一種檢測(cè)赭曲霉素a的膠體金免疫試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)赭曲霉素A的膠體金免疫試劑盒包括檢測(cè)試紙；所述檢測(cè)試紙包括底板，粘合在底板上且依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述硝酸纖維膜上靠近結(jié)合墊的一側(cè)設(shè)有檢測(cè)線，硝酸纖維膜上靠近吸水墊的一側(cè)設(shè)有質(zhì)控線；所述結(jié)合墊上涂有被赭曲霉素A單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測(cè)線上涂有BSA-OTA；所述質(zhì)控線上涂有羊抗鼠IgG；所述單鏈核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述單鏈核酸3’端標(biāo)記有巰基。該試劑盒的特點(diǎn)在于在標(biāo)記抗體的同時(shí)，將一段單鏈核酸協(xié)同標(biāo)記在膠體金表明，有效減低了非特異性吸附，減少標(biāo)記抗體的用量，制成的免疫層析試劑盒，靈敏度達(dá)到5ng/mL。
【專利說明】一種檢測(cè)赭曲霉素A的膠體金免疫試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)療檢測(cè)產(chǎn)品及其制作方法，尤其涉及一種檢測(cè)赭曲霉素A的膠體金免疫試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析法是二十世紀(jì)九十年代興起的一種基于免疫膠體顆粒的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端接觸到樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。
[0003]常用的免疫層析法所用的特異識(shí)別檢測(cè)物的生物大分子都是抗體，通過抗原抗體特異識(shí)別反應(yīng)，標(biāo)記在抗原或抗體上的免疫膠體顆粒使檢測(cè)線和質(zhì)控線顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。但是該方法檢測(cè)不夠快速和靈敏，而且用抗體檢測(cè)還需要用到相應(yīng)的儀器設(shè)備，操作不簡(jiǎn)便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制作膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒，通過在檢測(cè)線和質(zhì)控線上顯示紅色，來實(shí)現(xiàn)在樣品中直接檢測(cè)赭曲霉素A。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0006]所述檢測(cè)黃曲霉素BI的膠體金免疫試劑盒，包括檢測(cè)試紙；所述檢測(cè)試紙包括底板，粘合在底板上且依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述硝酸纖維膜上靠近結(jié)合墊的一側(cè)設(shè)有檢測(cè)線，硝酸纖維膜上靠近吸水墊的一側(cè)設(shè)有質(zhì)控線；所述結(jié)合墊上涂有被鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測(cè)線上涂有BSA-OTA ;所述質(zhì)控線上涂有羊抗鼠IgG ;所述單鏈核酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述單鏈核酸3’端標(biāo)記有巰基。
[0007]優(yōu)選地，所述底板為PVC板；樣品墊和結(jié)合墊的材料為聚醋纖維；所述吸水墊為吸水濾紙。所述檢測(cè)試紙由硬質(zhì)塑料卡包裝。
[0008]本發(fā)明還提供了上述試劑盒的方法，包括如下步驟:
[0009](I)用鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金，得包被后的膠體金溶液；
[0010](2)將包被后的膠體金溶液噴于結(jié)合墊上，烘干備用；
[0011](3)在硝酸纖維膜上檢測(cè)線位置噴點(diǎn)BSA-OTA溶液；在質(zhì)控線位置噴點(diǎn)羊抗鼠IgG溶液，烘干備用；
[0012](4)將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并粘合于底板上，切成檢測(cè)試紙條，將檢測(cè)試紙條用硬質(zhì)塑料卡包裝。
[0013]優(yōu)選地，步驟(I)膠體金直徑為13_40nm。
[0014]優(yōu)選地，步驟(I)所述用鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金是指先將將鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體加入膠體金溶液，此時(shí)，膠體金溶液中膠體金顆粒濃度為3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體濃度為3_5 μ g/mL,于2000rpm/min條件下離心去除沉淀,然后再上清中加入如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸，此時(shí)，膠體金溶液中單鏈核酸濃度為18-28μ g/mL，于1500rpm/min條件下離心后將沉淀溶于Tris-HCL緩沖溶液，即得包被后的膠體金溶液，備用。
[0015]優(yōu)選地，步驟(I)所述用鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金是指先將鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體與如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸混合,得到抗體核酸混合物,然后將抗體核酸混合物加入膠體金溶液中，此時(shí),膠體金溶液中膠體金顆粒濃度為3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體濃度為5_8 μ g/mL,單鏈核酸濃度為20-25 μ g/mL ;再將加入了抗體核酸混合物的膠體金溶液離心，將沉淀溶于Tris-HCL緩沖溶液，即得包被后的膠體金溶液，備用。
