出血性大腸桿菌o157:h7免疫pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測出血性大腸桿菌O157:H7的經(jīng)過特異性抗體包被的PCR反應(yīng)管及免疫PCR檢測試劑盒。所述的PCR反應(yīng)管上預(yù)包被了能特異性富集樣品中出血性大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體。本發(fā)明的檢測試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏地從食品等樣品中檢測出出血性大腸桿菌O157:H7，其靈敏度可達(dá)到103～104cfu/ml，比常規(guī)PCR靈敏度提高10～100倍。本發(fā)明將免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法有機(jī)結(jié)合于一體，可在一個(gè)PCR管中實(shí)現(xiàn)樣品中出血性大腸桿菌O157:H7的富集和檢測，操作簡便，成本低廉，檢測快速，結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說明】出血性大腸桿菌0157:H7免疫PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測出血性大腸桿菌0157:H7的免疫PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]出血性大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)是腸道大腸桿菌的主要血清型，可通過牛肉及其制品、牛奶及其制品、雞肉、蔬菜、水果、飲料、水等傳播。出血性大腸桿菌0157:H7可引起腸炎，受感染病人的典型臨床癥狀為血便、腹痛、低熱或不發(fā)熱，約有10%的病人可發(fā)展成為溶血性尿毒癥及血栓性血小板減少性紫癜，并且可對被感染病人的腸道、肝、脾、腎、淋巴、腦、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。老人和兒童為高危人群，易發(fā)生溶血性尿毒癥，死亡率高達(dá)30%以上。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將出血性大腸桿菌0157:H7腸炎列為新發(fā)傳染病。出血性大腸桿菌0157:H7感染已經(jīng)成為一個(gè)世界性的衛(wèi)生問題。
[0003]目前出血性大腸桿菌0157:H7的檢測主要依賴于國標(biāo)所規(guī)定的生化鑒定，其缺點(diǎn)是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的快速檢測手段，但是檢測產(chǎn)品全部依賴進(jìn)口，我國目前尚無擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，且可運(yùn)用于檢測實(shí)踐的快速檢測產(chǎn)品，該專利以出血性大腸桿菌0157:H7為檢測靶標(biāo)，所要求保護(hù)的技術(shù)涉及出血性大腸桿菌0157:H7快速檢測產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7的PCR反應(yīng)管。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7的免疫PCR檢測試劑盒。
[0006]本發(fā)明的第一方面是提供了一種用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7的PCR反應(yīng)管，所述的PCR反應(yīng)管包括:
[0007]免疫PCR管；和
[0008]包被于所述的免疫PCR管管體內(nèi)壁的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，所述的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610或 3A8F11B10E7, CGMCC N0.8458 產(chǎn)生。
[0009]本發(fā)明的第二方面是提供了一種檢測試劑盒，所述的試劑盒含有所述的PCR反應(yīng)管。
[0010]在一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有容器a，所述的容器a中裝有所述的PCR反應(yīng)管。
[0011 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、陽性對照和陰性對照。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的弓I物包括正向弓I物和反向引物。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的陽性對照為滅活的出血性大腸桿菌0157:H7菌液，所述的陰性對照為滅菌的E.C肉湯。
[0014]本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢將更為明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明的試劑盒的使用流程和原理圖。
[0016]圖2是出血性大腸桿菌0157:H7直接PCR梯度稀釋檢測限研究結(jié)果。
[0017]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；1-8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO8 ?1.04X 10cfu/mL。
[0018]圖3是出血性大腸桿菌0157: H7免疫PCR檢測試劑盒檢測出血性大腸桿菌梯度稀釋檢測限研究結(jié)果。
[0019]其中，M:1OOObp DNA ladder ；N:陰性對照；1-8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO8 ?1.04X 10cfu/mL。
[0020]圖4是檢測試劑盒特異性的結(jié)果。
[0021]其中，M:1000bp DNA ladder ;N:陰性對照；1_12號泳道為:出血性大腸桿菌0157:H7ATCC82346,出血性大腸桿菌0157:H7ATCC82346，金黃色葡萄球菌ATCC27660，鼠氏傷寒沙門氏菌ATCC22956，腸炎沙門氏菌ATCC13076，單增李斯特菌ATCC43251，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC23715，福氏志賀氏菌ATCC12022，宋內(nèi)氏志賀氏菌ATCC25931，痢疾志賀氏菌ATCC51329，乙型溶血性鏈球菌ATCC10373，阪崎腸桿菌ATCC29004。
[0022]圖5是模擬帶菌牛奶樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結(jié)果。
[0023]A (I)模擬帶菌牛奶樣品直接PCR檢測限研究結(jié)果；
[0024]A (2)模擬帶菌牛奶樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0025]其中，M =IOOObp DNA ladder ;N:陰性對照；1號泳道為牛奶樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO2?1.04X 108cfu/mL。
[0026]圖6是模擬帶菌酸奶樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結(jié)果。
[0027]B (I)模擬帶菌酸奶樣品直接PCR檢測限研究結(jié)果；
[0028]B (2)模擬帶菌酸奶樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0029]其中，M =IOOObp DNA ladder ;N:陰性對照；1號泳道為酸奶樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO2?1.04X 108cfu/mL。
[0030]圖7是模擬帶菌香腸樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0031]C (I)模擬帶菌香腸樣品直接PCR檢測限研究結(jié)果；
[0032]C (2)模擬帶菌香腸樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0033]其中，M =IOOObp DNA ladder ;N:陰性對照；1號泳道為香腸樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO2?1.04X 108cfu/mL。
[0034]圖8是模擬帶菌蛋糕樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結(jié)果。
[0035]D (I)模擬帶菌蛋糕樣品直接PCR檢測限研究結(jié)果；
[0036]D (2)模擬帶菌蛋糕樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0037]其中，M =IOOObp DNA ladder ;N:陰性對照；1號泳道為蛋糕樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO2?1.04X 108cfu/mL。[0038]圖9是模擬帶菌果汁樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結(jié)果。
