一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑及其用途。通過(guò)γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)和血清酶聯(lián)免疫方法，公開(kāi)了一種結(jié)核桿菌免疫陽(yáng)性試劑Rv0733，包括抗原或多肽及其類(lèi)似物，用于檢測(cè)結(jié)核病患者特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平。用本發(fā)明試劑免疫小鼠后，小鼠能產(chǎn)生特異性的γ干擾素等細(xì)胞因子及抗體。利用本發(fā)明體外刺激結(jié)核病人或正常人群T細(xì)胞，檢測(cè)γ干擾素釋放細(xì)胞的數(shù)量或培養(yǎng)上清中γ干擾素含量，能區(qū)分結(jié)核病人及正常人群；通過(guò)檢測(cè)外周血清中抗本發(fā)明的特異性抗體的水平，可提高結(jié)核病患者的檢測(cè)靈敏度和特異性；利用跟蹤結(jié)核病患者治療過(guò)程中Rv0733特異性免疫應(yīng)答對(duì)比實(shí)驗(yàn)，能揭示結(jié)核病人的臨床預(yù)后情況。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是全球三大傳染性疾病之一，2011年，WHO估測(cè)中國(guó)結(jié)核病總病例140萬(wàn)人，占全球1200萬(wàn)總病例中的11.67%，僅次于印度的310萬(wàn)(25.83% )，位居全球第二，其中新發(fā)病例91.2萬(wàn)，死亡4.7萬(wàn)人。結(jié)核病給我國(guó)造成了巨大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。
[0003]隨著研究的不斷深入，結(jié)核病的臨床診斷方法有了較大的發(fā)展，但是在診斷的特異性和敏感性方面還存在一定不足，需要加以改進(jìn)。免疫學(xué)檢測(cè)方法是現(xiàn)階段檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的重要輔助方法之一，其中以抗原特異性刺激后的Y干擾素釋放實(shí)驗(yàn)(IGRA)為主?，F(xiàn)有的商業(yè)試劑盒有T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-1T。其中，T-spot.TB使用的抗原是 ESAT-6 和 CFP-10，而 QuantiFERON(QFT) -1T 使用的抗原是 ESAT-6、CFP_10 和 TB7.7。這些抗原都由結(jié)核分枝桿菌特異性的RD (Region of Difference)區(qū)基因編碼,能較好地避免已接種的BCG (卡介苗)的干擾。
[0004]然而，現(xiàn)有報(bào)道表明ESAT-6，CFP-10和TB7.7等基因主要表達(dá)于結(jié)核分枝桿菌的早期感染階段，而且其他非結(jié)核分枝桿菌類(lèi)的M.kansasii, M.szulgai, M.marinum或M.gordonae等也表達(dá)ESAT-6，CFP-10或TB7.7，所以當(dāng)患者感染此類(lèi)細(xì)菌時(shí)會(huì)出現(xiàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。而且已有文獻(xiàn)表明我國(guó)人群存在較嚴(yán)重的非結(jié)核分枝桿菌感染情況，所以T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-1T在我國(guó)結(jié)核病診斷應(yīng)用中的效果不理想，表現(xiàn)為其檢測(cè)的敏感性和特異性介于80% — 90%之間，而且這二個(gè)試劑盒在結(jié)核病的臨床預(yù)后跟蹤后的檢測(cè)價(jià)值較差。
[0005]因此新的T細(xì)胞反應(yīng)性抗原的篩選，是提高結(jié)核病患者的診斷準(zhǔn)確性及臨床預(yù)后觀察的新策略。人體在感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞。體外用相同的抗原再次刺激機(jī)體T細(xì)胞時(shí)，能檢測(cè)到大量的Y干擾素等細(xì)胞因子或分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，從而能區(qū)分出正常健康人和被結(jié)核分枝桿菌感染的人群。在臨床針對(duì)性治療進(jìn)程中，隨著患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌量會(huì)下降和病原抗原的消失，體內(nèi)的抗原特異性T細(xì)胞會(huì)發(fā)生大量凋亡而進(jìn)入收縮期，只保留少數(shù)的抗原特異性T細(xì)胞存在于體內(nèi)，所以，在體外用抗原刺激不同治療階段的患者T細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞因子的分泌量或分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量與治療前相比都會(huì)下降，并與疾病的緩解相一致，因而具有較好的臨床預(yù)后價(jià)值。同時(shí)BCG表達(dá)的抗原與結(jié)核分枝桿菌毒性株中特有的抗原相比其安全性高。所以具有更好的亞單位或重組疫苗的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種新的用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑。[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供上述試劑的用途。
