一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，屬于生物技術(shù)和動物傳染病診斷研究領(lǐng)域。該試劑盒包含有：包被抗CSFV-Erns單克隆抗體及抗CSFV-E2單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、CSFV陽性對照和CSFV陰性對照、洗滌液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗體混合液、酶標(biāo)鏈霉親和素、酶顯色底物和終止液。其中，兩種單克隆抗體與對應(yīng)的多克隆抗體所針對的抗原表位不同。本發(fā)明的試劑盒采用生物素-親和素檢測系統(tǒng)，并對豬瘟病毒Erns及E2蛋白聯(lián)合檢測，大大提高了豬瘟病毒檢測的靈敏度、特異性和可重復(fù)性，可用于對豬瘟的診斷及研究工作。
【專利說明】—種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和動物傳染病診斷研究領(lǐng)域，具體涉及一種檢測豬瘟病毒(CSFV) Erns 及 E2 抗原的 BAS-ELISA 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬痕是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，是世界糧農(nóng)組織和各國政府嚴(yán)密監(jiān)控和檢疫的主要傳染病之一。
[0003]CSFV屬黃病毒科瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約12.3kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架(0RF)。此ORF翻譯成含3898個氨基酸殘基，分子量約438kDa的多聚蛋白，并進(jìn)一步在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下加工成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、C、Erns (E0),EUE2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除 C、Erns, El 和 E2 為結(jié)構(gòu)蛋白外?其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白。
[0004]豬感染CSFV后主要產(chǎn)生針對結(jié)構(gòu)糖蛋白E0、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的抗體。糖蛋白EO和E2是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的兩個主要保護(hù)性抗原，同時也是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必需蛋白。
[0005]Erns,是病毒的一種囊膜糖蛋白，也稱gp44/48,舊稱E0。有9個可能的糖基化位點，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu268_Ala494組成。在感染細(xì)胞中Erns在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，并可存在于細(xì)胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚體形式存在于囊膜表面。由于其分子內(nèi)缺乏疏水的膜錨定區(qū)，與病毒囊膜結(jié)合力弱，易從囊膜上游離下來。Erns可誘導(dǎo)產(chǎn)生豬瘟的中和抗體，免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對致死量CSFV的保護(hù)性免疫。由于編碼Erns的核酸序列在屬內(nèi)比編碼E2的序列保守程度高，因此Erns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白。
[0006]E2為CSFV的另一囊膜糖蛋白，又稱為gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個病毒糖蛋白中保守性最低、最易變異的分子。E2常以IOOkDa的同源二聚體及與El形成75kDa的異源二聚體形式存在于病毒粒子及CSFV感染的細(xì)胞表面。E2可誘導(dǎo)產(chǎn)生CSFV的中和抗體，免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對致死量CSFV的保護(hù)性免疫。E2的蛋白骨架由370個氨基酸(0RF編碼的657-1062氨基酸殘基)組成，并以其C端的40個疏水氨基酸錨定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可為51-58kDa。E2的抗原決定區(qū)在其N端部分(0RF編碼的第690-866氨基酸)，可分為2個獨立的抗原結(jié)構(gòu)單元，四個抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C、D。
[0007]豬瘟病毒的快速檢測對于豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前豬瘟病毒檢測方法主要有應(yīng)用病毒分離鑒定、免疫組織化學(xué)法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Elisa檢測等。其中Elisa檢測法以其快速、方便、敏感等優(yōu)點，在眾多方法中脫穎而出。但市場中的Elisa試劑盒只有檢測單一抗原的試劑盒，在樣品保存不理想時會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒。該試劑盒通過對豬瘟病毒Erns及E2蛋白進(jìn)行聯(lián)合檢測，大大提高了豬瘟病毒檢測的靈敏度、特異性和可重復(fù)性；同時，由于采用生物素-親和素檢測系統(tǒng)(BAS)，進(jìn)一步提高了試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性，避免了假陰性出現(xiàn)的可能。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的使用方法。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0011]一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，包含有:包被抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)單克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、CSFV陽性對照和CSFV陰性對照、洗滌液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗體混合液、酶標(biāo)鏈霉親和素、酶顯色底物和終止液。
