抗ca242單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及化學發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法
【專利摘要】抗CA242單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及化學發(fā)光免疫分析試劑盒的制備，屬于免疫分析醫(yī)學領域。本發(fā)明提供了一種特異性識別CA242的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測CA242的高靈敏度的方法；還提供了CA242化學發(fā)光免疫分析檢測試劑盒及其制備方法，該試劑盒包括：CA242檢測反應板、酶結合物、發(fā)光底物、標準品、質(zhì)控品、濃縮洗滌液。本發(fā)明用細胞融合和雜交瘤技術研發(fā)出靈敏度高、特異性好的抗體；同時用自主研發(fā)抗體將免疫學與化學發(fā)光技術相結合，研制出檢測范圍寬、靈敏度高、操作方便、生產(chǎn)成本低的試劑盒。本試劑盒通過體外測定血清中CA242的濃度，用于腫瘤的輔助診斷、對確診的惡性腫瘤患者進行動態(tài)監(jiān)測以輔助判斷疾病的進程等。
【專利說明】抗CA242單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及化學發(fā)光免疫分析試劑盒的制備
【【技術領域】】
[0001]本發(fā)明涉及CA242單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及檢測血清中CA242含量的試劑盒，可廣泛應用在醫(yī)學和及生物化學【技術領域】。
[0002]【背景知識】
[0003]CA242抗原是一種新的糖類腫瘤標志物，在惡性腫瘤患者血清中CA242都有較高的陽性檢出率。正常人體膽管細胞、胰管細胞中含少量CA242。但CA242主要存在于胰腺和結腸的惡性腫瘤細胞中，胰腺腫瘤細胞CA242免疫熒光明顯強于鄰近正常胰腺細胞。CA242對胰腺癌和直腸癌是一種有價值的新的腫瘤標志物。但CA242對肝癌和胃癌的診斷率較低。至今也沒有一種標志物能對某種腫瘤完全特異，所以僅僅通過某一種單項腫瘤標志物檢測診斷腫瘤的準確率較低，不能廣泛應用于腫瘤的早期檢測，但是有研究表明，采用多種腫瘤標志物的聯(lián)合檢測,可以彌補上述不足。如同其他腫瘤標志物CEA、CA199、CA50、CA125等聯(lián)合應用，有助于提高陽性診斷率，減少臨床的漏診率。
[0004]臨床研究表明，在胰腺癌及晚期結直腸癌患者血清中，CA242普遍有顯著的升高，對結直腸癌而言，CA242顯示出比CA50及CA199具有更高的靈敏性；在CA50的對照研究中顯示，對于Dukes各期腫瘤的檢測均有更高的靈敏性，且隨臨床病期的進展而顯著增高。用高親和力的CA242單克隆抗體檢測血清中的CA242，其原理基于C242可與粘蛋白表面的抗原CA242特異性結合，經(jīng)標記后利用免疫血清學方法檢測，這比以往檢測CA199及CA50特異性更高。
[0005]CA242作為胰腺癌和結直腸癌相關的腫瘤標志物，在臨床診斷、監(jiān)測及手術預后方面的作用十分突出。它的檢測方法簡便可行，因此在臨床上具有很好的應用價值。同時，CA242可作為一種腫瘤標志物協(xié)助多種惡性腫瘤的診斷、指導治療以及判斷預后。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種抗CA242單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤以及建立一種簡單且具高靈敏度的檢測CA242的方法，并將該方法應用胰腺癌和結直腸癌的早期篩查。以解決現(xiàn)有的單克隆抗體檢測CA242的靈敏度不夠或價格昂貴，不適合臨床大規(guī)模的應用的缺點。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種CA242化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒以及該試劑盒的制備方法。利用該試劑盒分析檢測靈敏度高、特異性強。
[0008]本發(fā)明獲得了能夠產(chǎn)生特異性識別CA242的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞株4-1與雜交瘤細胞株4-5，此2株細胞株分別在2014年I月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址 是，中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:C201419與CCTCC N0:C201420。此外，經(jīng)過鑒定，兩株單克隆抗體分別識別CA242的兩個不同表位，通過4-1與4-5的結合建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應方法，其是一種高靈敏度及高通量的檢測系統(tǒng)。[0009]因此，本發(fā)明提供了下面所述的I至7的內(nèi)容:
[0010]1.抗CA242的雜交瘤細胞株，其保藏號分別為CCTCC N0:C201419和CCTCCN0:C201420o
[0011]2.抗CA242的單克隆抗體，分別由保藏號為CCTCC N0:C201419和CCTCCN0:C201420的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為4-1和4_5。
[0012]3.如權利要求2所述的抗CA242單克隆抗體的應用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測CA242，夾心法兩兩配對的抗體來源于保藏號為CCTCCN0:C201419雜交瘤分泌的抗體4-1和保藏號為CCTCC N0:C201420雜交瘤分泌的抗體4_5，其步驟包括:
[0013](I)以所述的兩兩配對的單克隆抗體4-1包被；
[0014](2)加入待測樣品孵育；
[0015](3)以所述的兩兩配對的HRP標記的另一株單克隆抗體4-5作為二抗，加入反應體系;
[0016](4)洗滌后加入酶反應底物，以450nm讀取OD值；
[0017](5)結果表明檢測的靈敏度很高。
[0018]4.一種檢測血清中CA242含量的試劑盒，包括:包被有抗CA242單克隆抗體4_1的不透明聚苯乙烯板；CA242抗原系列標準品；酶標記的CA242單克隆抗體4_5 ;上述酶所作用的化學發(fā)光底物A液和B液以及洗滌液。
[0019]5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被單克隆抗體4-1，包被液是磷酸鹽緩沖液；另一株CA242單克隆抗體4-5和辣根過氧化酶偶聯(lián)形成酶標記抗體，采用的是改良的過碘酸鈉法進行標記；CA242抗原系列標準品以小牛血清為基質(zhì)，加入CA242抗原純品配置而成；發(fā)光底物A、B為HRP-Luminol發(fā)光體
系O
[0020]6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:標記抗體所用的標記酶是辣根過氧化酶，用的是高碘酸鈉氧化法，所得酶標記抗體最佳的工作濃度是1:3000 ;包被有抗CA242抗體的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；發(fā)光液A液用硼砂7.99g，硼酸
3.46g，魯米諾0.28g，對碘苯酚0.07g，加工藝用水定容至700mL，避光保存；發(fā)光底物B液由下列成分組成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,過氧化脲0.07g加工藝用水定容至700mL。
[0021]7.如權利要求4-6所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0022]( I)標準品的配制和濃度的校正
[0023]將CA242抗原純品，加入標準品稀釋液，配制一高濃度標準品濃液，采用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配制成O、10、25、50、100、200U/mL的系列標準品，標準品用國家標準品校正。
[0024](2)包被
[0025]采用0.5mol/L, pH值為9.5的碳酸鹽緩沖液與CA242單抗混合成抗體濃度是3 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上,4°C孵育過夜；
[0026](3)洗板
[0027]用PBS-T洗液洗板孔2次；
[0028](4)封閉[0029]封閉液包含NaC18.00g,KC10.20g,Na2HPO4.12H202.90g,KH2PO40.20g，蔗糖 20.0Og,proclin3001.0OmL, BSA20.00g，封閉液的PH值為7.3-7.5，150 μ L/孔封閉，濕盒放置孵育3h ；
[0030](5)干燥
[0031]去除封閉液，過夜干燥。
[0032](6)組裝為成品
[0033]將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中并放入干燥劑，密封保存。
[0034]上述的抗CA242的單克隆抗體，是由下列的方法所制備，步驟包括:
[0035](I)用蛋白量為2.5KU的CA242抗原與弗氏完全佐劑混合；經(jīng)15天后進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天后取脾細胞進行融合；
[0036](2)將免疫小白鼠脾細胞與小白鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5:1-10:1的比例，用50%PEG作為融合劑融合；