[0008]在本發(fā)明的一方面，提供一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑，包括Rv0733 (Adenylate kinase, ADK)抗原或多肽或其類(lèi)似物；所述Rv0733抗原的氨基酸序列從N端到C端如下:
[0009]VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGKjn SEQ ID NO:1 所示；
[0010]本發(fā)明中，所述多肽為一種氨基酸聚合物，其長(zhǎng)度包含但不限于20個(gè)氨基酸殘基。所述其類(lèi)似物為與其同源性在75%以上的多肽及經(jīng)過(guò)天然或人工修飾后的氨基酸聚合物。所述多肽為編號(hào)ADK0-ADK16的氨基酸聚合物，其氨基酸順序從N端到C端列于下:
[0011]ADKO:VRVLLLGPPG AGKGTQAVKLjn SEQ ID NO:2 所示；
[0012]ADKl:AGKGTQAVKL AEKLGIPQIS，如 SEQ ID NO: 3 所示；
[0013]ADK2:AEKLGIPQIS TGELFRRNIE，如 SEQ ID N0:4 所示；
[0014]ADK3:TGELFRRNIE EGTKLGVEAKjn SEQ ID NO:5 所示；
[0015]ADK4:EGTKLGVEAK RYLDAGDLVPjn SEQ ID NO:6 所示；
[0016]ADK5:RYLDAGDLVP SDLTNELVDD，如 SEQ ID NO: 7 所示； [0017]ADK6:SDLTNELVDD RLNNPDAANGjn SEQ ID NO:8 所示；
[0018]ADK7:RLNNPDAANG FILDGYPRSVjn SEQ ID NO:9 所示；
[0019]ADK8:FILDGYPRSV EQAKALHEMLjn SEQ ID NO: 10 所示；
[0020]ADK9:EQAKALHEML ERRGTDIDAVjn SEQ ID NO: 11 所示；
[0021]ADKlO:ERRGTDIDAV LEFRVSEEVL，如 SEQ ID NO: 12 所示；
[0022]ADKll:LEFRVSEEVL LERLKGRGRA，如 SEQ ID NO: 13 所示；
[0023]ADK12:LERLKGRGRA DDTDDVILNRjn SEQ ID NO: 14 所示；
[0024]ADK13:DDTDDVILNR MKVYRDETAPjn SEQ ID NO: 15 所示；
[0025]ADK14:MKVYRDETAP LLEYYRDQLK，如 SEQ ID NO: 16 所示；
[0026]ADK15:LLEYYRDQLK TVDAVGTMDE，如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0027]ADK16:TVDAVGTMDE VFARALRALG K，如 SEQ ID NO: 18 所示。
[0028]本發(fā)明中所述多肽可通過(guò)化學(xué)合成得到，也可通過(guò)基因工程技術(shù)得到，此技術(shù)為行業(yè)內(nèi)所熟悉。
[0029]本發(fā)明所述抗原可以天然分離得到，也可以通過(guò)克隆技術(shù)和基因工程的方法獲得融合蛋白，此技術(shù)為行業(yè)內(nèi)所熟悉。
[0030]在本發(fā)明的另一方面，提供該試劑的用途，包括:本發(fā)明所述抗原或多肽可用于制備檢測(cè)結(jié)核菌感染的試劑，此試劑可包含部分或全部蛋白質(zhì)氨基酸序列。本發(fā)明所述抗原或多肽可用于制備結(jié)核亞單位疫苗或用于重組結(jié)核疫苗開(kāi)發(fā)。本發(fā)明所述試劑可用于區(qū)分臨床中不同類(lèi)型的結(jié)核病，如單純肺結(jié)核與肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核。
[0031]本發(fā)明所述結(jié)核分枝桿菌感染人群包括有臨床癥狀的活動(dòng)性結(jié)核病人和無(wú)癥狀的潛伏感染者。此處臨床癥狀包括但不限于發(fā)熱，咳嗽，胸痛，咳血，胸片異常等。
[0032]本發(fā)明所述釋放Y干擾素的細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞和T細(xì)胞依賴(lài)性的可釋放Y干擾素的細(xì)胞，如自然殺傷(NK)細(xì)胞。[0033]本發(fā)明所述T細(xì)胞包括但不限于⑶4 +T細(xì)胞，⑶8 +T細(xì)胞和Y δΤ細(xì)胞。
[0034]一種體外檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法，主要通過(guò)使用Rv0733抗原或多肽體外刺激T細(xì)胞，并檢測(cè)釋放Y干擾素細(xì)胞的數(shù)量或培養(yǎng)上清中Y干擾素含量，確定結(jié)核分枝桿菌的感染情況。
