天川顆粒中間產(chǎn)品特征指紋圖譜構建方法
【專利摘要】天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，包括制備供試品溶液；制備對照品溶液；并用高效液相色譜儀進行測定，得到天川顆粒的指紋圖譜。徑幾十批次天川顆粒HPLC-UV指紋圖譜的對比，確定其共有指紋特征，得到標準指紋圖譜。具有有測定方法操作簡便、精密度高、特征峰多、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、準確可靠、易于掌握的特點等特點。注重藥材指標性化學成分與制劑藥效學研究結果的關聯(lián)性和指紋圖譜的整體面貌特征，為完整、準確評價天川顆粒中間產(chǎn)品的質量提供了新的控制標準，達到更科學的控制產(chǎn)品質量的目的。
【專利說明】天川顆粒中間產(chǎn)品特征指紋圖譜構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用高效液相色譜方法建立天川顆粒中間產(chǎn)品的HPLC-UV標準特征指紋圖譜，對天川顆粒生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品水提濃縮液的質量進行監(jiān)控，屬于藥物分析【技術領域】?！颈尘凹夹g】
[0002]中風病是中老年人常見病、多發(fā)病，是老年人三大死因之一，具有發(fā)病、致殘、死亡和復發(fā)率四高的特點，是威脅中老年人身體健康的主要疾病。近年來，全國、全世界發(fā)病率有增高趨勢，心腦血管疾病已上升為死亡原因首位，全國每年大約有100萬人罹患中風疾病，急性后期，往往遺留有諸多的后遺癥，如偏癱、癡呆、失語等，對病人及家庭和社會造成極大的痛苦和負擔。遺留的后遺癥，每年大約需治療3?6個月。因此，在深入探討風痰瘀血、痹阻脈絡在中風病發(fā)病機理中的重要地位的基礎上，擬平肝熄風、祛痰化瘀、活血通絡之法，用天麻、川芎、懷牛膝和野葛根合理組方。根據(jù)《中藥、天然藥物注冊分類及申報資料要求》的規(guī)定，開發(fā)成療效可靠、服用方便、便于攜帶的天川顆粒。
[0003]研究表明，天麻具有抗驚厥，鎮(zhèn)痛，改善微循環(huán)，抗缺血、缺氧和抗炎、增強機體免疫功能等作用。其主要提取物天麻素具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇、鎮(zhèn)痛，增加腦血流量，改善椎基底動脈、小腦前下動脈、小腦后下動脈、迷路動脈及內耳供血不足，保護神經(jīng)細胞，促進心肌細胞能量代謝的功能。葛根可以明顯降低血壓，減緩心率，降低心肌耗氧量，改善心肌代謝，抗心肌缺血，縮心肌梗死范圍，可以顯著擴張冠狀動脈，改善微循環(huán)，還可以降低血脂和血糖。其提取物葛根素、葛根總黃酮等，可以明顯擴張冠狀血管，改善缺血區(qū)的心肌血供；可以抗血小板聚集，防治動脈粥樣硬化，改善微循環(huán)，并通過影響細胞膜對K+、Na+、Ca+的通透性及影響兒茶酚胺釋放，降低心肌興奮性而發(fā)揮抗心律失常作用。
[0004] 申請人:對該天川顆粒，有一個在先申請，專利號CN200410036481.8 ;本申請是對該天川顆粒質量精制方法的進一步探索研究。
[0005]中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。中藥指紋圖譜能比較全面地反映中藥中化學物質的種類和數(shù)量，是實現(xiàn)中藥真實性、質量可控性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，能更好地反映中藥的內在品質。隨著中藥指紋圖譜及化學模式識別技術的發(fā)展，指紋圖譜技術已日益成為國內外廣泛接受的中藥質量評價模式?；诙恐讣y圖譜技術的中藥質量控制模式是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論體系為基礎的綜合控制模式，體現(xiàn)了中醫(yī)藥整體治療的特色。定量指紋圖譜技術在原有指紋圖譜的方法上賦予指紋圖譜大量的定性、定量信息共同應用于中藥質量控制，對指紋圖譜中多個目標成分尤其是有效成分進行準確定量，使中藥尤其中藥復方制劑質量控制更加準確，能更真實反映中藥復方制劑的質量狀況和產(chǎn)品組成，產(chǎn)品的質量和穩(wěn)定性更加可靠。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種天川顆粒的中間產(chǎn)品水提液特征指紋圖譜的建立方法，以及由此方法得到的天川顆粒中間產(chǎn)品標準特征指紋圖譜。本發(fā)明通過對天川顆粒中間產(chǎn)品水提液高效液相色譜指紋圖譜的研究，提供了一種較好的質量控制方法，是天川顆粒及其中間產(chǎn)品水提液的質量控制更加完善和科學。
[0007]本申請所述的“天川顆粒中間產(chǎn)品”，是指按照 申請人:的在先申請CN200410036481.8規(guī)定的配量和制備方法，在制備天川顆粒過程中的醇沉前的藥材混合水煎煮濃縮液。
[0008]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術解決方案為:
[0009]1.研制一種天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟:
[0010](I)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50?1.50g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水I?100倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0011](2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液；