[0037](3)用含HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的無血清培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔；
[0038](4)篩選出的特異性強陽性孔用有限稀釋法克隆，獲得單抗細胞株進一步擴大培養(yǎng);
[0039](5)收集培養(yǎng)上清液，親和層析法純化單克隆抗體，即為抗CA242單克隆抗體；
[0040](6)檢測單克隆抗體的效價，選取效價高的一株進行HRP標記，并對標記好的單克隆抗體進行滴度測定；
[0041](7)標記好的單克隆抗體與其他未標記的單克隆抗體進行競爭ELISA反應，選取沒有競爭的一株進行夾心ELISA反應，確定最佳條件。
[0042]本發(fā)明的單克隆抗體可直接用于檢測樣品中的CA242含量，通過大量培養(yǎng)單抗細胞株，即可獲得大量的單克隆抗體，與多克隆抗體相比，具有純度高，專一性強、重復性好等優(yōu)點。
[0043]本發(fā)明針對臨床實驗室建立了一種既可以手工操作，又可以用于標準全自動檢測儀器的檢測手段，建立了檢測人血清CA242的定量檢測方法。本發(fā)明的CA242定量檢測試劑盒(化學發(fā)光法)可以專一的檢測出人血清中的CA242的含量，從而根據(jù)其含量的多少判斷胰腺癌或結直腸癌病情的變化和治療效果。它具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點，本發(fā)明的試劑盒，包被的抗體4-1與酶標記的抗體4-5及被測樣品中的CA242形成“包被抗體-抗原-抗體-酶”的夾心復合物結構，所以本發(fā)明采用的是“雙抗夾心一步法”的反應模式。利用辣根過氧化酶催化發(fā)光底物，發(fā)光底物發(fā)生化學反應釋放大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體，當其回到穩(wěn)定的基態(tài)時，可以發(fā)射出光子，利用發(fā)光儀器測量光量子的產(chǎn)額，該光量子的產(chǎn)額和樣品中的檢測物質(zhì)的量成正比，由此建立標準曲線并計算出樣品中待測物質(zhì)的含量。試劑盒檢測方法具有靈敏度高，檢測范圍寬，操作方便、對實驗人員無傷害，同時生產(chǎn)成本低，減輕了醫(yī)患雙方的負擔，因此更有利于臨床胰腺癌和結直腸癌的早期篩查。
【【專利附圖】

【附圖說明】】[0044]圖1顯示的是本發(fā)明中的雜交瘤所產(chǎn)生的抗CA242單克隆抗體在ELISA方法中效價測定結果；
[0045]圖2顯示的是標記HRP的抗CA242單克隆抗體滴度測量結果；
[0046]圖3顯示的是夾心法ELISA系統(tǒng)的檢測靈敏度；
[0047]圖4顯示的是所制備的試劑盒的標準品線形圖。
【【具體實施方式】】
[0048]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應理解，在闡述了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改，這些等價形式同樣是本申請中權利要求書中所限定的范圍。
[0049]實施例1:動物免疫
[0050]選擇與所用的骨髓瘤細胞同源的8周齡左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量為15KU的CA242抗原與弗氏完全佐劑、PBS混合，完全乳化后，采取背部多點，及腋下、腹股溝免疫。免疫程序:經(jīng)15天后進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天后取脾細胞進行融合。 [0051]實施例2:雜交瘤的構建
[0052]1、骨髓瘤細胞株的培養(yǎng)及制備
[0053](I)本發(fā)明采用的是SP2/0骨髓瘤細胞，該細胞株生長及融合效率均佳，倍增時間為10-12h。融合時選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性佳的細胞。骨髓瘤細胞在融合前應先在培養(yǎng)基上作適應培養(yǎng)，使細胞生長到最佳的狀態(tài)(即對數(shù)生長期);
[0054](2)將培養(yǎng)的SP2/0吸至50mL的管中，離心，棄上清，懸起，加IOmL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋后，計數(shù)。
[0055]2、脾細胞的制備
[0056]( I)將小鼠放在密封袋中，充CO2使其窒息死亡；
[0057](2)將小鼠消毒固定在解剖板上，在超凈工作臺中取脾，放在12mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剝掉粘連組織，研磨脾臟，直至剩白色組織為止，吸管全部吸起，再緩慢打出使組織塊粘連的管壁上，離心，棄上清，加IOmL的紅細胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培養(yǎng)基終止其反應，離心后，棄上清，加IOmL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋后，計數(shù)。