[0039]E (I)模擬帶菌果汁樣品直接PCR檢測限研究結(jié)果；
[0040]E (2)模擬帶菌果汁樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0041]其中，M:1OOObp DNA ladder ;N:陰性對照；1號泳道為果汁樣品(不加菌液);2_8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO2?1.04X 108cfu/mL。
[0042]圖10是模擬帶菌雞蛋樣品免疫PCR試劑盒檢測限研究結(jié)果。
[0043]F(I)模擬帶菌雞蛋樣品直接PCR檢測限研究結(jié)果；
[0044]F (2)模擬帶菌雞蛋樣品免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測限研究結(jié)果；
[0045]其中，M:1000bp DNA ladder ;N:陰性對照；1號泳道為雞蛋樣品(不加菌液)；2_8號泳道對應(yīng)的細(xì)菌濃度為:1.04X IO2?1.04X 108cfu/mL。
[0046]圖11是本發(fā)明的單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖。
[0047]Lanel:Mab05_D10，Lane2:Mab05_F10。
【具體實(shí)施方式】
[0048]本發(fā)明人的研究表明，以出血性大腸桿菌0157:H7作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得到抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7，其抗體效價(jià)可達(dá)到1:100000，其能夠特異性、高效地與出血性大腸桿菌0157:H7結(jié)合，檢測靈敏度達(dá)到IO5Cf u/ml。與單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、其他大腸桿菌等共計(jì)76種病原細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。
[0049]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)而將致病菌免疫富集技術(shù)和基因水平檢測技術(shù)有效結(jié)合，即先用本發(fā)明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體將待測樣品中的病原菌特異性免疫富集，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而提供了一種可快速、高效檢測食源性出血性大腸桿菌0157:H7的檢測試劑盒。
[0050]抗體
[0051]本發(fā)明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體可以利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系GS2-D3 (CGMCC N0.6610)或 3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)分泌產(chǎn)生。本發(fā)明包括具有抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3或3A8F11B10E7的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括:藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
[0052]對于本發(fā)明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測定?？钩鲅源竽c桿菌0157:H7單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region, Q)R)特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其⑶R與抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab ‘)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0053]本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以用常規(guī)技術(shù)，利用雜交瘤細(xì)胞系 GS2-D3(CGMCC N0.6610)或 3A8F11B10E7(CGMCC N0.8458)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0054]一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0055]此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0056]目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。
[0057]本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0058]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。
[0059]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如出血性大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaClJi處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可運(yùn)用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
[0060]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0061]在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 ο
[0062]本發(fā)明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7，其效價(jià)高(可以達(dá)到1:100000)，能夠特異性地、高效地檢測出血性大腸桿菌0157:H7，與單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、其他大腸桿菌等共計(jì)76種病原細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，此為本發(fā)明的最大創(chuàng)新點(diǎn)。
[0063]檢測試劑盒
[0064]本發(fā)明人根據(jù)免疫PCR的原理，制備了一種可用于檢測樣品中出血性大腸桿菌0157:H7的試劑盒，即先用本發(fā)明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3或3A8F11B10E7將待測樣品中的病原菌特異性地免疫富集，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以提高檢測的靈敏度和特異性。
[0065]具體而言，本發(fā)明首先是提供了一種用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7的PCR反應(yīng)管，它包括免疫PCR管和包被于所述免疫PCR管管體內(nèi)壁的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3或3A8F11B10E7，所述的抗出血性大腸桿菌0157: H7單克隆抗體GS2-D3和 3A8F11B10E7 分別由小鼠雜交瘤細(xì)胞系 GS2-D3，CGMCC N0.6610 或 3A8F11B10E7,CGMCCN0.8458 分泌產(chǎn)生。
[0066]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)而提供了一種出血性大腸桿菌0157:H7免疫PCR檢測試劑盒，它含有上述用于檢測出血性大腸桿菌0157: H7的PCR反應(yīng)管；
[0067]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還裝載有容器a，所述的容器a可以是自封袋或者其他形式的容器，其中裝有本發(fā)明的包被有抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體 GS2-D3 或 3A8F11B10E7 的 PCR 反應(yīng)管。