[0016]優(yōu)選地，步驟(3)所述BSA-OTA溶液配制方法是將濃度為1_1.5mg/mLBSA-0TA溶于PBS緩沖液中得到BSA-OTA濃度為0.5-lmg/mL BSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的濃度為l_2mg/mL。
[0017]使用本試劑盒時(shí)，將待測(cè)標(biāo)本加入到點(diǎn)樣孔，待測(cè)標(biāo)本在毛細(xì)作用下沿著樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜向吸水濾紙端方向?qū)游?；檢測(cè)時(shí)，如果待測(cè)標(biāo)本中的含有檢測(cè)物赭曲霉素A，且濃度高于5ng/mL，赭曲霉素A先與結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合并使之復(fù)溶，復(fù)溶后的混合物繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，不再和檢測(cè)線上的BSA-OTA結(jié)合，標(biāo)記金顆粒繼續(xù)向前，到達(dá)質(zhì)控線區(qū)域時(shí)，與其上包被的羊抗鼠Ig G發(fā)生結(jié)合，顯現(xiàn)出膠體金的紅色線條，此為質(zhì)控線；檢測(cè)時(shí)，如果待測(cè)標(biāo)本中的不含有檢測(cè)物赭曲霉素A，結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體復(fù)溶，復(fù)溶后的混合物繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，和檢測(cè)線上的BSA-OTA結(jié)合，這樣檢測(cè)線位置出現(xiàn)標(biāo)記膠體金的紅色，標(biāo)記金顆粒繼續(xù)向前，到達(dá)質(zhì)控線區(qū)域時(shí)，與其上包被的羊抗鼠Ig G發(fā)生結(jié)合，顯現(xiàn)出膠體金的紅色線條，此為質(zhì)控線；檢測(cè)時(shí)，如果待測(cè)物中赭曲霉素A濃度低于5ng/mL，赭曲霉素A先與結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合并使之復(fù)溶，復(fù)溶后的混合物繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，再和檢測(cè)線上的BSA-OTA結(jié)合，這樣檢測(cè)線位置也會(huì)出現(xiàn)標(biāo)記膠體金的紅色，由于免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，赭曲霉素A濃度比5ng/mL越低,檢測(cè)線的紅色越紅，標(biāo)記金顆粒繼續(xù)向前，到達(dá)質(zhì)控線區(qū)域時(shí)，與其上包被的羊抗鼠Ig G發(fā)生結(jié)合，顯現(xiàn)出膠體金的紅色線條，此為質(zhì)控線。
[0018]該試劑盒的特點(diǎn)在于在標(biāo)記抗體的同時(shí)，將一段單鏈核酸協(xié)同標(biāo)記在膠體金表面，有效減低了非特異性吸附，減少標(biāo)記抗體的用量，制成的免疫層析試劑盒，靈敏度達(dá)到5ng/mL0
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明試劑盒中檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020]圖2為本發(fā)明的原理示意圖；
[0021]圖3為本發(fā)明檢測(cè)過程示意圖；有檢測(cè)物:表示檢測(cè)物濃度高于最低檢測(cè)濃度，檢測(cè)線為紅色(圖中為深色)；無檢測(cè)物:表示檢測(cè)物濃度高于最低檢測(cè)濃度，檢測(cè)線位置無色(圖中為空白)；
[0022]圖4為本發(fā)明免疫層析法檢測(cè)結(jié)果判定圖，其中，T表示檢測(cè)線，C表示質(zhì)控線。[0023]圖中:1、底板；2、樣品墊；3、結(jié)合墊；4、硝酸纖維素膜；5、檢測(cè)線；6、質(zhì)控線；7吸水墊。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1
[0025]參見圖1，所述檢測(cè)赭曲霉素A的膠體金免疫試劑盒，包括檢測(cè)試紙；所述檢測(cè)試紙包括底板1，粘合在底板I上且依次搭接的樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊7 ;所述硝酸纖維膜4上靠近結(jié)合墊3的一側(cè)設(shè)有檢測(cè)線5，硝酸纖維膜4上靠近吸水墊7的一側(cè)設(shè)有質(zhì)控線6 ;所述結(jié)合墊3上涂有被赭曲霉素A單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測(cè)線5上涂有BSA-OTA ;所述質(zhì)控線6上涂有羊抗鼠IgG ;所述單鏈核酸序列為5’ -TrnTnTnTnTr-3’(SEQ ID N0.1)，所述單鏈核酸3’端標(biāo)記有巰基，即(5’ -TTTTTTTTTTTTTTT-SH3’)。所述底板I為PVC板；樣品墊2和結(jié)合墊3的材料為聚醋纖維；所述吸水墊7為吸水濾紙。所述檢測(cè)試紙由硬質(zhì)塑料卡包裝。
[0026]試劑盒的實(shí)際使用
[0027]下面介紹本發(fā)明的使用方法，不能做為本發(fā)明的限制。
[0028]1.試劑與樣品:赭曲霉素A購(gòu)自SIGMA公司，葡萄酒購(gòu)自超市。
[0029]2.陽(yáng)性樣品制備:用含50%甲醇(體積比)的0.01 M pH7.4 PBS緩沖液將赭曲霉素A配制成I μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。取葡萄酒樣品lmL，加入4mL乙酸乙酯，顛倒混勻后靜置5min ；取200μ L上層液體，電吹風(fēng)吹干或涼干；向吹干的樣品管中加入0.01 M pH7.4 PBS緩沖液1000 μ L，充分渦動(dòng)或反復(fù)吹打管壁約2min，這樣就獲得了葡萄酒提取液。分別向8管葡萄酒提取液中加入不同體積的赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)液,制成終濃度為0ng/mL、2.5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL 的陽(yáng)性樣品。