[0058]3、細胞融合
[0059]細胞融合是雜交瘤技術的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是取處于對數(shù)生長期的Sp2/0細胞與脾細胞1:10混和，通過聚乙二醇(PEG)法以獲得雜交瘤細胞，命名為4-1和4-5。所獲得的雜交瘤細胞懸浮在含有飼養(yǎng)細胞的HAT培養(yǎng)基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12天。
[0060]實施例3:單克隆抗體的制備及篩選
[0061]1、單克隆抗體的制備
[0062]從實施例2中所獲得的雜交瘤細胞的孔格中回收培養(yǎng)基的上清液，選取在ELISA方法中與抗原多肽反應的單克隆抗體。[0063]2、單克隆抗體的篩選
[0064](I)將IOOuL濃度為10U/ml的CA242到96孔板的每個孔格中，于4 °C過夜后使其
固定于固相；
[0065](2)用150uL濃度為1%的牛血清白蛋白進行封閉2h ；
[0066](3)將IOOuL雜交瘤細胞的培養(yǎng)基上清液加入到每個孔格中，于37°C反應2h，然后加入稀釋10000倍的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體于37°C反應Ih ；
[0067](4)使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB)作為底物進行顯色20min ；
[0068](5)添加50uL濃度為0.2N的硫酸終止反應后，測量450nm的吸光度；
[0069](6)選出吸光度大約為3的4-1和4-5，并通過有限稀釋法進行亞克隆。
[0070]3、單克隆抗體的大量制備及和純化
[0071]將亞克隆后的細胞用細胞培養(yǎng)轉瓶進行擴大培養(yǎng)，約20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)進行親和層析純化。得到的單克隆抗體分別命名為4_1與4_5。
[0072]4、單克隆抗體效價的測定
[0073]所篩選出的2株單克隆抗體的效價通過ELISA方法來測定。分別加入4_1、4_5(10ug/mL)，在反應后 ，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體與TMB進行顯色，結果如圖1所示兩株單克隆抗體的效價達到10-9以上。
[0074]實施例4:單克隆抗體的標記及滴度的測定
[0075]將純化出的抗體按常規(guī)方法進行HRP標記，標記好的單克隆抗體的滴度通過下面的方法測定，將濃度為10U/mL的CA242固定在96孔微板上(IOOuL/孔)。使用1%的牛血清白蛋白進行封閉2h，加標記的單克隆抗體(第一孔100倍稀釋)，從第二孔開始4倍稀釋，于室溫下反應lh。添加TMB后，反應在室溫下進行20min，用0.2N的硫酸中止反應。測量在450nm的吸光度，HRP標記的單克隆抗體的滴度結果如圖2所示。
[0076]實施例5:雙抗體夾心ELISA檢測CA242方法的建立
[0077](I)以所述的兩兩配對的單克隆抗體4-1包被，3ug/ml的單克隆抗體以IOOuL/孔加到微孔板上，于4°C孵育24h固定于固相；
[0078](2)微孔板使用含有0.l%Tween-20的pH值為?.4的20mM PBS以200uL/孔的量洗2次。以150uL/孔的量加入1%牛血清白蛋白進行封閉2h。
[0079](3)微孔板用PBST以200uL/孔的量洗4次，加入由起始濃度10ug/ml連續(xù)4倍稀釋CA242，于室溫溫育2h，然后加入標記HRP的另一株抗體4_5 (1:3000 ;IOOuL/孔)并于
室溫溫育2h。
[0080](4)添加TMB后，反應在室溫下進行20min，加入0.2N的硫酸中止反應并測量450nm的吸光度。
[0081](5)檢測結果見附圖3所示。
[0082]實施例6:制備本發(fā)明的CA242定量測定試劑盒(化學發(fā)光法)
[0083](一)高碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化酶
[0084]( I)酶的氧化(全過程避光)
[0085]稱取3-5mg HRP 溶解于 600 μ L ddH202 中；
[0086]b、加入新鮮配制的 150uL0.1M 高碘酸鈉(NaIO4) (MW:213.89g/mol，取 0.22g 溶解于IOmLlOmM pH7.0磷酸鈉緩沖液中)；[0087]C、混勻，室溫，避光孵育20min ;
[0088]d、將溶液用透析管透析,3000rpm/min,4°C, 20min,溶液為1.0mM pH4.0醋酸鈉緩沖液，換3-4次；
[0089]e、最后透析至800 μ L,至EP管中；
[0090](2)抗體的準備和標記(避光)
[0091]a、取準備好的3mg單抗，用離心管濃縮成500 μ L-1000 μ L體積，吸出于新的15mL離心管中；