[0012](3)色譜條件:色譜柱為5μηι Fortis-C18, 250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5 ?1.5ml/min ;柱溫 25 ?35°C;檢測波長:220nm ;進樣量為10?100 μ I ;
[0013](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50?1.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
[0014]上述的天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是按照本方法對10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒中間產(chǎn)品的HPLC-UV圖譜，并進行分析比較，得到由測定所得的指紋圖譜中有20個共有峰，其中，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，分別為:
[0015]峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.082 ；
[0016]峰2:相對保留時間0.569,相對峰面積0.085 ；
[0017]峰3天麻素:相對保留時間1.000，相對峰面積1.000 ；
[0018]峰4對羥基苯甲醇:相對保留時間1.603，相對峰面積0.164 ；
[0019]峰5鹽酸川芎嗪:相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ；
[0020]峰6:相對保留時間2.217，相對峰面積0.057 ；
[0021]峰7:相對保留時間2.368，相對峰面積0.098 ；
[0022]峰8:相對保留時間2.409，相對峰面積0.430 ；
[0023]峰9對羥基苯甲醛:相對保留時間2.628，相對峰面積0.163 ；
[0024]峰10:相對保留時間2.667，相對峰面積0.772 ；
[0025]峰11:相對保留時間3.022,相對峰面積0.105 ；
[0026]峰12葛根素:相對保留時間3.228，相對峰面積1.927 ;
[0027]峰13:相對保留時間3.287，相對峰面積0.410 ；
[0028]峰14:相對保留時間3.376,相對峰面積0.568 ；
[0029]峰15:相對保留時間3.477,相對峰面積0.090 ；[0030]峰16大豆苷:相對保留時間3.757，相對峰面積0.378 ；
[0031]峰17阿魏酸:相對保留時間3.926，相對峰面積0.091 ；
[0032]峰18:相對保留時間4.189，相對峰面積0.128 ；
[0033]峰19:相對保留時間4.256,相對峰面積0.260 ；
[0034]峰20 β -蛻皮甾酮:相對保留時間5.410，相對峰面積0.067 ；
[0035]這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;是天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
[0036]1、天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.50g/ml水提濃縮液標準特征指紋圖譜的建立:
[0037](I)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.50g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水100倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0038](2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液；
[0039](3)色譜條件:色譜柱為5μπι Fortis-C18，250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5ml/min ;柱溫 35°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為100 μ I ；
[0040](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
[0041](5)標準特征指紋圖譜的建立:精密吸取10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒的HPLC-UV圖譜，通過分析比較10批天川顆粒中間產(chǎn)品水提液的HPLC-UV圖譜，共確定20個共有峰，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別為:
[0042]峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.076 ；
[0043]峰2:相對保留時間0.568,相對峰面積0.089 ；
[0044]峰3 (天麻素):相對保留時間1.000,相對峰面積1.000 ；
[0045]峰4 (對羥基苯甲醇):相對保留時間1.602，相對峰面積0.159 ；
[0046]峰5 (鹽酸川芎嗪):相對保留時間2.016，相對峰面積0.081 ；
[0047]峰6:相對保留時間2.218,相對峰面積0.050 ；
[0048]峰7:相對保留時間2.366,相對峰面積0.089 ；
[0049]峰8:相對保留時間2.408,相對峰面積0.433 ；
[0050]峰9 (對羥基苯甲醛):相對保留時間2.625，相對峰面積0.157 ;