[0035]本發(fā)明還公開(kāi)了一種新的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法，主要基于檢測(cè)抗原特異性的抗體或抗原依賴(lài)性的Y干擾素等細(xì)胞因子的分泌量。
[0036]本發(fā)明公開(kāi)了一種體外檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法，通過(guò)ELISA的方法，檢測(cè)結(jié)核病人或正常人外周血中本發(fā)明所述試劑的特異性抗體的含量，確定結(jié)核分枝桿菌的感染情況。
[0037]本發(fā)明公開(kāi)了一種體外檢測(cè)臨床結(jié)核病特異性治療效果的方法，主要通過(guò)使用Rv0733抗原或多肽體外刺激T細(xì)胞，并檢測(cè)釋放Y干擾素細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)上清中Y干擾素含量，確定結(jié)核病人的臨床預(yù)后情況。
[0038]此處檢測(cè)方法包括但不限于:ELISP0T、ELISA、LUMINEX、細(xì)胞增殖、胞內(nèi)染色和免疫雜交等。此檢測(cè)方法中T細(xì)胞來(lái)源包含但不限于:血液、胸水、肺泡灌洗液、淋巴液及其它含有T細(xì)胞的生物樣本。此檢測(cè)方法中釋放Y干擾素的細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞和T細(xì)胞依賴(lài)性的可釋放Y干擾素的細(xì)胞，如自然殺傷(NK)細(xì)胞。
[0039]本發(fā)明實(shí)施方案之一中，采用ELISP0T(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)，原理:用抗體捕獲培養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái))的方法，檢測(cè)活動(dòng)期結(jié)核病患者外周淋巴細(xì)胞體外經(jīng)本發(fā)明所述試劑刺激后Y干擾素對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)數(shù),每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌Y干擾素的細(xì)胞，用以區(qū)分結(jié)核病患者和正常人；通過(guò)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中活動(dòng)性結(jié)核病人的本發(fā)明所述試劑刺激`后的特異性刺激后釋放Y干擾素的細(xì)胞數(shù)量，反映治療的有效性，即預(yù)后情況。
[0040]本發(fā)明實(shí)施方案之二中，通過(guò)檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病患者外周針對(duì)本發(fā)明所述試劑的特異性抗體水平，用以活動(dòng)期結(jié)核病患者的血清學(xué)輔助診斷。
[0041]本發(fā)明實(shí)施方案之三中，通過(guò)用本發(fā)明所述試劑免疫小鼠，用ELISA的方法，檢測(cè)體外經(jīng)本發(fā)明所述試劑刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)后的Y干擾素的釋放量，和本發(fā)明實(shí)施方案之四中小鼠外周血血漿或血清中特異性抗體水平，反映出本發(fā)明所述試劑的免疫原性，用以將本發(fā)明所屬試劑作為結(jié)核亞單位疫苗的前期實(shí)驗(yàn)階段數(shù)據(jù)支持。
[0042]本發(fā)明所述試劑和方法能有效地檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病人和潛伏感染者，并且操作簡(jiǎn)單，易于推廣。
[0043]本發(fā)明的臨床樣本來(lái)自于結(jié)核病人和健康人群?；谌?whole blood)或用Ficoll密度梯度分離法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的Y干擾素釋放實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，Rv0733能很好的區(qū)分結(jié)核病人和正常人群，敏感性和特異性分別為94.94%和95.24%。
