接ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞孔，采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆；
6)抗體的純化和保存:采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采用微量紫外方法測(cè)定其濃度后分裝后放入-20°C保存。
[0018]2、ELISA 反應(yīng)過(guò)程:
抗體效價(jià)測(cè)定步驟:
1)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100μ L/孔，于4 °C冰箱過(guò)夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200 UL PBST溶液，搖床上振蕩3 min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同；
2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200yL/孔，于37 °C溫育箱內(nèi)溫育2h后取出烘干待用；
3)將陽(yáng)性血清系列稀釋對(duì)應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，100μ L/孔，37 °C孵育I h后洗滌、拍干；
4)每孔加入100μ L，1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育I h后洗滌、拍
干；5)每孔加入100 μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37°C反應(yīng)15 min，取出后每孔加入50 μ L終止液(2 mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)僅測(cè)定吸光值A(chǔ)45。。
[0019]金黃色葡萄球菌腸毒素D雙抗體夾心法測(cè)定步驟:
a、包被:用Iμ g/mL的5F2包被酶標(biāo)板，100 μ L /孔，4°C過(guò)夜；
b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μ L /孔，然后甩干反應(yīng)板，所述PBST為含0.05%吐溫-20的PBS ；
C、封閉:含0.2%明膠的CBS, 200 μ L /孔，37°C封閉2h ；
d、洗漆:同b;
e、樣品:用PBS 將 SED 母液稀釋成 0.01953,0.03976,0.07812,0.1563,0.3125,0.625，1.25，2.5ng/mL系列濃度，另設(shè)一個(gè)PBS空白對(duì)照，每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育Ih ；
f、洗漆:同b;
g、加酶標(biāo)抗體(10F1-HRP,I μ g/mL), 100 μ L / 孔，37°C反應(yīng) Ih ；
h、洗漆:同b;
1、顯色:加顯色液IOOyL/孔,顯色15min;
顯色液應(yīng)在使用前，按照顯色液A:顯色液B體積比=5:1的比例配置使用；
顯色液 A:0.933 g 檸檬酸，3.68 g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30%H202, IOOmL 水；` 顯色液B:60 mg四甲基聯(lián)苯胺TMB溶于100 mL乙二醇； j、終止:加2 mol/L硫酸終止液50 μ L /孔；
k、測(cè)定:用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D45(lnm，繪制SED雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測(cè)定時(shí)從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上0D45(lnm值對(duì)應(yīng)求得樣品中SED含量。
[0020]3、交叉率的測(cè)定
將金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB、SEC、SEE母液精確稀釋成10 μ g/mL、100ng/mL，在建立的SED雙抗體夾心法體系中檢測(cè)吸光值，并設(shè)空白孔，每個(gè)濃度做6次，測(cè)定平均值，做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)；
試驗(yàn)結(jié)果如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:本實(shí)驗(yàn)所獲得的抗原檢測(cè)的線性范圍是為0.02~2.5ng/mL, R2=0.992，具體請(qǐng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖；
2、LOD=LOD是空白的平均吸收值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的抗原濃度，SED雙抗體夾心法 LOD 為 0.006ng/mL ；
3、交叉反應(yīng)率(CR%)
結(jié)果:100ng/mL以下金黃色葡萄球菌腸毒素SED夾心法與腸毒素SEA、SEB、SEC、SEE無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好，在10 μ g/mL與SEE的交叉反應(yīng)為0.06%。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，金黃色葡萄球菌腸毒素D縮寫(xiě)為SED，其特征在于:酶標(biāo)板上包被了包被抗體5F2，即CGMCC N0.7212，合適的濃度下可以最大限度捕獲SED ;洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液200 μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品及對(duì)照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體10F1-HRP，即CGMCC N0.7213-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色15min ； 樣品中SED濃度> 0.02ng/mL,那么樣品中SED被包被抗體捕獲并與酶標(biāo)抗體10F1-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，并被判定為陽(yáng)性； 樣品中SED濃度< 0.02ng/mL，那么樣品中SED不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號(hào)，被判定為陰性； (1)SED單克隆抗體的制備 以北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的重組表達(dá)的SED為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、細(xì)胞融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株； (2)單克隆抗體的配對(duì)篩選 將純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，配對(duì)參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度30ng/mL標(biāo)品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋800倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 11對(duì)P/N值>10的配對(duì)； (3)夾心法的建立 選擇檢測(cè)限最穩(wěn)定的配對(duì)，即以5F2為包被抗體，以IOFl作為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下: 抗體包被濃度:1 μ g/mL, 包被液:0.01M、pH9.6碳酸鹽緩沖液， 標(biāo)品稀釋液:0.01M、ρΗ7.2的PBS, 檢測(cè)抗體濃度:1 μ g/mL, 反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品，37°C，Ih ;檢測(cè)抗體37°C，Ih ;顯色15min ； 優(yōu)化后 SED 夾心法，LOD:0.006ng/mL，檢測(cè)限 0.02ng/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素D的雙抗體夾心法，其特征在于:測(cè)定步驟為: a、包被:用Iμ g/mL的5F2包被酶標(biāo)板，100 μ L /孔，4°C過(guò)夜； b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200μ L /孔，然后甩干反應(yīng)板，所述PBST為含0.05%吐溫-20的PBS ； C、封閉:含0.2%明膠的CBS, 200 μ L /孔，37°C封閉2h ； d、洗漆:同b;
e、樣品:用PBS 將 SED 母液稀釋成 0.01953，0.03976，0.07812，0.1563，0.3125，0.6251.25，2.5ng/mL系列濃度，另設(shè)一個(gè)PBS空白對(duì)照，每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育Ih ； f、洗漆:同b;
g、加I μ g/mL 的酶標(biāo)抗體 IOF1-HRP, 100 μ L / 孔，37°C反應(yīng) Ih ； h、洗漆:同b; l、顯色:加顯色液IOOyL/孔,顯色15min;顯色液應(yīng)在使用前，按照顯色液A:顯色液B體積比=5:1的比例配置使用；
顯色液 A:0.933 g 檸檬酸，3.68 g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30%H202, IOOmL 水； 顯色液B:60 mg四甲基聯(lián)苯胺TMB溶于100 mL乙二醇； j、終止:加2 mo I/L硫酸終止液50 μ L /孔； k、測(cè)定:用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D45(lnm，繪制SED雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測(cè)定時(shí)從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上0D45(lnm值對(duì)應(yīng)求得樣品中SED含量。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK103760351SQ201410019623
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】徐麗廣, 胥傳來(lái), 孔德昭, 匡華, 馬偉, 宋珊珊, 劉麗強(qiáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)