[0051]峰10:相對保留時間2.665,相對峰面積0.761 ；
[0052]峰11:相對保留時間3.019,相對峰面積0.092 ；
[0053]峰12 (葛根素):相對保留時間3.227，相對峰面積1.932 ；
[0054]峰13:相對保留時間3.285,相對峰面積0.405 ；
[0055]峰14:相對保留時間3.373，相對峰面積0.553 ；[0056]峰15:相對保留時間3.474，相對峰面積0.081 ;
[0057]峰16 (大豆苷):相對保留時間3.753，相對峰面積0.386 ；
[0058]峰17 (阿魏酸):相對保留時間3.922，相對峰面積0.090 ；
[0059]峰18:相對保留時間4.185，相對峰面積0.125 ；
[0060]峰19:相對保留時間4.253,相對峰面積0.263 ；
[0061]峰20 ( β -蛻皮甾酮):相對保留時間5.409，相對峰面積0.059。
[0062]這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;可以作為天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
[0063]2、天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液標準特征指紋圖譜的建立:
[0064](I)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水15倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0065](2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液；
[0066](3)色譜條件:色譜柱為5μπι Fortis-C18，250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.0ml/min ;柱溫 30°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為20 μ I ；
[0067](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
[0068](5)標準特征指紋圖譜的建立:精密吸取10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒的HPLC-UV圖譜，通過分析比較10批天川顆粒中間產(chǎn)品水提液的HPLC-UV圖譜，共確定20個共有峰，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別為:
[0069]峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.082 ；
[0070]峰2:相對保留時間0.569,相對峰面積0.085 ；
[0071]峰3 (天麻素):相對保留時間1.000,相對峰面積1.0OO ；
[0072]峰4 (對羥基苯甲醇):相對保留時間1.603，相對峰面積0.164 ；
[0073]峰5 (鹽酸川芎嗪):相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ；
[0074]峰6:相對保留時間2.217,相對峰面積0.057 ；
[0075]峰7:相對保留時間2.368，相對峰面積0.098 ；
[0076]峰8:相對保留時間2.409,相對峰面積0.430 ；
[0077]峰9 (對羥基苯甲醛):相對保留時間2.628，相對峰面積0.163 ；
[0078]峰10:相對保留時間2.667，相對峰面積0.772 ；
[0079]峰11:相對保留時間3.022,相對峰面積0.105 ；
[0080]峰12 (葛根素):相對保留時間3.228，相對峰面積1.927 ；
[0081]峰13:相對保留時間3.287，相對峰面積0.410 ；[0082]峰14:相對保留時間3.376，相對峰面積0.568 ；
[0083]峰15:相對保留時間3.477，相對峰面積0.090 ；
[0084]峰16 (大豆苷):相對保留時間3.757，相對峰面積0.378 ；
[0085]峰17 (阿魏酸):相對保留時間3.926，相對峰面積0.091 ；
[0086]峰18:相對保留時間4.189,相對峰面積0.128 ；
[0087]峰19:相對保留時間4.256,相對峰面積0.260 ；
[0088]峰20 ( β -蛻皮甾酮):相對保留時間5.410，相對峰面積0.067。
[0089]這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;可以作為天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
[0090]3、天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液標準特征指紋圖譜的建立:
[0091](I)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水I倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0092](2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液；
[0093](3)色譜條件:色譜柱為5μπι Fortis-C18，250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.5ml/min ;柱溫 25°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為10 μ I ；