[0044]經(jīng)過(guò)前期對(duì)結(jié)核分枝桿菌中表達(dá)的大量T細(xì)胞特異性應(yīng)答的抗原篩選工作，本發(fā)明公開(kāi)了一種試劑(Rv0733)和方法能很好的區(qū)分結(jié)核患者和正常對(duì)照人群，其敏感性和特異性分別為94.94%和95.24%。并且本發(fā)明所述試劑和方法用于臨床預(yù)后觀察時(shí)，在治療一個(gè)月后即有顯著差異，P〈0.05。小鼠實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例3和實(shí)施例4)表明，本發(fā)明所述試劑能在小鼠體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答，預(yù)示其具有良好的疫苗開(kāi)發(fā)潛力。[0045]用本發(fā)明所述試劑免疫小鼠后，小鼠能產(chǎn)生特異性的Y干擾素等細(xì)胞因子及抗體。利用本發(fā)明體外刺激結(jié)核病人或正常人群T細(xì)胞，檢測(cè)其中Y干擾素釋放細(xì)胞的數(shù)量或培養(yǎng)上清中Y干擾素含量，能區(qū)分出結(jié)核病人及正常人群；通過(guò)檢測(cè)外周血清中抗本發(fā)明的特異性抗體的水平，可以提高結(jié)核病患者的檢測(cè)靈敏度和特異性；利用跟蹤結(jié)核病患者治療過(guò)程中的Rv0733特異性免疫應(yīng)答對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明能揭示出結(jié)核病人的臨床預(yù)后情況。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中Rv0733融合蛋白的SDS — PAGE示意圖。
[0047]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中結(jié)核病人及正常對(duì)照人群外周血PBMC中Rv0733特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量比較示意圖。
[0048]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中治療過(guò)程中活動(dòng)性結(jié)核病人外周血PBMC中Rv0733特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量的變化示意圖。
[0049]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中結(jié)核病人及正常對(duì)照人群外周血中Rv0733特異性抗體含量的示意圖。
[0050]圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中經(jīng)Rv0733抗原免疫二周后，小鼠外周血PBMC經(jīng)Rv0733刺激后Y干擾素的釋放量的示意圖。
[0051]圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中經(jīng)Rv0733抗原免疫二周后，小鼠外周血中Rv0733特異性抗體含量的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052]以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)行示例，其中所用試劑均可通過(guò)市場(chǎng)渠道購(gòu)買(mǎi)，如有未盡之處，可以參考相應(yīng)的PCR和基因測(cè)序的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。本發(fā)明所述實(shí)施方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0053]實(shí)施例1:結(jié)核分枝桿菌Rv0733多肽及抗原的制備。
[0054]一、Rv0733融合蛋白(抗原)的制備實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:
[0055]1.用PCR方法從結(jié)核分枝桿菌DNA中克隆Rv0733基因，經(jīng)測(cè)序后，將基因片段插入E.coli表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，構(gòu)建獲得pET28a_Rv0733原核表達(dá)質(zhì)粒。
[0056]2.將pET28a-Rv0733原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)，構(gòu)建表達(dá)工程菌。
[0057]3.用 0.4mM IPTG 于 30°C，220rpm,誘導(dǎo)表達(dá) 3h。
[0058]4.超聲裂解菌體并于離心后收集上清蛋白液。
[0059]5.用N1-NTA磁珠純化獲得Rv0733融合蛋白。
[0060]6.融合蛋白濃度用BCA (Pierce, 23227)方法進(jìn)行檢測(cè)，并保存于一 80°C冰箱。
[0061]7.蛋白純度和濃度用SDS - PAGE方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0062]8.經(jīng)測(cè)序，該Rv0733融合蛋白(抗原)的氨基酸序列從N端到C端如下: [0063]VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGK，如 SEQ ID NO:1 所示。
[0064]二、Rv0733多肽編號(hào)分別為從ADKO到ADK16多肽氨基酸順序從N端到C端列于下，Rv0733多肽可用常規(guī)化學(xué)合成方法獲得，該方法為行業(yè)內(nèi)所熟悉。
[0065]ADKO:VRVLLLGPPG AGKGTQAVKL，如 SEQ ID NO: 2 所示；
[0066]ADKl:AGKGTQAVKL AEKLGIPQIS，如 SEQ ID NO: 3 所示；