[0012]所述的酶標(biāo)板包被的兩種單克隆抗體的量優(yōu)選均為0.1?0.5 ii g。
[0013]所述的多克隆抗體混合液中兩種抗體的濃度均優(yōu)選為10 U g/mL。
[0014]所述的單克隆抗體和多克隆抗體是采用原核表達(dá)的CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原分別免疫Balb/c小鼠和家兔得到。其中，CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原的制備包含如下步驟:
[0015](I)以豬瘟病毒的RNA為模板使用如下引物分別PCR擴(kuò)增CSFV-Erns和CSFV-E2片段，
[0016]Erns (F): 5 ’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3，，
[0017]Erns(R):5’ -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’，Erns(F)和 Erns(R)擴(kuò)增CSFV-Erns 片段；
[0018]E2 (F): 5 ’ -CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3，，
[0019]E2 (R): 5 ’ -CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3，，E2 (F)和 E2 (R)擴(kuò)增 CSFV-E2片段。
[0020](2)通過限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶將CSFV-Erns和CSFV-E2片段分別連接到pET30a載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-Erns和pET30a_E2_N。
[0021](3)將重組質(zhì)粒pET30a-Erns和pET30a_E2_N分別轉(zhuǎn)化到含有PGr07重組質(zhì)粒表達(dá)伴侶蛋白GroEL的BL21 (DE3)(購自Taraka公司)中進(jìn)行原核表達(dá)得到CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原。
[0022]優(yōu)選的,所述的抗CSFV-Erns單克隆抗體與兔抗CSFV-Erns多克隆抗體所針對的抗原表位不同；抗CSFV-E2單克隆抗體與兔抗CSFV-E2多克隆抗體所針對的抗原表位不同。
[0023]所述的酶標(biāo)鏈霉親和素的濃度優(yōu)選為10 U g/mL。
[0024]所述的樣品稀釋液優(yōu)選為含1%BSA、0.1%深海魚明膠、0.02%疊氮化鈉的0.0lmol/L, pH7.2 ?7.4 的 PBS。
[0025]所述的CSFV陽性對照優(yōu)選為用樣品稀釋液100倍稀釋的豬瘟病毒感染過的豬血清。
[0026]所述的CSFV陰性對照優(yōu)選為用樣品稀釋液100倍稀釋的未感染過的豬瘟病毒的
豬血清。
[0027]所述的洗滌液優(yōu)選為含0.5%Tween20的0.lmol/L, pH7.2?7.4的PBS，使用前用去離子水稀釋10倍。
[0028]所述的酶顯色底物優(yōu)選為TMB顯色液。
[0029]所述的終止液優(yōu)選為lmol/L的H2SO4溶液。
[0030]上述檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
[0031](I)將待測樣品用樣品稀釋液按1:1稀釋，每孔100 U L加入酶標(biāo)板中，同時陽性對照及陰性對照各加2孔設(shè)置對照；
[0032](2)加樣完成后，混勻孔中樣品，37°C孵育I小時；
[0033](3)棄去孔中溶液，洗滌液清洗3~5次，最后拍干；
[0034](4)每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體混合液100 u L，37°C孵育30min ；
[0035](5)重復(fù)步驟(3)，每孔加入酶標(biāo)鏈霉親和素IOOii L，37°C孵育30min ；
[0036](6)重復(fù)步驟(3)，每孔加入酶顯色底物100 ii L，室溫避光反應(yīng)10_15分鐘；
[0037](7)每孔加入100 U L終止液，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值。
[0038]所述試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn) 為:檢測中陽性對照(PC)血清的OD值與陰性對照(NC)血清的OD值之差必須大于0.4時，檢測被認(rèn)為有效；Cut off (CO值)=陰性對照光吸收值OD450nmX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45(lnm/C0值，其中，樣品值> I為陽性；樣品值≤I為陰性。
[0039]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點和效果:
[0040](I)本發(fā)明由于使用了 BAS-Elisas檢測系統(tǒng)，大大提高了試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性。
[0041 ] (2)本發(fā)明通過雙抗原來聯(lián)合檢測豬瘟病毒，大大提高了豬瘟病毒檢測的靈敏度、特異性和可重復(fù)性，因此較市場上常規(guī)試劑盒更加靈敏，避免了假陽性的出現(xiàn)，可用于對豬瘟病毒感染的診斷及研究工作。
[0042](3)本發(fā)明通過采用即用型單一溶液TMB顯色液，較常規(guī)試劑盒所用雙組分顯色液使用更加便利，結(jié)果更穩(wěn)定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1是重組豬瘟病毒(CSFV)Erns及E2蛋白小量表達(dá)SDS-PAGE電泳圖，其中泳道I為全菌裂解液，泳道2為裂解液上清。