[0030]3.陰樣品制備:取8管葡萄酒提取液，不添加赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)液，但添加與各管陽(yáng)性樣品所加標(biāo)準(zhǔn)液體積相同的PBS緩沖液。
[0031]4.分別從16管待檢樣品中吸取100 μ L液體，滴加到檢測(cè)卡的樣品孔中，IOmin后
觀察檢測(cè)結(jié)果。
[0032]5.檢測(cè)結(jié)果:重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)三次，陰性樣品檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果如表I所示:
[0033]表1:赭曲霉素A檢測(cè)試劑盒靈敏度
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)赭曲霉素A的膠體金免疫試劑盒，包括檢測(cè)試紙；所述檢測(cè)試紙包括底板(1)，粘合在底板(I)上且依次搭接的樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水墊(7);所述硝酸纖維膜(4)上靠近結(jié)合墊(3)的一側(cè)設(shè)有檢測(cè)線(5)，硝酸纖維膜(4)上靠近吸水墊(7)的一側(cè)設(shè)有質(zhì)控線(6);其特征在于，所述結(jié)合墊(3)上涂有被鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測(cè)線(5)上涂有BSA-OTA ;所述質(zhì)控線(6)上涂有羊抗鼠IgG ;所述單鏈核酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述單鏈核酸3’端標(biāo)記有巰基。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底板(I)為PVC板；樣品墊(2)和結(jié)合墊(3)的材料為聚醋纖維；所述吸水墊(7)為吸水濾紙。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試紙由硬質(zhì)塑料卡包裝。
4.制備權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述試劑盒的方法，包括如下步驟: (1)用鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體和如SEQID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金，得包被后的膠體金溶液； (2)將包被后的膠體金溶液噴于結(jié)合墊上，烘干備用； (3)在硝酸纖維膜上檢測(cè)線位置噴點(diǎn)BSA-OTA溶液；在質(zhì)控線位置噴點(diǎn)羊抗鼠IgG溶液，烘干備用； (4)將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并粘合于底板上，切成檢測(cè)試紙條，將檢測(cè)試紙條用硬質(zhì)塑料卡包裝。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(I)膠體金直徑為13-40nm。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述用鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金是指先將將鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體加入膠體金溶液，此時(shí)，膠體金溶液中膠體金顆粒濃度為3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體濃度為3-5 μ g/mL,于2000rpm/min條件下離心去除沉淀，然后再上清中加入如SEQID N0.1所示的單鏈核酸，此時(shí)，膠體金溶液中單鏈核酸濃度為18-28μ g/mL，于1500rpm/min條件下離心后將沉淀溶于Tris-HCL緩沖溶液，即得包被后的膠體金溶液，備用。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述用鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金是指先將鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體與如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸混合，得到抗體核酸混合物，然后將抗體核酸混合物加入膠體金溶液中，此時(shí)，膠體金溶液中膠體金顆粒濃度為3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A單克隆抗體濃度為5-8 μ g/mL,單鏈核酸濃度為20_25 μ g/mL ;再將加入了抗體核酸混合物的膠體金溶液離心，將沉淀溶于Tris-HCL緩沖溶液，即得包被后的膠體金溶液，備用。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述BSA-OTA溶液配制方法是將濃度為1-1.5mg/mLBSA-0TA溶于PBS緩沖液中得到BSA-OTA濃度為0.5-lmg/mLBSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的濃度為l-2mg/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103728451SQ201410031991
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】常榮山, 譚蔚泓 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)