[0067]ADK2:AEKLGIPQIS TGELFRRNIE，如 SEQ ID N0:4 所示；
[0068]ADK3:TGELFRRNIE EGTKLGVEAK，如 SEQ ID NO:5 所示；
[0069]ADK4:EGTKLGVEAK RYLDAGDLVP，如 SEQ ID NO: 6 所示；
[0070]ADK5:RYLDAGDLVP SDLTNELVDD，如 SEQ ID NO:7 所示；
[0071]ADK6:SDLTNELVDD RLNNPDAANG，如 SEQ ID NO: 8 所示；
[0072]ADK7:RLNNPDAANG FILDGYPRSV，如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0073]ADK8:FILDGYPRSV EQAKALHEML，如 SEQ ID NO: 10 所示；
[0074]ADK9:EQAKALHEML ERRGTDIDAV，如 SEQ ID NO: 11 所示；
[0075]ADKlO:ERRGTDIDAV LEFRVSEEVL，如 SEQ ID NO: 12 所示；
[0076]ADKll:LEFRVSEEVL LERLKGRGRA，如 SEQ ID NO: 13 所示；
[0077]ADK12:LERLKGRGRA DDTDDVILNR，如 SEQ ID NO: 14 所示；
[0078]ADK13:DDTDDVILNR MKVYRDETAP，如 SEQ ID NO: 15 所示；
[0079]ADK14:MKVYRDETAP LLEYYRDQLK，如 SEQ ID NO: 16 所示；
[0080]ADK15:LLEYYRDQLK TVDAVGTMDE，如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0081]ADK16:TVDAVGTMDE VFARALRALG K，如 SEQ ID NO: 18 所示。
[0082]實(shí)施例2:ELISP0T檢測(cè)Rv0733及其抗原肽刺激后的特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量
[0083]實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:
[0084]1.用 IFN— Y 抗體包被 ELISP0T 用 96 孔 PVDF 板(MiIlipore MSIPS4510), 4°C過(guò)夜。
[0085]2.用每孔 200μ1 PBS 或 RPMI1640 洗滌 3 次，用含有 10% FBS 的 RPMI1640 于 37°C封閉I小時(shí)。
[0086]3.肝素鈉，檸檬酸鈉或EDTA 二鉀抗凝管收集結(jié)核病患者或正常對(duì)照人群外周約5毫升。
[0087]4.用Ficoll密度梯度離心法，lOOOXg，18-22°C，離心22min。分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。
[0088]5.PBMC 用 5 — IOml PBS 或 RPMI1640 洗滌 2 次并重懸于含 10% FBS 的 RPMI1640中，計(jì)數(shù)，度調(diào)整至終濃度2.5 X IO6CelΙ/ml。
[0089]6.封閉后的ELISP0T板中每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，即0.25million細(xì)胞每孔。實(shí)驗(yàn)孔中加入抗原或多肽，抗原或單條多肽終濃度為10 μ g/ml，多肽庫(kù)中每條多肽終濃度為2 μ g/ml。陽(yáng)性對(duì)照孔加入2.5 μ g/ml PHA,陰性孔加入相同體積的含10% FBS的RPMI1640。
[0090]7.于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)，37°C，5% CO2,100%濕度。
[0091]8.每孔250 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100 μ I生物素標(biāo)記的IFN - Y抗體。用96孔板封口膜封閉各孔，37°C，孵育I小時(shí)。
[0092]9.每孔250 μ I含0.05 % Tween-20的PBS洗滌5次，每孔加入100 μ I親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP )。37 °C，孵育I小時(shí)。
[0093]10.每孔 250 μ I 含 0.05 % Tween-20 的 PBS 洗滌 5 次，每孔加入 100 μ I AEC 顯色
液，室濕顯色30分鐘。
[0094]11.用蒸餾水沖洗以終止反應(yīng)。并用蒸餾水洗滌5次，閉光于室溫過(guò)夜涼干或37°C 2-4小時(shí)烘干。