【具體實施方式】
[0044]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0045]實施例1豬瘟病毒Erns及E2重組蛋白的制備
[0046](I)根據(jù)NCBI GeneBank中豬瘟病毒石門株全基因組序列(登錄號AF333000.1)，以豬瘟病毒石門株囊膜蛋白Erns全序列及E2主要抗原區(qū)B/C區(qū)和D/A區(qū)的基因序列為模板設(shè)計合成引物，二者引物分別為:
[0047]Erns (F): 5，-CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3，，[0048]Erns(R): 5，-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG—3，，
[0049]E2(F):5， -CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3，，
[0050]E2(R):5， -CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3，。
[0051]其中，下劃線部分為引入的酶切位點，Erns(F)為CSFV-Erns基因上游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點為BamHI，Erns (R)為CSFV-Erns基因下游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點為XhoI ；E2 (F)為CSFV-E2基因上游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點為BamHI，E2 (R)為CSFV-E2基因下游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點為Xhol。
[0052](2)以從豬瘟病毒石門株中提取的RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取Erns及E2蛋白目的基因。
[0053](3)構(gòu)建重組表達(dá)載體:將表達(dá)質(zhì)粒pET30a用限制性內(nèi)切酶(同上述引物的酶切位點)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒(購自Invitrogen公司)回收載體大片段；將上述PCR擴(kuò)增出的目的基因雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下與載體大片段。
[0054](4)將步驟(3)中所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp/Kan或藍(lán)白斑)作篩選，挑取單斑，菌落PCR初步鑒定。
[0055](5)重組表達(dá)載體的鑒定:提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得了約為680bp及530bp的DNA片段，與預(yù)期的CSFV-Erns(681bp)及CSFV-E2主要抗原區(qū)(53Ibp)大小一致。將酶切片段與預(yù)期相符的CSFV-Erns及CSFV-E2陽性克隆送至華大基因公司測序，結(jié)果顯示插入的位置、方向、大小、讀碼框及核苷酸序列均正確，將以上兩種重組質(zhì)粒命名為pET30a-Erns及 pET30a-E2-N。
[0056](6)含伴侶蛋白感受態(tài)表達(dá)宿主菌的制作:為了提高CSFV-Erns及CSFV-E2在上清表達(dá)的幾率，將測序正確的重組質(zhì)粒pET30a-Erns及pET30a_E2_N分別轉(zhuǎn)化到含有PGr07重組質(zhì)粒表達(dá)伴侶蛋白GroEL的BL21 (DE3)(購自Taraka公司)感受態(tài)細(xì)胞中。
[0057](7)小量誘導(dǎo)表達(dá):挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落接種到3mL LB培養(yǎng)液(含10 U g/mL的卡那霉素和20 ii g/mL的氯霉素)中，37°C、180rpm將細(xì)菌培養(yǎng)至OD=0.2 ;加入伴侶蛋白的誘導(dǎo)劑四環(huán)素(終濃度5ng/mL)和L-阿拉伯糖(終濃度lmg/mL)，37°C、180rpm繼續(xù)將細(xì)菌培養(yǎng)至OD=L 0 ;加入終濃度為0.5mM的IPTG，30°C、180rpm誘導(dǎo)過夜。
[0058](8)表達(dá)蛋白的鑒定:將誘導(dǎo)過夜的宿主菌收集、破碎，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后，經(jīng)染色和脫色后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的pET30a-Erns重組菌在60KD處有明顯的伴侶蛋白GroEL表達(dá)，在26KD處有明顯的重組蛋白Erns表達(dá)，說明表達(dá)成功；誘導(dǎo)表達(dá)的pET30a-E2-N重組菌在60KD處有明顯的伴侶蛋白GroEL表達(dá)，在20KD處有明顯的重組蛋白E2表達(dá)，說明表達(dá)成功(圖1)。
[0059](9)重組CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá):將含有正確表達(dá)載體的大腸桿菌接種于大量培養(yǎng)液中以小量誘導(dǎo)相同條件誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌液，超聲波裂解菌液菌液澄清或疏散狀態(tài)；11000rpm、4°C離心30min，將上清與沉淀分離，保存于40C。分別取上清與沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)重組CSFV-Erns及CSFV-E2均在上清表達(dá)。
[0060](10)重組CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白的純化:Ni_NTA瓊脂糖柱(Qiagen，貨號30210)按說明書說明純化。[0061]實施例2抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)多克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)多克隆抗體的制備及生物素標(biāo)記
