一種鑒別女貞子藥材或衍生品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別女貞子藥材或衍生品的方法，包括：對(duì)女貞子藥材或衍生品進(jìn)行提取，得到含有活性成分組的女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物；對(duì)女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物進(jìn)行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測(cè)，根據(jù)指紋圖譜得到所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中若干個(gè)活性成分特征峰峰強(qiáng)度；并用相同方式測(cè)定出各活性成分相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參照品的特征峰峰強(qiáng)度；通過定量分析手段測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量；利用特征峰峰強(qiáng)度的比值和標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量，計(jì)算出女貞子藥材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分組的含量。本發(fā)明可以反映女貞子中含有哪些女貞子環(huán)烯醚萜苷類化合物以及它們之間的比例，達(dá)到對(duì)女貞子藥材品種和質(zhì)量鑒定的目的。
【專利說明】一種鑒別女貞子藥材或衍生品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥用植物的鑒別領(lǐng)域，具體地，涉及一種鑒別女貞子藥材或衍生品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]女貞子是木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果實(shí),為我國(guó)著名的中藥材。女貞子歸肝、腎經(jīng)，藥性涼，味甘、苦，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效[國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，43]。其活性成分主要為環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有降血糖、抗失血性休克、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫、抗菌抗炎等作用[劉洪，等.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)2003，19(4):254.]。
[0003]定性鑒別上述某類活性成分或定量測(cè)定其某種活性成分含量，已成為評(píng)價(jià)女貞子及其制劑質(zhì)量的重要方法。例如中國(guó)藥典2010版是用HPLC方法對(duì)女貞子藥材中環(huán)烯醚萜苷類成分特女貞苷進(jìn)行定性和定量分析。但這種針對(duì)單一成分進(jìn)行定性、定量分析的質(zhì)量檢測(cè)模式不能有效控制中藥材的內(nèi)在質(zhì)量，無法滿足當(dāng)前對(duì)于客觀有效地評(píng)價(jià)和控制女貞子及其制劑質(zhì)量的迫切要求。
[0004]指紋圖譜技術(shù)是目前國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的方法。人們憑借實(shí)用的指紋圖譜不僅可確認(rèn)該產(chǎn)品的真?zhèn)?，同時(shí)能評(píng)價(jià)其質(zhì)量。目前，女貞子藥材及其制劑的的指紋圖譜研究工作，集中在三萜酸類化合物HPLC指紋圖譜[徐長(zhǎng)根，等.中藥新藥與藥理臨床2005，16 (5): 1922.]和X射線衍射Fourier指紋圖譜[史昆波，等.中藥材2007，30 (6):]。環(huán)烯醚萜苷類化合物指紋圖譜未見報(bào)道。而且HPLC指紋圖譜由于受非色譜條件(如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器靈敏度等)影響較大和需用多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品等等原因，重復(fù)性和可行性均存在許多局限性；X射線指紋圖譜因中藥各組分衍射效應(yīng)的疊加而顯得較為復(fù)雜和信息豐富，指紋譜與化學(xué)成分間缺乏相關(guān)性，樣品前處理和試驗(yàn)條件直接影響測(cè)量結(jié)果，對(duì)特定樣品所得譜圖的定性、定量分析需要由高水平專家參與[孫國(guó)祥，等.中南藥學(xué)2009，10(6):] ο.,
[0005]I⑶核磁共振碳譜偶聯(lián)(I⑶13C NMR coupling)指紋圖譜技術(shù)，也叫反門控去偶核磁共振碳譜偶聯(lián)指紋圖譜技術(shù)，該技術(shù)是在已研究多年的核磁共振氫譜(1H NMR)指紋圖譜技術(shù)[趙天增，等.1HNMR指紋法鑒定植物中藥，中草藥2000，31 (11) =868-870]的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他技術(shù)(例如目前應(yīng)用最廣泛的高效液相(HPLC)指紋圖譜技術(shù)[謝培山等，中藥色譜指紋圖譜，人民衛(wèi)生出版社，2005])提出的一種新的非單一手段綜合指紋圖譜技術(shù)。目前為止，并未將鑒別女貞藥材或衍生品，利用I⑶核磁共振碳譜偶聯(lián)指紋圖譜技術(shù)的報(bào)道。
[0006]女貞子的品質(zhì)不在于某個(gè)單一成分，其療效是多個(gè)成分協(xié)同配比的結(jié)果。因此，建立不僅能控制女貞子活性成分，而且能控制這些活性成分之比例的IGD核磁共振碳譜偶聯(lián)指紋圖譜勢(shì)在必行。女貞子藥材或衍生品IGD核磁共振碳譜偶聯(lián)指紋圖譜的研究與應(yīng)用，不僅可以解決我國(guó)女貞子藥材或衍生品鑒別和評(píng)價(jià)的難題，也為加強(qiáng)女貞子藥材或衍生品內(nèi)在成分研究的系統(tǒng)化與標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)現(xiàn)與國(guó)際接軌提供了科學(xué)的保證。隨著該技術(shù)在其他中藥材或衍生品中的推廣應(yīng)用，該技術(shù)的重大科學(xué)價(jià)值必將日趨突出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別女貞子藥材或衍生品的方法，該方法利用了 IGD核磁共振碳譜偶聯(lián)指紋圖譜技術(shù)。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的鑒別女貞子藥材或衍生品的方法，包括以下步驟:
[0009]I)對(duì)女貞子藥材或衍生品進(jìn)行提取，得到含有活性成分組(環(huán)烯醚萜苷)的女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物；
[0010]2)對(duì)所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物進(jìn)行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測(cè)，根據(jù)指紋圖譜得到所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中若干個(gè)活性成分特征峰峰強(qiáng)度；并用相同方式(IGD核磁共振碳譜指紋圖譜)測(cè)定出所述各活性成分相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參照品的特征峰峰強(qiáng)度；
[0011]3)通過定量分析手段測(cè)定得到所述標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量；
[0012]4)利用所述特征峰峰強(qiáng)度(各活性成分特征峰峰強(qiáng)度及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參照品的特征峰峰強(qiáng)度)的比值和所述標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量，計(jì)算出女貞子藥材或衍生品中各活性成分的含量及該類活性成分的總含量，即活性成分組的含量。
[0013]其中，采用具有獲得清晰IGD核磁共振碳譜指紋圖譜的提取工藝作為所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物的提取方式。
[0014]其中，步驟I)中，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物的制備方法，包括:稱取女貞子藥材或飲片粉碎，加入90?95%乙醇回流提取或超聲提取2?3次，每次提取I?2小時(shí)，過濾后合并濾液，減壓濃縮至浸膏；該浸膏中加入水進(jìn)行分散，再用大孔吸附樹脂裝柱，先后以水、50?70%乙醇和90?95%乙醇沖柱，收集50?70%乙醇洗脫液，減壓蒸干，即得女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物。
[0015]進(jìn)一步地,所述女貞子藥材或飲片與90?95%乙醇的質(zhì)量體積比(g:mL)為1:(6 ?10)。
[0016]進(jìn)一步地，用于分散浸膏的水的重量為藥材重量的20倍。
[0017]進(jìn)一步地，所述大孔吸附樹脂的重量為藥材重量的0.8?2倍。
[0018]進(jìn)一步地，回流提取的溫度為90?95°C，超聲提取的溫度為55?65°C。
[0019]進(jìn)一步地，女貞子藥材或飲片粉碎后過24?50目篩。
[0020]所述大孔吸附樹脂為D101、AB-8、HP-20等。
[0021]其中，步驟2)中，對(duì)女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物進(jìn)行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測(cè)，溶解女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物的溶劑為氘代甲醇(CD3COCD3)或氘代二甲基亞砜(DMS0-d6)，優(yōu)選氘代甲醇。女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物和相應(yīng)溶劑的質(zhì)量體積比為35:1 ?65:1 (mg:mL),優(yōu)選 60:1。
[0022]除女貞子飲片外，其他女貞子衍生品，如女貞子環(huán)烯醚萜苷提取物可直接作為女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物，用上述方法進(jìn)行鑒別。
[0023]其中，步驟2)中，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰為羰基吸收峰。
[0024]進(jìn)一步地，步驟2)中，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰為C-4"或C-7羰基吸收峰，它們的化學(xué)位移為分別為δ c144.0~158.0和δ c171.0~176.0。使用氘代甲醇溶解女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物得到。
[0025]其中，步驟2)中，根據(jù)特征峰峰強(qiáng)度的大小和位置，對(duì)女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中若干個(gè)活性成分進(jìn)行排序。
[0026]進(jìn)一步地，步驟2)中，根據(jù)特征峰峰強(qiáng)度的大小和位置，對(duì)女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中的活性成分:特女貞苷、8E_Nuezhenide、Ligustroside> Oleuropein、Lucidumoside B、 Lucidumoside D、6’-Elenolylnicotiflorine> Lucidumoside C、Kingiside、8_epikingiside 等進(jìn)行排序。
[0027]其中，步驟2)中，所述峰強(qiáng)度可以采用峰高法、面積積分法或重量法計(jì)算。
[0028]其中，步驟3)中，所述定量分析手段為:高效液相(HPLC)法。
[0029]進(jìn)一步地，所述高效液相法的條件包括:流動(dòng)相為甲醇:水=30~50:50~70，優(yōu)選40:60 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm。
[0030]其中，步驟3)中，所述標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量是指:用定量分析手段測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)參照品的質(zhì)量百分含量。