[0095]12.用酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，設(shè)置75 μ m為分界值。ROC曲線分析表明，Rv0733抗原區(qū)分結(jié)核病人和正常人群的敏感性和特異性分別為94.94%和95.24%。肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核病人外周血中Rv0733抗原特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量比單純肺結(jié)核病人顯著增多。結(jié)果見(jiàn)圖2a到圖2c。利用多肽合成的方法，我們分析了 ADK的T細(xì)胞表位分布結(jié)果見(jiàn)圖2d。圖2顯示了結(jié)核病患者及正常對(duì)照人群外周血PBMCs中Rv0733特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞表位分布。其中，圖2a顯示了 Rv0733融合蛋白體外刺激結(jié)核病人及正常人外周血PBMCs后IFN — Y斑點(diǎn)數(shù)比較，水平線代表mean土SD。圖2b，的ROC曲線分析Rv0733區(qū)分結(jié)核病人與正常人的敏感性和特異性。圖2c顯示Rv0733融合蛋白體外刺激單純肺結(jié)核及肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核病人外周血PBMCs后IFN — Y斑點(diǎn)數(shù)比較，水平線代表mean土SD。圖2d是ADK抗原中T細(xì)胞表位分布圖，水平線代表平均值。多肽序列為從N端到C端依次用化學(xué)方法合成，編號(hào)分別為從ADKO到ADK16。每條20個(gè)氨基酸，相鄰二條間10個(gè)氨基酸重疊，最后一條即ADK16為21個(gè)氨基酸。SFU/250，000:每250000個(gè)細(xì)胞為斑點(diǎn)形成單位(spot forming unit per250, OOOcells)。AUC:曲線下面積(area under curve)。95%01:95%置信區(qū)間(confidence intervalXP:假定值(P value)。pulmonary:單純肺結(jié)核病人。pulmonary/bronchial:肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核病人。errorbar: mean土 SD。***:Ρ〈0.001, *:Ρ〈0.05。
[0096]13.在不同治療時(shí)間點(diǎn)(0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9月)收集結(jié)核病人的外周血樣本，用ELISP0T方法可監(jiān)測(cè)結(jié)核病人體內(nèi)RV0733抗原特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量。可反映臨床治療情況。結(jié)果表明有效地治療I個(gè)月后，結(jié)核病人體內(nèi)Rv0733抗原特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量會(huì)顯著下降，見(jiàn)圖3。圖3顯示臨床治療過(guò)程中結(jié)核病人外周血PBMCs中Rv0733特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量的變化。在不干預(yù)臨床治療的條件下，分別于特定時(shí)間點(diǎn)收集相同一患者外周血，分離獲得PBMCs并在體外經(jīng)Rv0733抗原刺激，監(jiān)測(cè)不同治療過(guò)程中結(jié)核病人外周血Rv0733特異性Y干擾素釋放細(xì)胞數(shù)量。水平橫線代表平均值。統(tǒng)計(jì)分析各時(shí)間點(diǎn)與未治療時(shí)間點(diǎn)(Omonth)的差異。*:Ρ〈0.05。
[0097]實(shí)施例3 =ELISA結(jié)核病人及正常對(duì)照人群外周血中Rv0733特異性抗體量檢測(cè)。
[0098]實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:
[0099]1.用 lyg/ml Rv0733 融合蛋白包被 ELISA96 孔板(Corning9018)，4°C，過(guò)夜。
[0100]2.棄上清液，每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次，每次于吸水紙上
拍干。
[0101]3.用含1%明膠的卩85，371:，封閉I小時(shí)。
[0102]4.每孔 300 μ I 含 0.05% Tween-20 的 PBS (PBST)洗滌 5 次。每孔加入 1:100 稀釋的結(jié)核病人或正常人外周血血漿100 μ 1，稀釋液為含1%明膠的PBST。37°C，孵育I小時(shí)。
[0103]5.每孔300μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌6次。每孔加入100μ I用1%明膠的PBST稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體，370C，孵育I小時(shí)。
[0104]6.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌6次。每孔加入100 μ I TMB顯色液，室溫避光顯色15分鐘。
[0105]7.每孔加入50 μ 12Ν硫酸終止反應(yīng)。
[0106]8.分光光度計(jì)于450nm讀取吸光度(OD)值。結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4顯示ELISA檢測(cè)結(jié)核病人及正常對(duì)照人群外周血血漿中Rv0733特異性抗體含量。血漿稀釋度為100倍稀釋。水平線代表 mean 土 SD。*#:Ρ〈0.001。