[0092]b、加入500 μ L0.2Μ ρΗ9.5碳酸鹽緩沖液，混勻，檢測pH值在9.0~9.5 ;
[0093]C、立即將透析好的HRP溶液與單抗溶液混合，室溫搖晃2h，避光；
[0094]d、加入 80 μ L 新鮮配制的 NaBH4 (4.0mg/mL,取 40mg 溶解于 IOmL ddH202 中)；
[0095]e、混勻(避光)，4°C孵育 1.5h ;
[0096]f、用PBS透析至體積為2mL ；
[0097]g、加入等體積甘油，ImL/管，_20°C保存
[0098](二)酶標抗體工作液的配制
[0099](I)酶標稀釋液的配制
[0100]
【權利要求】
1.抗CA242的雜交瘤細胞株，其保藏號分別為CCTCCN0:C201419和CCTCCN0:C201420o
2.抗CA242的單克隆抗體，分別由保藏號為CCTCCNO:C201419和CCTCC N0:C201420的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為4-1和4-5。
3.如權利要求2所述的抗CA242單克隆抗體的應用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測CA242，夾心法兩兩配對的抗體來源于保藏號為CCTCC N0:C201419雜交瘤分泌的抗體4-1和保藏號為CCTCC N0:C201420雜交瘤分泌的抗體4_5，其步驟包括: (1）以所述的兩兩配對的單克隆抗體4-1包被； (2)加入待測樣品孵育； (3)以所述的兩兩配對的HRP標記的另一株單克隆抗體4-5作為二抗，加入反應體系； (4)洗滌后加入酶反應底物，以450nm讀取OD值； (5)結果表明檢測的靈敏度很高。
4.一種檢測血清中CA242含量的試劑盒，包括:包被有抗CA242單克隆抗體4_1的不透明聚苯乙烯板；CA242抗原系列標準品；酶標記的CA242單克隆抗體4_5 ;上述酶所作用的化學發(fā)光底物A液和B液以及洗滌液。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被單克隆抗體4-1，包被液是磷酸鹽緩沖液；另一株CA242單克隆抗體4-5和辣根過氧化酶偶聯(lián)形成酶標記抗體，采用的是改良的過碘酸鈉法進行標記；CA242抗原系列標準品以小牛血清為基質(zhì)，加入CA242抗原純品配置而成；發(fā)光底物A、B為HRP-Luminol發(fā)光體系。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:標記抗體所用的標記酶是辣根過氧化酶，用的是高碘酸鈉氧化法，所得酶標記抗體最佳的工作濃度是1:3000 ;包被有抗CA242抗體的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；發(fā)光液A液用硼砂7.99g，硼酸3.46g，魯米諾0.28g，對碘苯酚0.07g，加工藝用水定容至700mL，避光保存；發(fā)光底物B液由下列成分組成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,過氧化脲0.07g加工藝用水定容至700mL。
7.如權利要求4-6所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟: (1)標準品的配制和濃度的校正 將CA242抗原純品，加入標準品稀釋液，配制一高濃度標準品濃液，采用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配制成O、10、25、50、100、200U/mL的系列標準品，標準品用國家標準品校正。 (2)包被 采用0.5mol/L,pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液與CA242單抗混合成抗體濃度是3 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育過夜； (3)洗板 用PBS-T洗液洗板孔2次； (4)封閉
封閉液包含 NaC18.00g, KC10.20g, Na2HPO4.12H202.90g, KH2PO40.20g,蔗糖 20.0Og,proclin3001.0OmL, BSA20.00g，封閉液的PH值為7.3-7.5，150 μ L/孔封閉，濕盒放置孵育3h ； (5)干燥去除封閉液，過夜干燥。(6)組裝為成品將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中并放入干燥劑，密封保存。
【文檔編號】G01N33/577GK103789271SQ201410035829
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2014年1月26日
【發(fā)明者】李玉花, 藍興國, 張?zhí)m蘭, 魏德強, 張?zhí)炫? 申請人:東北林業(yè)大學, 東北林業(yè)大學大慶生物技術研究院, 李玉花