[0094](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
[0095](5)標準特征指紋圖譜的建立:精密吸取10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒的HPLC-UV圖譜，通過分析比較10批天川顆粒中間產(chǎn)品水提液的HPLC-UV圖譜，共確定20個共有峰，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別為:
[0096]峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.090 ；
[0097]峰2:相對保留時間0.569,相對峰面積0.089 ；
[0098]峰3 (天麻素):相對保留時間1.000,相對峰面積1.000 ；
[0099]峰4 (對羥基苯甲醇):相對保留時間1.604，相對峰面積0.162 ；
[0100]峰5 (鹽酸川芎嗪):相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ；
[0101]峰6:相對保留時間2.216,相對峰面積0.059 ；
[0102]峰7:相對保留時間2.369，相對峰面積0.104 ；
[0103]峰8:相對保留時間2.409,相對峰面積0.428 ；
[0104]峰9 (對羥基苯甲醛):相對保留時間2.629，相對峰面積0.162 ；
[0105]峰10:相對保留時間2.668，相對峰面積0.777 ；
[0106]峰11:相對保留時間3.024,相對峰面積0.102 ；
[0107]峰12 (葛根素):相對保留時間3.229，相對峰面積1.924 ；[0108]峰13:相對保留時間3.288，相對峰面積0.408 ；
[0109]峰14:相對保留時間3.378，相對峰面積0.574 ；
[0110]峰15:相對保留時間3.480，相對峰面積0.098 ；
[0111]峰16 (大豆苷):相對保留時間3.760，相對峰面積0.381 ；
[0112]峰17 (阿魏酸):相對保留時間3.929，相對峰面積0.101 ；
[0113]峰18:相對保留時間4.191,相對峰面積0.133 ；
[0114]峰19:相對保留時間4.258,相對峰面積0.262 ；
[0115]峰20 ( β -蛻皮甾酮):相對保留時間5.410，相對峰面積0.072。
[0116]這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;可以作為天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
[0117]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其顯著優(yōu)點是:
[0118](I)本發(fā)明特征峰的選擇更注重藥材指標性化學成分與制劑藥效學研究結果的關聯(lián)性和指紋圖譜的整體面貌特征，避免了因只測定其中一個或兩個化學成分而判斷制劑整體質量的片面性，減少人為處理產(chǎn)品質量達標的可能性。為完整、準確評價制劑的質量提供了新的控制標準，從而能更好的控制制劑的質量；
[0119](2)本發(fā)明基于指紋圖譜用多指標成分(包括8個已知成分)控制產(chǎn)品質量，保證了產(chǎn)品質量的長期穩(wěn)定性，療效的安全性和可靠性；
[0120](3)本發(fā)明具有測定方法操作簡便、精密度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、易于掌握的特
占.[0121](4)本發(fā)明提供了一種天川顆粒中間產(chǎn)品的檢測方法，在相同測定條件下所獲得的天川顆粒中間產(chǎn)品的特征指紋圖譜重合性好，測定重復性好，達到更科學的控制制劑的目的。
[0122]下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細闡述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0123]圖1本發(fā)明提供的密度為1.50g/ml水提濃縮液的標準特征指紋圖譜，圖中從左至右分別標出了其共有特征峰I至20號；
[0124]圖2本發(fā)明提供的密度為1.20g/ml水提濃縮液的標準特征指紋圖譜，圖中從左至右分別標出了其共有特征峰I至20號；
[0125]圖3本發(fā)明提供的密度為0.50g/ml水提濃縮液的標準特征指紋圖譜，圖中從左至右分別標出了其共有特征峰I至20號；
[0126]圖4本發(fā)明提供的10批密度為1.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜；
[0127]圖5本發(fā)明提供的10批密度為1.20g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜；
[0128]圖6本發(fā)明提供的10批密度為0.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜；
【具體實施方式】
[0129]下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明。
[0130]實施例1天川顆粒中間產(chǎn)品水提濃縮液(a)標準特征指紋圖譜的建立
[0131]1、儀器與試藥[0132]島津LC-20A高效液相色譜儀，包括LC-20AT四元梯度泵、D⑶_20A5在線脫氣機、CT0-10AS柱溫箱、SIL-20A自動進樣器、LCsolution工作站；98-1_Β型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);Fff-100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。