[0031]進(jìn)一步地，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的標(biāo)準(zhǔn)參照品為特女貞苷。
·[0032]其中，步驟4)中，計(jì)算各活性成分的含量的偶聯(lián)公式為:
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別女貞子藥材或衍生品的方法，包括以下步驟: 1)對(duì)女貞子藥材或衍生品進(jìn)行提取，得到含有活性成分組的女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物； 2)對(duì)所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物進(jìn)行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測(cè)，根據(jù)指紋圖譜得到所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中若干個(gè)活性成分特征峰峰強(qiáng)度；并用相同方式測(cè)定出所述各活性成分相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參照品的特征峰峰強(qiáng)度； 3)通過定量分析手段測(cè)定得到所述標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量； 4)利用各活性成分特征峰峰強(qiáng)度及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參照品的特征峰峰強(qiáng)度的比值和所述標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量，計(jì)算出女貞子藥材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分組的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用具有獲得清晰IGD核磁共振碳譜指紋圖譜的提取工藝作為所述女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物的提取方式。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟I)中，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物的制備方法，包括:稱取女貞子藥材或飲片粉碎，加入90~95%乙醇回流提取或超聲提取2~3次，每次提取I~2小時(shí)，過濾后合并濾液，減壓濃縮至浸膏；該浸膏中加入水進(jìn)行分散，再用大孔吸附樹脂裝柱，先后以水、50~70%乙醇和90~95%乙醇沖柱，收集50~70%乙醇洗脫液，減壓蒸干，即得女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物； 所述女貞子藥材或飲片與90~95%乙醇的質(zhì)量體積比為1: (6~10);用于分散浸膏的水的重量為藥材重量的20倍；所述大孔吸附樹脂的重`量為藥材重量的0.8~2倍；回流提取的溫度為90~95°C，超聲提取的溫度為55~65°C ;所述大孔吸附樹脂為DlOl、AB-8或 HP-20。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)中，對(duì)女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物進(jìn)行IGD核磁共振碳譜指紋圖譜檢測(cè)，溶解女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物的溶劑為氘代甲醇或氘代二甲基亞砜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)中，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰為羰基吸收峰；優(yōu)選C-4"或C-7羰基吸收峰，它們的化學(xué)位移分別為δ c144.0~158.0和δ c171.0~176.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中，根據(jù)特征峰峰強(qiáng)度的大小和位置，對(duì)女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中若干個(gè)活性成分進(jìn)行排序。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述定量分析手段為高效液相法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相法的條件包括流動(dòng)相為甲醇:水=30~50:50~70，優(yōu)選40:60 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述標(biāo)準(zhǔn)參照品的絕對(duì)含量是指:用定量分析手段測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)參照品的質(zhì)量百分含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，女貞子環(huán)烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的標(biāo)準(zhǔn)參照品為特女貞苷。
11.根據(jù)權(quán)利要求1~10任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟4)中，計(jì)算各活性成分的含量的偶聯(lián)公式為:
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述女貞子衍生品包括:女貞子飲片、女貞子提取物或女貞子天然藥物。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103868943SQ201410044033
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張海艷, 趙天增, 王偉, 董建軍, 范毅, 常霞, 李飛飛, 郭唯, 陳飛, 魏悅, 陳玲, 李自紅 申請(qǐng)人:河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司, 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院