[0107]實(shí)施例4 =ELISA檢測(cè)Rv0733抗原在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫原性。
[0108]實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:
[0109]1.每只6 — 8周的C57BL/6小鼠每次背部皮下注射經(jīng)dioctadecylammoniumbromide (DDA, D2779SIGMA)和 monophosphoryl lipid A (MPL，L6638SIGMA)乳化的 Rv0733融合蛋白10 μ g，用PBS補(bǔ)充至總體積200 μ I?？偣?-12只小鼠。每隔2周免疫一次，總
共三次。
[0110]2.最后一次免疫后二周，取小鼠外周血，用Ficoll分離獲得PBMC。
[0111]3.PBMC 用 5 — 10ml PBS 或 RPMI1640 洗滌 2 次。PBMC 重懸于含 10 % FBS 的 RPMI1640中，計(jì)數(shù)，度調(diào)整至終濃度2.5 X IO6CelΙ/ml。
[0112]4.于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，即0.25 X IO6細(xì)胞/孔。
`[0113]5.每孔加入終濃度10 μ g/ml的Rv0733融合蛋白或覆蓋全蛋白的多肽庫(kù)，每條多肽終濃度為2 μ g/ml。陽(yáng)性對(duì)照孔加入5 μ g/ml CoA,陰性孔加入相同體積的含10% FBS的RPMI1640。用含10% FBS的RPMI1640補(bǔ)充至每孔200 μ I體積。
[0114]6.于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，37°C，5% C02，100%濕度。
[0115]7.用抗小鼠IFN — Y抗體包被ELISA用96孔板(Corning9018)，4°C過(guò)夜。
[0116]8.每孔 300μ I 含 0.05% Tween-20 的 PBS 洗滌 5 次。每孔加入 200 μ I ELISA 稀釋液(ebioscience, 00-4202-56)室溫封閉 I 小時(shí)。
[0117]9.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)上清液，或者小鼠IFN - Y標(biāo)準(zhǔn)品。空白孔加入100 μ I ELISA稀釋液，室溫孵育2小時(shí)。
[0118]10.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100 μ I生物素標(biāo)記的抗鼠IFN — Y抗體，室溫孵育I小時(shí)。
[0119]11.每孔300μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100μ1親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP)，室溫孵育I小時(shí)。
[0120]12.每孔 300 μ I 含 0.05% Tween-20 的 PBS 洗滌 7 次。每孔加入 100 μ I TMB 顯色液，室溫顯色15分鐘。
[0121]13.每孔加入50 μ 12Ν硫酸終止反應(yīng)。
[0122]14.于分光光度計(jì)讀取吸光度(OD45tol)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本濃度值。結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5顯示ELISA檢測(cè)經(jīng)Rv0733抗原或抗原肽免疫二周后，小鼠外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)Rv0733刺激后Y干擾素的釋放量。ADJ:佐劑組。ADJ + ADK:佐劑加Rv0733抗原組。*:Ρ〈0.05。
[0123]實(shí)施例5 =ELISA檢測(cè)免疫小鼠外周血中Rv0733特異性抗體含量。
[0124]實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:[0125]1.用 I μ g/ml Rv0733 融合蛋白包被 ELISA96 孔板(Corning9018)，4°C，過(guò)夜。
[0126]2.棄上清液，每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次，每次于吸水紙上拍干。
[0127]3.用含5%脫脂奶粉的PBS室溫封閉2小時(shí)。
[0128]4.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100 μ I各濃度梯度稀釋的免疫后小鼠血漿。稀釋液為含5%脫脂奶粉的PBS。6個(gè)對(duì)照孔加入100 μ 11:100稀釋的未免疫小鼠血漿。2個(gè)空白孔加入100μ I含5%脫脂奶粉的PBS，室溫孵育2小時(shí)。