[0133]甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)，磷酸(分析純，天津市巴斯夫化工有限公司)，自制純化水。
[0134]天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、β-蛻皮甾酮對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。
[0135]2、標準特征指紋圖譜的建立
[0136](I)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.50g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水100倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0137](2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液；
[0138](3)色譜條件:色譜柱為5μπι Fortis-C18，250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5ml/min ;柱溫 35°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為100 μ I ；
[0139](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
[0140](5)標準特征指紋圖譜的建立:精密吸取10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒的HPLC-UV圖譜，通過分析比較10批天川顆粒中間產(chǎn)品水提液的HPLC-UV圖譜，共確定20個共有峰，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別為:
[0141]峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.056 ；
[0142]峰2:相對保留時間0.568,相對峰面積0.049 ；
[0143]峰3 (天麻素):相對保留時間1.000,相對峰面積1.000 ；
[0144]峰4 (對羥基苯甲醇):相對保留時間1.602，相對峰面積0.149 ；
[0145]峰5 (鹽酸川芎嗪):相對保留時間2.016，相對峰面積0.081 ；
[0146]峰6:相對保留時間2.218,相對峰面積0.050 ；
[0147]峰7:相對保留時間2.366,相對峰面積0.089 ；
[0148]峰8:相對保留時間2.408,相對峰面積0.300 ；
[0149]峰9 (對羥基苯甲醛):相對保留時間2.625，相對峰面積0.117 ;
[0150]峰10:相對保留時間2.665,相對峰面積0.761 ；
[0151]峰11:相對保留時間3.019,相對峰面積0.092 ；
[0152]峰12 (葛根素):相對保留時間3.227，相對峰面積1.982 ；
[0153]峰13:相對保留時間3.285,相對峰面積0.361 ；[0154]峰14:相對保留時間3.373，相對峰面積0.553 ；
[0155]峰15:相對保留時間3.474，相對峰面積0.071 ；
[0156]峰16 (大豆苷):相對保留時間3.753，相對峰面積0.386 ；
[0157]峰17 (阿魏酸):相對保留時間3.922，相對峰面積0.070 ；
[0158]峰18:相對保留時間4.185,相對峰面積0.125 ；
[0159]峰19:相對保留時間4.253,相對峰面積0.163 ；
[0160]峰20 ( β -蛻皮甾酮):相對保留時間5.409，相對峰面積0.059。
[0161]3、相似度評價
[0162]采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件(2008版)對圖譜進行評價，相似度評價結果見表I。
[0163]表110批水提液HPLC-UV圖譜相似度評價結果
[0164]
IFi~fsifs2 [S3 [si fs5 [S6 [S7 [S8 [S9 fslo
相似度 0.987 0.983 0.982 0.984 0.976 0.987 0.971 0.982 0.984 0.986
[0165]天)I丨顆粒中間產(chǎn)品水提濃縮液HPLC-UV圖譜經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件計算，相似度大于0.9。
[0166]實施例2天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液的標準特征指紋圖譜的
建立
[0167]1、儀器與試藥
[0168]島津LC-20A高效液相色譜儀，包括LC-20AT四元梯度泵、D⑶_20A5在線脫氣機、CT0-10AS柱溫箱、SIL-20A自動進樣器、LCsolution工作站；98-1_Β型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);Fff-100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。
[0169]甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)，磷酸(分析純，天津市巴斯夫化工有限公司)，自制純化水。
[0170]天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、β-蛻皮甾酮對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。
