一種檢測人巨細(xì)胞病毒pp65抗原的elisa方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測人巨細(xì)胞病毒（HCMV）PP65抗原的ELISA方法，它是一種檢測HCMV活動性感染指標(biāo)的臨床檢測方法。本發(fā)明主要是解決現(xiàn)有HCMV活動性感染檢測方法存在的敏感性或特異性低、費(fèi)時費(fèi)力、操作繁瑣和使用不便的問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其包括下列步驟：1）制備檢測試劑盒：所述檢測試劑盒包括：包被有大鼠抗重組PP65322-561多克隆抗體（pAb）的酶標(biāo)板、兔抗重組PP65322-561pAb、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗滌液、底物顯色液、終止液和封板膜；2）制備待測標(biāo)本；3）檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原。本發(fā)明具有較好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，易于規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化操作等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】—種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測人巨細(xì)胞病毒(HCMV)PP65抗原的ELISA方法，它是一種檢測HCMV活動性感染指標(biāo)的臨床檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)屬皰疫病毒科0屬雙鏈DNA病毒。HCMV可通過口腔、生殖道、胎盤、授乳以及輸血或器官移植等多途徑傳播。人群感染HCMV的顯著特點(diǎn)是感染率高，正常成人HCMV抗體陽性率為76.7% - 95.8%，我國也是HCMV感染高度流行國家之一。然而正常人初次感染此病毒多無明顯癥狀，病毒也不能徹底清除，而是潛伏體內(nèi)。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時，潛伏病毒開始復(fù)制并大量增殖，繼發(fā)活動性感染并表現(xiàn)多種臨床癥狀。臨床活動性HCMV感染多見于孕婦，新生兒、輸血患者、惡性腫瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制劑的患者。孕婦活動性感染可通過胎盤、產(chǎn)道或授乳傳給胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)，死胎，胎兒形態(tài)畸形，器官功能障礙。先天感染的新生兒出生時可伴有黃疸、瘀斑、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、小頭畸形等，而無癥狀的部分新生兒，隨著發(fā)育才逐漸被發(fā)現(xiàn)聽覺、視力低下，智力發(fā)育遲緩，運(yùn)動障礙等。在惡性腫瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能減弱或受抑制的患者HCMV的活動性感染常并發(fā)間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、食管炎、結(jié)腸炎和腦膜腦炎等多器官臟器損害的各種臨床綜合征，是患者致死或移植術(shù)失敗的重要原因。因此，早期快速檢測HCMV活動性感染以便及時抗病毒藥物治療或及時終止妊娠是降低HCMV危害的重要措施之一。
[0003]目前，臨床檢測HCMV活動性感染常用的檢測方法是--①ELISA檢測HCMV特異抗體IgM的方法:優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速、廉價、易于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化操作。但因IgM產(chǎn)生早而消失快、僅感染早期可檢測到，所以IgM檢測HCMV活動性感染敏感性低，而且由于免疫功能低下者不能充分產(chǎn)生IgM，所以特異性也不夠理想。②FQ-PCR檢測HCMV核酸的方法:通過定量HCMV DNA判斷是否為活動性感染，目前已代替因敏感性過高而被淘汰的普通PCR，盡管如此，由于定量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，需要配套的特殊設(shè)備，敏感性高而特異性較低等因素，F(xiàn)Q-PCR也不是最完美的檢測方法。③熒光免疫組化或酶免疫組化檢測HCMV PP65抗原的方法:PP65在不同HCMV病毒株中高度保守。HCMV —旦復(fù)制出被膜磷蛋白PP65就說明病毒完成復(fù)制、產(chǎn)生大量子代病毒并將導(dǎo)致臨床疾病的發(fā)作，即HCMV的活動性感染。PP65在被膜蛋白中占95%以上，在受感染者外周白細(xì)胞中檢出率極高，所以PP65是檢測HCMV活動性感染既敏感又特異的指標(biāo)。但是PP65抗原主要存在于白細(xì)胞核內(nèi)，檢測PP65抗原需要將白細(xì)胞固定在玻片上進(jìn)行熒光免疫組化或酶免疫組化，顯微鏡下觀察計數(shù)PP65抗原陽性細(xì)胞，不僅需要配備熒光顯微鏡或者 配套輸出設(shè)備和有經(jīng)驗的鏡檢人員，而且操作繁瑣，每個樣本需要一個玻片固定檢測，難以規(guī)?；瘷z測。為此，國內(nèi)個別醫(yī)院已將熒光免疫組化法改進(jìn)為流式細(xì)胞術(shù)檢測，但是仍然離不開流式細(xì)胞儀和有經(jīng)驗流式細(xì)胞術(shù)操作分析人員，難以普及到基層醫(yī)院，也難以規(guī)?；繖z測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有HCMV活動性感染檢測方法存在的敏感性或特異性低、費(fèi)時費(fèi)力、操作繁瑣和使用不便的問題，提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低廉、易于普及和標(biāo)準(zhǔn)化的檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其包括下列步驟:
[0007]I)制備檢測試劑盒
[0008]所述檢測試劑盒包括:包被有大鼠抗重組PP6 5 322_561多克隆抗體(pAb)的酶標(biāo)板、兔抗重組PP6 5 322_561pAb、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗滌液、底物顯色液、終止液和封板膜；
[0009]①所述大鼠抗重組PP65pAb的酶標(biāo)板的制備:
[0010]a)大鼠抗重組PP65pAb的制備:
[0011]免疫前大鼠斷尾采血，分離血清，作為免疫血清效價檢測的陰性對照；取70-170 u g重組PP65抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫大鼠；免疫后14-21天，取70-130 Ug重組PP65抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，第二次皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫大鼠；第二次免疫后21-30天，與第二次方法一樣再次加強(qiáng)免疫；第三次免疫后第10天，采血分離血清，ELISA檢測抗體效價,證明免疫成功后,心臟采血獲取免疫血清,飽和硫酸銨沉淀法純化免疫血清,得到所需大鼠抗重組PP65的pAb ；
[0012]b)包被酶標(biāo)板:
[0013]包被液稀釋大鼠抗重組PP65pAb為1: 2000，每孔50 y I加入酶標(biāo)板中，4°C包被過夜；棄去孔內(nèi)的包被液，PBST洗2次，拍干，加封閉液每孔100 yl，置37°C封閉2h，PBST洗3次，拍干；
[0014]②所述兔抗重組PP65pAb的制備:
[0015]免疫前兔耳緣靜脈采血，分離血清，作為免疫血清效價檢測的陰性對照；取100-300 u g重組PP65抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫兔子；免疫后14-28天，取90-170 Ug重組PP65抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，第二次皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫兔子；第二次免疫后28-42天，與第二次方法一樣再次加強(qiáng)免疫；第三次免疫后第10-20天，采血分離血清，ELISA檢測抗體效價，證明免疫成功后,心臟采血獲取免疫血清,飽和硫酸銨沉淀法純化免疫血清,得到所需兔抗重組HCMVPP65的pAb ；
[0016]③所述標(biāo)準(zhǔn)品為封閉液對倍稀釋重組PP65抗原從640ng/ml至10ng/ml共7個標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度，即 640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml 和 10ng/ml ；
[0017]2)制備待測標(biāo)本
[0018]取待測新鮮抗凝血2_3ml，溶解破壞紅細(xì)胞，150-250 U I生理鹽水懸浮白細(xì)胞，或調(diào)白細(xì)胞濃度為io5/mi左右，冰浴環(huán)境下超聲裂解白細(xì)胞釋放核內(nèi)抗原，或反復(fù)凍融裂解法釋放核內(nèi)抗原，離心取上清即為制備的待測標(biāo)本；
[0019]3)檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原
[0020]a)將標(biāo)準(zhǔn)品各濃度PP65抗原和待測標(biāo)本每孔50 U I加入酶標(biāo)板中，37°C孵育lh，PBST洗滌5次，拍干；
[0021]10加兔抗重組？?65?413，每孔50111，371:孵育lh，PBST洗滌5次，拍干；
[0022]c)加HRP-羊抗兔IgG，每孔50 U 1，37°C孵育lh, PBST洗滌5次，拍干；
[0023]d)加底物顯色液，每孔100 U 1，室溫避光顯色15min ；
[0024]e)加終止液，每孔50 U 1，酶標(biāo)儀檢測并記錄0D450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣本的PP65抗原含量。
[0025]所述大鼠抗重組PP65pAb和兔抗重組PP65pAb還能用針對重組PP65322_561抗原的任意兩種多克隆抗體搭配或者與單克隆抗體搭配。
[0026]所述HRP-羊抗兔IgG還可以是堿性磷酸酶或生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG。
[0027]多克隆抗體(pAb)包含針對多種抗原表位的抗體成份，檢測抗原的敏感性較單克隆抗體高，但容易發(fā)生非特異交叉反應(yīng)，本發(fā)明采用多次反復(fù)免疫動物以獲取高效價PAb(1:400000的兔pAb和1:20000的大鼠pAb)，并用免疫動物可能接觸到的環(huán)境微生物(大腸桿菌、變形桿菌、葡萄球菌、鏈球菌)抗原與所得PAb反應(yīng)，克服了其容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)。通過比較兔和大鼠PAb包被酶標(biāo)板的檢出特異性，選擇了大鼠pAb為包被抗體，兔pAb為檢測一抗。通過對單純皰疹病毒I型和II型感染患者的白細(xì)胞抗原的檢測，排除了本發(fā)明非特異結(jié)合單純皰疹病毒抗原的可能，更肯定了試劑的特異性。