[0062](I)將實施例1純化的重組CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白分別免疫實驗用家兔，三免后7天采血檢測Elisa效價，達(dá)到兔血清效價達(dá)到1:100000后，進(jìn)行沖擊免疫，7天后采集兔血清；
[0063](2)以重組 CSFV-Erns 及 CSFV-E2 蛋白分別偶聯(lián) CNBr-activated Sepharose4Bbeads (購自GE),制備抗原親和純化層析柱；
[0064](3)將步驟(I)制得的兔血清用步驟(2)制得的親和純化層析柱純化，獲得兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及兔抗CSFV-Erns多克隆抗體；
[0065](4)將步驟(I)制得的兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及兔抗CSFV-Erns多克隆抗體以0.lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH9.0)或0.5mol/L硼酸緩沖液(pH8.6)稀釋到2_5mg/mL ；
[0066](5)將活化的生物素(Sulfo-NHS-Biotin，購自Thermo，貨號21425)，以去離子水溶解，并與步驟(4)稀釋的抗體混合，在室溫下反應(yīng)1-3小時；
[0067](6)在4°C條件下，以0.01mol/L、pH7.2-7.4的PBS充分透析反應(yīng)混合物或以脫鹽柱脫鹽，除去游離的生物素，即得生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體。
[0068](7)將步驟(6)制得生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體以Bradford法測定濃度,然后按2mg每支的規(guī)格將兩種生物素化抗體分別進(jìn)行分裝，并凍干保存?zhèn)溆谩?br> [0069]實施例3抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)單克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)單克隆抗體的制備
[0070](I)將實施例1純化的重組CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白分別免疫Balb/c小鼠，三免后，取Elisa效價達(dá)到1:10000的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，以HAT培養(yǎng)基37°C、飽和濕度、5%C02培養(yǎng)融合細(xì)胞。
[0071](2)融合后第四天開始觀察集落，待集落生長至孔底約1/6時半量換HT培養(yǎng)基，次日分別以重組CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白包板進(jìn)行間接Elisa檢測，挑選出陽性孔進(jìn)行亞克隆。
[0072](3)亞克隆:以常規(guī)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。亞克隆板第5天以CSFV陽性血清1:1000包板進(jìn)行間接Elisa檢測，挑選出陽性孔轉(zhuǎn)入24孔板進(jìn)行第二次亞克隆(二亞)。
[0073](4) 二亞第5天，取培養(yǎng)上清同步進(jìn)行免疫熒光(IF)及以下五種Elisa檢測:
[0074]A.以重組CSFV-Erns及CSFV-E2蛋白包板的間接Elisa檢測；
[0075]B.以CSFV陽性血清1:1000包板的間接Elisa檢測；
[0076]C.先以CSFV-Erns中和抗CSFV-Erns的陽性孔上清、以CSFV-E2中和抗CSFV-E2的陽性孔上清，將中和后的上清進(jìn)行B檢測；
[0077]D.先以CSFV-E2中和抗CSFV-Erns的陽性孔上清、以CSFV-Erns中和抗CSFV-E2的陽性孔上清，將中和后的上清進(jìn)行B檢測；
[0078]E.以實施例2制得的兔抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)多克隆抗體及兔抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)多克隆抗體分別包板，以CSFV-Erns及CSFV-E2重組作為中間抗原進(jìn)行的阻斷Elisa檢測。[0079](5)最終分別篩選出同時滿足免疫熒光(IF)陽性及A、B、D、E檢測陽性，C檢測陰性的抗CSFV-Erns細(xì)胞株及抗CSFV-E2的細(xì)胞株。此兩株雜交瘤細(xì)胞即為可識別豬瘟病毒Erns蛋白的細(xì)胞株及E2蛋白的的細(xì)胞株，同時二者又與實施例2制得的兔抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)多克隆抗體及兔抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)多克隆抗體所針對的抗原表位不同。
[0080](6)細(xì)胞株凍存及腹水制備:將上述成功建株的兩株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行凍存，同時各打3只小鼠制備腹水，每只小鼠腹腔注射細(xì)胞量為5 X IO5?I X IO6個/0.5mL。
[0081](7)將制得的小鼠腹水以辛酸硫酸銨沉淀法純化，透析，制得抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)單克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)單克隆抗體。
[0082]實施例4檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒的制備
[0083](I)試劑盒中溶液的配制:
[0084]I)包被緩沖液(0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液):準(zhǔn)確稱取1.59g碳酸鈉，2.93g碳酸氫鈉，加蒸餾水至1000mL。
[0085]2)樣品稀釋液:在0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入1% (m/v)BSA、0.1% (m/v)深海魚明膠、0.02% (m/v)疊氮化鈉(NaN3)配制而成。