[0171]2、標準特征指紋圖譜的建立
[0172](I)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水15倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0173](2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液；
[0174](3)色譜條件:色譜柱為5μπι Fortis-C18，250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.0ml/min ;柱溫 30°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為20 μｌ ；
[0175](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
[0176](5)標準特征指紋圖譜的建立:精密吸取10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒的HPLC-UV圖譜，通過分析比較10批天川顆粒中間產(chǎn)品水提液的HPLC-UV圖譜，共確定20個共有峰，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別為:
[0177]峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.082 ；
[0178]峰2:相對保留時間0.569,相對峰面積0.085 ；
[0179]峰3 (天麻素):相對保留時間1.000,相對峰面積1.000 ；
[0180]峰4 (對羥基苯甲醇):相對保留時間1.603，相對峰面積0.164 ；
[0181]峰5 (鹽酸川芎嗪):相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ；
[0182]峰6:相對保留時間2.217，相對峰面積0.057 ；
[0183]峰7:相對保留時間2.368，相對峰面積0.098 ；
[0184]峰8:相對保留時間2.409,相對峰面積0.430 ；
[0185]峰9 (對羥基苯甲醛):相對保留時間2.628，相對峰面積0.163 ；
[0186]峰10:相對保留時間2.667，相對峰面積0.772 ；
[0187]峰11:相對保留時間3.022,相對峰面積0.105 ；
[0188]峰12 (葛根素):相對保留時間3.228，相對峰面積1.927 ；
[0189]峰13:相對保留時間3.287，相對峰面積0.410 ；
[0190]峰14:相對保留時間3.376,相對峰面積0.568 ；
[0191]峰15:相對保留時間3.477,相對峰面積0.090 ；
[0192]峰16 (大豆苷):相對保留時間3.757，相對峰面積0.378 ；
[0193]峰17 (阿魏酸):相對保留時間3.926，相對峰面積0.091 ；
[0194]峰18:相對保留時間4.189,相對峰面積0.128 ；
[0195]峰19:相對保留時間4.256,相對峰面積0.260 ；
[0196]峰20 ( β -蛻皮甾酮):相對保留時間5.410，相對峰面積0.067。
[0197]3、相似度評價
[0198]采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件(2008版)對圖譜進行評價，相似度評價結果見表2。
[0199]表210批水提液HPLC-UV圖譜相似度評價結果
[0200]
【權利要求】
1.一種天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟: ⑴供試品溶液的制備:取天川顆粒生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)品密度為0.50~1.50g/ml的藥材水提濃縮液適量，精密量取，加水I~100倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液； ⑵對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液； (3)色譜條件:色譜柱為5μπιFortis-C18, 250 X 4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5 ~1.5ml/min ;柱溫 25 ~35°C;檢測波長:220nm ;進樣量為10~100 μ I ; (4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
2.按照權利要求1所述的天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是按照本方法對10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒中間產(chǎn)品的HPLC-UV圖譜，并進行分析比較，得到由測定所得的指紋圖譜中有20個共有峰，其中，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，分別為:
峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.082 ； 峰2:相對保留時間0.569，相對峰面積0.085 ； 峰3天麻素:相對保留時間1.000，相對峰面積1.000 ； 峰4對羥基苯甲醇:相對保留時間1.603，相對峰面積0.164 ； 峰5鹽酸川芎嗪:相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ； 峰6:相對保留時間2.217，相對峰面積0.057 ； 峰7:相對保留時間2.368，相對峰面積0.098 ； 峰8:相對保留時間2.409,相對峰面積0.430 ； 峰9對羥基苯甲醛:相對保留時間2.628，相對峰面積0.163 ； 峰10:相對保留時間2.667，相對峰面積0.772 ； 峰11:相對保留時間3.022，相對峰面積0.105 ； 峰12葛根素:相對保留時間3.228，相對峰面積1.927 ； 峰13:相對保留時間3.287，相對峰面積0.410 ； 峰14:相對保留時間3.376,相對峰面積0.568 ； 峰15:相對保留時間3.477，相對峰面積0.090 ； 峰16大豆苷:相對保留時間3.757，相對峰面積0.378 ； 峰17阿魏酸:相對保留時間3.926，相對峰面積0.091 ； 峰18:相對保留時間4.189,相對峰面積0.128 ； 峰19:相對保留時間4.256,相對峰面積0.260 ； 峰20 β -蛻皮留酮:相對保留時間5.410，相對峰面積0.067 ；這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;是天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
3.一種天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.50g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水100倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液； (2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液； (3)色譜條件:色譜柱為5μπιFortis-C18,250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5ml/min ;柱溫 35°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為100 μ I ； (4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
4.按照權利要求3所述的天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是按照本方法對10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒中間產(chǎn)品的HPLC-UV圖譜，并進行分析比較，得到由測定所得的指紋圖譜中有20個共有峰，其中，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，分別為: 峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.07`6 ； 峰2:相對保留時間0.568，相對峰面積0.089 ； 峰3天麻素:相對保留時間1.000，相對峰面積1.000 ； 峰4對羥基苯甲醇:相對保留時間1.602，相對峰面積0.159 ; 峰5鹽酸川芎嗪:相對保留時間2.016，相對峰面積0.081 ； 峰6:相對保留時間2.218,相對峰面積0.050 ； 峰7:相對保留時間2.366，相對峰面積0.089 ； 峰8:相對保留時間2.408,相對峰面積0.433 ； 峰9對羥基苯甲醛:相對保留時間2.625，相對峰面積0.157 ; 峰10:相對保留時間2.665，相對峰面積0.761 ； 峰11:相對保留時間3.019,相對峰面積0.092 ； 峰12葛根素:相對保留時間3.227，相對峰面積1.932 ； 峰13:相對保留時間3.285,相對峰面積0.405 ； 峰14:相對保留時間3.373,相對峰面積0.553 ； 峰15:相對保留時間3.474,相對峰面積0.081 ； 峰16大豆苷:相對保留時間3.753，相對峰面積0.386 ； 峰17阿魏酸:相對保留時間3.922，相對峰面積0.090 ； 峰18:相對保留時間4.185,相對峰面積0.125 ；峰19:相對保留時間4.253,相對峰面積0.263 ； 峰20 β -蛻皮留酮:相對保留時間5.409，相對峰面積0.059 ； 這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;是天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
5.一種天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水15倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液； (2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液； (3)色譜條件:色譜柱為5μπιFortis-C18,250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.0ml/min ;柱溫 30°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為20 μ I ； (4)供試品溶液的測 定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為1.20g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