[0028]將101份臨床疑似HCMV感染患者的血清分別用FQ-PCR試劑(中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因中心)和IgM試劑(意大利DIA.PRO公司)檢測，同時用本發(fā)明檢測患者外周白細(xì)胞PP65抗原。三種檢測方法檢出的陽性例數(shù)分別是26例、18例和25例。檢測結(jié)果的比較分別見表1和表2。
[0029]表1FQ-PCR檢測HCMV-DNA與本發(fā)明檢測HCMV-PP65抗原檢測結(jié)果比較
【權(quán)利要求】
1.一種檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是:包括下列步驟: 1)制備檢測試劑盒 所述檢測試劑盒包括:包被有大鼠抗重組PP6 5 322_561多克隆抗體(pAb)的酶標(biāo)板、兔抗重組PP6 5 322_561pAb、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗滌液、底物顯色液、終止液和封板膜； ①所述大鼠抗重組PP65pAb的酶標(biāo)板的制備: a)大鼠抗重組PP65pAb的制備: 免疫前大鼠斷尾采血，分離血清，作為免疫血清效價檢測的陰性對照；取70-170 y g重組PP65抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫大鼠；免疫后14-21天，取70-130 ii g重組PP65抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，第二次皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫大鼠；第二次免疫后21-30天，與第二次方法一樣再次加強(qiáng)免疫；第三次免疫后第10天，采血分離血清，ELISA檢測抗體效價，證明免疫成功后，心臟采血獲取免疫血清，飽和硫酸銨沉淀法純化免疫血清，得到所需大鼠抗重組PP65的 pAb ； b)包被酶標(biāo)板: 包被液稀釋大鼠抗重組PP65pAb為1: 2000，每孔50 ill加入酶標(biāo)板中，4°C包被過夜；棄去孔內(nèi)的包被液，PBST洗2次，拍干，加封閉液每孔100 yl，置37°C封閉2h，PBST洗3次，拍干; ②所述兔抗重組PP65pAb的制備: 免疫前兔耳緣靜脈采血，分離血清，作為免疫血清效價檢測的陰性對照；取100-300 ii g重組PP65抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫兔子；免疫后14-28天，取90-170 Ug重組PP65抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合，振蕩混勻制成乳化劑，第二次皮下及皮內(nèi)多位點(diǎn)免疫兔子；第二次免疫后28-42天，與第二次方法一樣再次加強(qiáng)免疫；第三次免疫后第10-20天，采血分離血清，ELISA檢測抗體效價，證明免疫成功后,心臟采血獲取免疫血清,飽和硫酸銨沉淀法純化免疫血清,得到所需兔抗重組HCMVPP65的pAb ； ③所述標(biāo)準(zhǔn)品為封閉液對倍稀釋重組PP65抗原從640ng/ml至10ng/ml共7個標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度，即 640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml 和 10ng/ml ； 2)制備待測標(biāo)本 取待測新鮮抗凝血2-3ml，溶解破壞紅細(xì)胞，150-250 U I生理鹽水懸浮白細(xì)胞，或調(diào)白細(xì)胞濃度為105/ml左右，冰浴環(huán)境下超聲裂解白細(xì)胞釋放核內(nèi)抗原，或反復(fù)凍融裂解法釋放核內(nèi)抗原，離心取上清即為制備的待測標(biāo)本； 3)檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原 a)將標(biāo)準(zhǔn)品各濃度PP65抗原和待測標(biāo)本每孔50u I加入酶標(biāo)板中，37°C孵育lh，PBST洗滌5次，拍干； b)加兔抗重組PP65pAb，每孔50iU，37°C孵育lh,PBST洗滌5次，拍干； c)加HRP-羊抗兔IgG，每孔50u 1，37°C孵育lh，PBST洗滌5次，拍干； d)加底物顯色液，每孔100Ul，室溫避光顯色15min ； e)加終止液，每孔50u 1，酶標(biāo)儀檢測并記錄0D450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣本的PP65抗原含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是:所述大鼠抗重組PP65pAb和兔抗重組PP65pAb還能用針對重組PP6 5 322_561抗原的任意兩種多克隆抗體搭配或者與單克隆抗體搭配。
3.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的檢測人巨細(xì)胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是:所述HRP-羊抗兔IgG還可以是堿性磷酸酶或生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG。
【文檔編號】G01N33/535GK103760347SQ201410040889
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】樊衛(wèi)平, 孔令文, 羅旭光, 劉玲玲, 王亮 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)