[0086]3)濃縮洗滌液(IOX ):在0.lmol/L,pH7.2?7.4的PBS中加入體積比為0.5%的Tween20，使用前以去離子水稀釋10倍備用。
[0087]4)終止液:取54.3mL濃度為95%的濃硫酸，加蒸餾水至IOOOmL,制成濃度為Imol/L的H2SO4溶液。
[0088](2)抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)單克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)單克隆抗體的包被:將實施例3中所純化的抗體以包被緩沖液稀釋成I U g/mL,取等量抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns)單克隆抗體及抗豬瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)單克隆抗體混勻，兩種單抗終濃度均為0.5 ii g/mL,每孔加此單抗混合液100 u L，4°C包被過夜。
[0089](3)酶標(biāo)板的封閉:用5%的BSA (以0.01mol/L, pH7.2?7.4的PBS配制)封閉，每孔150 u L，37°C溫育lh，洗滌2?-3次，拍干。
[0090]CSFV陽性對照的制備:采集豬瘟病毒感染過的豬血清，以樣品稀釋液100倍稀釋。
[0091]CSFV陰性對照的制備:采集未感染過的豬瘟病毒的健康豬血清，以樣品稀釋液100倍稀釋。
[0092](4)生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體混合液制備:取實施例2中制得的生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體凍干品，分別以lmL50%甘油溶解成2mg/mL。然后將溶解好的兩種生物素化多抗各取100 ii L加入樣品稀釋液至20mL，制備成生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體混合工作液。
[0093](5)酶標(biāo)鏈霉親和素制備:所述酶標(biāo)鏈霉親和素為終濃度為10 U g/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，該酶標(biāo)鏈霉親和素可以商購，或按本領(lǐng)域常規(guī)方法一過碘酸鈉法將HRP標(biāo)記于鏈霉親和素。其步驟是:稱取5mg HRP溶于0.5mL蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06mol/L Na104水溶液0.5mL,混勻置冰箱4度反應(yīng)30分鐘，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,于室溫避光反應(yīng)30分鐘后加入含5mg鏈霉親和素(Strepavidin)的水溶液ImL,混勻并裝透析袋與0.05mol/L, pH9.5碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h或過夜,使之結(jié)合。然后吸出加入NaBH4溶液(5mg/mL) 0.2mL，置冰箱2h，取出加入等體積飽和硫酸銨。放冰箱30min后離心，將所得沉淀物溶于少量0.02mol/L, pH7.4PBS中，并透析過夜。次日再離心除去不溶物，即得酶標(biāo)鏈霉親和素。用0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL進(jìn)行測定后，冷凍干燥保存。使用時，以含1%BSA、0.01mol/L pH7.4的PBS稀釋成10 u g/mL備用。
[0094](4)酶顯色底物:為購自Sigma的商用即用型單一溶液TMB顯色液(貨號:T8665)。
[0095]實施例5豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒的檢測方法
[0096]利用本發(fā)明(實施例4)的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒在檢測豬瘟病毒中的應(yīng)用 ，其步驟是:
[0097]( I)從試劑盒中取出酶標(biāo)板，將待測血清或其它樣品用樣品稀釋液按1:1稀釋，每孔100 u L加入酶標(biāo)板中，同時陽性對照及陰性對照各加2孔設(shè)置對照；
[0098](2)加樣完成后,輕振酶標(biāo)板混勾孔中樣品，37 C鮮育I小時；
[0099](3)棄去孔中溶液，洗滌液清洗3~5次，最后一次在吸水紙上拍干；
[0100](4)每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體混合液(10 u g/mL) 100 u L，37°C孵育30min ；
[0101](5)重復(fù)步驟(3)，每孔加入酶標(biāo)鏈霉親和素(10 i! g/mL) 100uL,37°C孵育30min ；
[0102](6)重復(fù)步驟(3)，每孔加入TMB顯色液100 ii L，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘；
[0103](7)每孔加入100 ii L終止液，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值(OD45tolX
[0104]本發(fā)明試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)為:檢測中陽性對照(PC)血清的OD值與陰性對照(NC)血清的OD值之差必須大于0.4時，檢測被認(rèn)為有效；Cut off (CO值)=陰性對照光吸收值OD450nmX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45(lnm/C0值，其中，樣品值> I為陽性；樣品值≤I為陰性。
[0105]實施例6本發(fā)明試劑盒的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性測試
[0106](I)特異性檢測
[0107]按實施例5所述的檢測方法，利用實施例4制得的試劑盒分別檢測豬瘟病毒(CSFV)感染的血清、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV，又稱豬藍(lán)耳病毒)感染的血清、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染的血清、豬偽狂犬病毒(PRV)感染的血清、豬乙型腦炎病毒(JEV)感染的血清和豬瘟病毒陰性血清。