6.按照權利要求5所述的天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是按照本方法對10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒中間產(chǎn)品的HPLC-UV圖譜，并進行分析比較，得到由測定所得的指紋圖譜中有20個共有峰，其中，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，分別為: 峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.082 ； 峰2:相對保留時間0.569，相對峰面積0.085 ； 峰3天麻素:相對保留時間1.000，相對峰面積1.0OO ； 峰4對羥基苯甲醇:相對保留時間1.603，相對峰面積0.164 ； 峰5鹽酸川芎嗪:相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ； 峰6:相對保留時間2.217，相對峰面積0.057 ； 峰7:相對保留時間2.368，相對峰面積0.098 ； 峰8:相對保留時間2.409,相對峰面積0.430 ； 峰9對羥基苯甲醛:相對保留時間2.628，相對峰面積0.163 ； 峰10:相對保留時間2.667，相對峰面積0.772 ； 峰11:相對保留時間3.022，相對峰面積0.105 ； 峰12葛根素:相對保留時間3.228，相對峰面積1.927 ； 峰13:相對保留時間3.287，相對峰面積0.410 ； 峰14:相對保留時間3.376,相對峰面積0.568 ； 峰15:相對保留時間3.477，相對峰面積0.090 ； 峰16大豆苷:相對保留時間3.757，相對峰面積0.378 ；峰17阿魏酸:相對保留時間3.926，相對峰面積0.091 ； 峰18:相對保留時間4.189,相對峰面積0.128 ； 峰19:相對保留時間4.256,相對峰面積0.260 ； 峰20 β -蛻皮留酮:相對保留時間5.410，相對峰面積0.067 ； 這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;是天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
7.一種天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液適量，精密量取，加水I倍稀釋，混勻后，取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液； (2)對照品溶液的制備:精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、鹽酸川芎嗪、對羥基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蛻皮甾酮、大豆苷元適量，分別用純化水、純化水、70%甲醇、純化水、純化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為lmg/ml的溶液,再吸取對照品溶液各適量，用純化水稀釋成濃度分別為0.05 μ g/ml的對照品溶液； (3)色譜條件:色譜柱為5μπιFortis-C18,250X4.6mm:流動相為0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.5ml/min ;柱溫 25°C ;檢測波長:220nm ;進樣量為10 μ I ; (4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到天川顆粒中間產(chǎn)品密度為0.50g/ml水提濃縮液的HPLC-UV圖譜。
8.按照權利要求7所述的天川顆粒中間產(chǎn)品指紋圖譜的建立方法，其特征是按照本方法對10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批天川顆粒中間產(chǎn)品的HPLC-UV圖譜，并進行分析比較，得到由測定所得的指紋圖譜中有20個共有峰，其中，以3號峰即天麻素峰為參照物峰，分別為: 峰1:相對保留時間0.494,相對峰面積0.090 ； 峰2:相對保留時間0.569,相對峰面積0.089 ； 峰3天麻素:相對保留時間1.000，相對峰面積1.000 ； 峰4對羥基苯甲醇:相對保留時間1.604，相對峰面積0.162 ； 峰5鹽酸川芎嗪:相對保留時間2.017，相對峰面積0.082 ； 峰6:相對保留時間2.216,相對峰面積0.059 ； 峰7:相對保留時間2.369,相對峰面積0.104 ； 峰8:相對保留時間2.409,相對峰面積0.428 ； 峰9對羥基苯甲醛:相對保留時間2.629，相對峰面積0.162 ； 峰10:相對保留時間2.668，相對峰面積0.777 ； 峰11:相對保留時間3.024，相對峰面積0.102 ； 峰12葛根素:相對保留時間3.229，相對峰面積1.924 ； 峰13:相對保留時間3.288,相對峰面積0.408 ； 峰14:相對保留時間3.378,相對峰面積0.574 ；峰15:相對保留時間3.480,相對峰面積0.098 ； 峰16大豆苷:相對保留時間3.760，相對峰面積0.381 ； 峰17阿魏酸:相對保留時間3.929，相對峰面積0.101 ； 峰18:相對保留時間4.191,相對峰面積0.133 ； 峰19:相對保留時間4.258,相對峰面積0.262 ； 峰20 β -蛻皮留酮:相對保留時間5.410，相對峰面積0.072 ； 這些共有特征峰構成了天川顆粒中間產(chǎn)品指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于0.9 ;是天川顆粒中間產(chǎn)品標準指紋圖譜。
【文檔編號】G01N30/88GK103760287SQ201410040492
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權日:2014年1月27日
【發(fā)明者】崔美蘭, 婁紅祥, 馮波, 李潔, 于黎鑫, 常征, 王艷敏, 王水蓮 申請人:山東齊都藥業(yè)有限公司