[0129]5.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100 μ I生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體，室溫孵育2小時(shí)。
[0130]6.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌5次。每孔加入100 μ I親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(ΑΡ)，室溫孵育I小時(shí)。
[0131]7.每孔300 μ I含0.05% Tween-20的PBS洗滌7次。每孔加入100 μ I堿性磷酸酶底物(S0942，SIGMA)顯色液，室溫顯色20分鐘。
[0132]8.每孔加入50 μ 15Ν氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)。
[0133]9.分光光度計(jì)于450nm讀取吸光度(OD)值。以Na’ive小鼠讀數(shù)平均值加2SD為閾值，樣本孔讀數(shù)大于等于閾值時(shí)的最大稀釋度計(jì)為抗體滴度值，接近抗體滴度時(shí)樣本的稀釋倍數(shù)以2為梯度。結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6顯示ELISA檢測(cè)經(jīng)Rv0733抗原免疫二周后，小鼠外周血漿中Rv0733特異性抗體水平。其中，圖6a顯示0D450檢測(cè)Rv0733特異性抗體水平，error bar代表SD值。圖6b，顯示Rv0733免疫小鼠后血漿中特異性抗體的滴度值，水平線代表mean土SD。每組6 — 12只小鼠。ADJ:佐劑組。ADJ + ADK:佐劑加Rv0733抗原組。Blank:空白孔。林*:Ρ〈0.001。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的試劑，包括RV0733抗原或多肽或其類(lèi)似物；所述Rv0733抗原的氨基酸序列從N端到C端如下:
VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDA⑶LVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGKjn SEQ ID NO:1 所示； 所述多肽為一種氨基酸聚合物，其長(zhǎng)度至少為20個(gè)氨基酸殘基；所述其類(lèi)似物為與其同源性在75%以上的多肽及經(jīng)過(guò)天然或人工修飾后的氨基酸聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述多肽為編號(hào)ADK0-ADK16的氨基酸聚合物，其氨基酸順序從N端到C端列于下:
ADKO:VRVLLLGPPG AGKGTQAVKLjn SEQ ID NO:2 所示；
ADKl:AGKGTQAVKL AEKLGIPQISjn SEQ ID NO:3 所示；
ADK2:AEKLGIPQIS TGELFRRNIEjn SEQ ID NO: 4 所示；
ADK3:TGELFRRNIE EGTKLGVEAKjn SEQ ID NO:5 所示；
ADK4:EGTKLGVEAK RYLDAGDLVPjn SEQ ID NO:6 所示；
ADK5:RYLDAGDLVP SDLTNELVDDjn SEQ ID NO:7 所示；
ADK6:SDLTNELVDD RLNNPDAANGjn SEQ ID NO:8 所示；
ADK7:RLNNPDAANG FILDGYPRSVjn SEQ ID NO:9 所示；
ADK8:FILDGYPRSV EQAKALHEMLjn SEQ ID NO: 10 所示；
ADK9:EQAKALHEML ERRGTDIDAVjn SEQ ID NO: 11 所示；
ADKlO:ERRGTDIDAV LEFRVSEEVL，如 SEQ ID NO: 12 所示；
ADKll:LEFRVSEEVL LERLKGRGRA，如 SEQ ID NO: 13 所示；
ADK12:LERLKGRGRA DDTDDVILNR，如 SEQ ID NO: 14 所示；
ADK13:DDTDDVILNR MKVYRDETAPjn SEQ ID NO: 15 所示；
ADK14:MKVYRDETAP LLEYYRDQLKjn SEQ ID NO: 16 所示；
ADK15:LLEYYRDQLK TVDAVGTMDE，如 SEQ ID NO: 17 所示；
ADK16:TVDAVGTMDE VFARALRALG K，如 SEQ ID NO: 18 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑在制備檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑在制備結(jié)核亞單位疫苗或重組結(jié)核疫苗中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑在制備單純肺結(jié)核與肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103804499SQ201410028297
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】肖洋炯, 王穎, 沈浩, 王慧宇, 田兆峰, 賴(lài)允鑫 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院