[0108]每種血清平行加樣三個孔，測定OD45tlnm值，計算其OD45tlnm平均值。結(jié)果如下表所示:
[0109]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于包含有:包被抗CSFV-Erns單克隆抗體及抗CSFV-E2單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、CSFV陽性對照和CSFV陰性對照、洗滌液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗體混合液、酶標(biāo)鏈霉親和素、酶顯色底物和終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的酶標(biāo)板包被的兩種單克隆抗體的量均為0.01~0.05 y g ;所述的多克隆抗體混合液中兩種抗體的濃度均為IOii g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的單克隆抗體和多克隆抗體是采用原核表達(dá)的CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原分別免疫Balb/c小鼠和家兔得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原的制備包含如下步驟: (1)以豬瘟病毒的RNA為模板使用如下引物分別PCR擴(kuò)增CSFV-Erns和CSFV-E2片段，
Erns(F):5’ -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3，,
Erns(R):5，-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3，；
E2(F):5’ -CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG-3，,
E2(R):5’ -CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG-3?； (2)通過限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶將CSFV-Erns和CSFV-E2片段分別連接到pET30a載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-Erns和pET30a_E2_N ； (3)將重組質(zhì)粒pET30a-Erns和pET30a-E2_N分別轉(zhuǎn)化到含有PGr07重組質(zhì)粒表達(dá)伴侶蛋白GroEL的BL21中進(jìn)行原核表達(dá)得到CSFV-Erns及CSFV-E2重組抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的酶標(biāo)鏈霉親和素的濃度為IOii g/mL ;所述的抗CSFV-Erns單克隆抗體與兔抗CSFV-Erns多克隆抗體所針對的抗原表位不同；抗CSFV-E2單克隆抗體與兔抗CSFV-E2多克隆抗體所針對的抗原表位不同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的樣品稀釋液為含1% BSA、0.1%深海魚明膠、0.02%疊氮化鈉的0.01mol/L, pH7.2 ~7.4 的 PBS0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的CSFV陽性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的豬瘟病毒感染過的豬血清；所述的CSFV陰性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的未感染過的豬瘟病毒的豬血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的洗滌液為含0.5% Tween20的0.lmol/L, pH 7.2~7.4的PBS，使用前用去離子水稀釋10倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒，其特征在于:所述的酶顯色底物為TMB顯色液；所述的終止液為lmol/L的H2SO4溶液。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述的檢測豬瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟: (1將待測樣品用樣品稀釋液按1:1稀釋，每孔100 U L加入酶標(biāo)板中，同時陽性對照及陰性對照各加2孔設(shè)置對照； (2)加樣完成后,混勾孔中樣品，37C鮮育I小時； (3)棄去孔中溶液，洗滌液清洗3~5次，最后拍干； (4)每孔加入生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體及生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗體混合液100 u L，37°C孵育30min ； (5)重復(fù)步驟(3)，每孔加入酶標(biāo)鏈霉親和素100iiL，37°C孵育30min； (6)重復(fù)步驟(3)，每孔加入酶顯色底物100y L，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘； (7)每孔加入100u L終止液，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值； 所述試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)為:檢測中CSFV陽性對照的OD值與CSFV陰性對照的OD值之差必須大于0.4時，檢測被認(rèn)為有效；Cut off=陰性對照光吸收值OD45tolX2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45(lnm/C0值，其中，樣品值>1為陽性；樣品值≤1為陰性。
【文檔編號】G01N33/569GK103760365SQ201410040870
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】李建, 曹娟, 廖園園, 秦偉, 朱薇, 劉潔, 漆世華, 謝紅玲, 馮釗 申請人:武漢中博生物股份有限公司