[0068]此外，為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測時(shí)更方便，所述的本發(fā)明的試劑盒中優(yōu)選地還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是免疫PCR檢測試劑盒中常規(guī)使用的一些試齊U，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于):緩沖液(IOXPCR Buffer)、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20 (滅菌雙蒸水)、引物等常規(guī)PCR反應(yīng)試劑。10XPCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20與常規(guī)的免疫PCR檢測試劑盒中的所用的試劑相同。同時(shí)，為了消除假陽性和假陰性，還可在PCR檢測過程中設(shè)置質(zhì)控(對照)，即在本發(fā)明的試劑盒中還包含有陰性對照和陽性對照等。較佳地，所述的陽性對照溶液為滅活的出血性大腸桿菌0157:H7菌液，陰性對照溶液為滅菌的E.C肉湯m (EC)η。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，上述試劑和溶液可分別裝載于EP管或試劑瓶中。
[0069]此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。
[0070]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157:Η7免疫PCR檢測試劑盒集病原菌濃縮、特異性抗體識別以及PCR擴(kuò)增為一體，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高以及檢測快速、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了現(xiàn)有食源性致病菌檢測技術(shù)費(fèi)時(shí)耗力、靈敏度低的不足。
[0071]本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157:Η7免疫PCR檢測試劑盒適用于菌株快速鑒定、食品中食源性致病菌檢測等諸多領(lǐng)域，尤其適用于樣品中微量病原體的快速檢測?？晒┵|(zhì)監(jiān)部門、進(jìn)出口檢疫部門等用于檢測食樣中的出血性大腸桿菌0157:Η7。
[0072]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0073]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。[0074]實(shí)施例1.抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7的制備
[0075]一、免疫原和陽性標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
[0076]出血性大腸桿菌0157:H7 (ATCC43895)接種在山梨醇麥康凱(SMAC)平板上，37°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落于滅菌的E.C肉湯，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)17h，計(jì)數(shù)，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I(lǐng)天。用生理鹽水調(diào)整出血性大腸桿菌0157:H7 (ATCC43895)濃度至5X109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調(diào)整濃度為108cfu/ml出血性大腸桿菌0157:H7菌液作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，滅菌的E.C肉湯為陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0077]二、單克隆抗體的制備
[0078]I)實(shí)驗(yàn)動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動物。
[0079]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強(qiáng)注射一次。
[0080]3)采血:3次加強(qiáng)免疫后從尾部靜脈采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價(jià)。待效價(jià)不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0081]4)細(xì)胞融合:取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%PEG作用下常規(guī)融合，分別接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0082]5)雜交瘤細(xì)胞篩選:采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法，篩選強(qiáng)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0083]6)克隆培養(yǎng)及抗體制備:用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿孔底1/10時(shí)，再用同樣方法檢測，將強(qiáng)陽性孔再克隆，如此反復(fù)3 — 4次，直至陽性率達(dá)到100%。將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7?10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化抗體。
[0084]三、單克隆抗體的效價(jià)測定
[0085]Escherichia coli 大腸埃希氏菌培養(yǎng)基-國標(biāo):GB4789.38-2012
[0086]EC 肉湯(E.coli broth)
[0087]成分:胰蛋白胨或胰酪胨20.0g，3號膽鹽或混合膽鹽1.5g，乳糖5.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4) 4.0g,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5g，氯化鈉 5.0g,
[0088]蒸餾水1000.0mL
[0089]制法:將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH6.9±0.1，121°C高壓滅菌15min。
[0090]單克隆抗體效價(jià)測定方法:
[0091](I)將飽和培養(yǎng)細(xì)菌抗原連同培養(yǎng)基在對應(yīng)的孔中加入100μ 1，4°C過夜(約包板36h)。
[0092](2)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0093](3)每個(gè)孔中加 100 μ 11%BSA，37°C封閉 lh。
[0094](4)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0095](5)每個(gè)孔中加100μ I血清，37°C孵育lh。
[0096](6)倒空液體并拍干殘留液體，每個(gè)孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0097](7)每個(gè)孔中50μ I的HRP標(biāo)記的二抗(sigma)，室溫孵育lh。
[0098](8)用洗滌液浸泡5min，倒空液體并拍干殘留液體，每個(gè)孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0099](9)每個(gè)孔中加100 μ I底物，顯色30min，加終止液100 μ I并立即在OD45tl讀數(shù)。
[0100]表1.兩株單克隆抗體效價(jià)測定結(jié)果(OD45tl)
[0101]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測出血性大腸桿菌0157: H7的PCR反應(yīng)管，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)管包括: 免疫PCR管；和 包被于所述的免疫PCR管管體內(nèi)壁的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，所述的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610或3A8F11B10E7, CGMCC N0.8458 產(chǎn)生。
2.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)管。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有容器a，所述的容器a中裝有如權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)管。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、陽性對照和陰性對照。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物包括正向引物和反向引物。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照為滅活的出血性大腸桿菌0157:H7菌液，所述的陰性對照為滅菌的EC肉湯。
【文檔編號】G01N33/569GK103823060SQ201410028254
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】劉箐, 方水琴 申請人:上海理工大學(xué)