含黑色素細(xì)胞的皮膚模型、其構(gòu)建方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及含黑色素細(xì)胞的皮膚模型、其構(gòu)建方法及其用途。具體而言，本發(fā)明公開(kāi)了一種皮膚模型，其包含表皮層和成纖維細(xì)胞層，其中所述表皮層包括角質(zhì)層和含有黑色素細(xì)胞的基層，且所述基層與成纖維細(xì)胞層直接接觸。此皮膚模型與人皮膚組織結(jié)構(gòu)相似，在沒(méi)有UV的條件下成纖維細(xì)胞與黑色素細(xì)胞之間相互作用及所產(chǎn)生的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素。本發(fā)明還公開(kāi)了所述皮膚模型的制備方法，及其用于美白化妝品及退色素劑的功效鑒定及安全評(píng)價(jià)等應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】含黑色素細(xì)胞的皮膚模型、其構(gòu)建方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程重組【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及包含黑色素細(xì)胞的皮膚模型，所述皮膚模型的構(gòu)建方法，及其用于美白化妝品安全和功效評(píng)價(jià)，或用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚的刺激性和/或腐蝕性的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是最大的人體器官。天然的皮膚有兩個(gè)主要功能:防止干燥和抵御外界環(huán)境的傷害，例如細(xì)菌、化學(xué)物質(zhì)和紫外線的傷害。人類皮膚由外向內(nèi)大致可分為3層:表皮層、真皮層和皮下組織。表皮層包括角質(zhì)層和基底層，其中，角質(zhì)層是皮膚的最外層，能耐受一定的物理、化學(xué)、機(jī)械性傷害，對(duì)內(nèi)部組織起保護(hù)作用。基底層是表皮層的最內(nèi)層，由基底細(xì)胞和黑色素細(xì)胞構(gòu)成。真皮層位于表皮深層，向下與皮下組織相連，與后者無(wú)明顯界限。真皮層包含纖維、基質(zhì)以及分散在基質(zhì)中的細(xì)胞成分，如成纖維細(xì)胞。
[0003]藥物、化妝品(包括美白化妝品)、農(nóng)藥、生物制品、洗滌劑及清潔劑等日用品是否引起機(jī)體皮膚刺激反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)是安全性評(píng)價(jià)及危險(xiǎn)鑒定的重要組成部分。傳統(tǒng)常用的毒性試驗(yàn)是在動(dòng)物如豚鼠或兔的體內(nèi)進(jìn)行。然而，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本身存在許多問(wèn)題，如試驗(yàn)評(píng)分主觀性強(qiáng)、結(jié)果重復(fù)性差、動(dòng)物和人之間的種屬差異等，均影響這些待測(cè)樣品對(duì)人體安全性的評(píng)價(jià)。同時(shí)，人類皮膚的特性在很大程度上限制了使用動(dòng)物模型對(duì)新藥物、消費(fèi)產(chǎn)品與化妝品進(jìn)行安全性試驗(yàn)。
[0004]1959年英國(guó)動(dòng)物學(xué)家William Russell和微生物學(xué)家Rex Burch提出動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的減少(Reduction)、替代(Replacement)和優(yōu)化(Refinement)的3R系統(tǒng)理論以來(lái),在世界范圍內(nèi)已得到廣大科技人員的認(rèn)同。國(guó)外的3R研究發(fā)展迅速，動(dòng)物保護(hù)意識(shí)和動(dòng)物福利運(yùn)動(dòng)興起，特別是近20多年來(lái)，不再以動(dòng)物模式為基礎(chǔ)的毒理學(xué)研究和評(píng)價(jià)方法已成為生物醫(yī)學(xué)重要發(fā)展方向，并被政府和研究機(jī)構(gòu)所接受。歐盟甚至制定法規(guī)來(lái)禁止銷售采用動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)品和原料，這些推動(dòng)著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法研究的快速發(fā)展。
[0005]歐盟化妝品規(guī)程第7次修正案(2003/15/EC，2003)中明確規(guī)定，自2009年3月起在歐盟范圍內(nèi)禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品毒性和過(guò)敏實(shí)驗(yàn)，2013年起禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品原料的安全性評(píng)價(jià)，逐步不允許成員國(guó)從外國(guó)進(jìn)口和銷售進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的化妝品，并列入進(jìn)入世界貿(mào)易組織(WTO)所簽訂的雙邊協(xié)議的條款。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法在國(guó)際貿(mào)易中以技術(shù)壁壘的形式直接影響著經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
[0006]因此，研究者已經(jīng)努力開(kāi)發(fā)構(gòu)建出多種皮膚模型，用于替代動(dòng)物模型而研究皮膚的生理學(xué)作用，并用于檢測(cè)化妝品或藥物制劑等在體內(nèi)的反應(yīng)。皮膚模型應(yīng)具備屏障功能，對(duì)環(huán)境中的刺激和人類皮膚有同樣的反應(yīng)。
[0007]皮膚腐蝕試驗(yàn)替代方法的預(yù)驗(yàn)證研究開(kāi)始于1994年，至2004年國(guó)際社會(huì)基本接受的皮膚腐蝕試驗(yàn)的替代方法主要有3項(xiàng)，分別是大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)(TER) Xoirositex檢測(cè)和人工皮膚模型試驗(yàn)(Episkin試驗(yàn)和EpiDerm試驗(yàn))。EpiSkin?檢測(cè)方法因高靈敏度和特異性而成為體內(nèi)皮膚刺激試驗(yàn)一Draize試驗(yàn)的替代方法。在2008年布魯塞爾召開(kāi)的科學(xué)會(huì)議上，科學(xué)家們綜述并評(píng)估了大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)(TER)和人類表皮模型，確定了這些模型可以安全地用于評(píng)估皮膚刺激性和腐蝕性。
[0008]目前為止已建立的皮膚模型主要有兩種類型:一種為表皮模型，由生長(zhǎng)在基質(zhì)上的多層分化的人角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成；另一種為全皮模型，在含有人成纖維細(xì)胞的基質(zhì)上培養(yǎng)人角質(zhì)細(xì)胞，并多層分化。角質(zhì)細(xì)胞必須經(jīng)氣-液界面培養(yǎng)后，角質(zhì)細(xì)胞則發(fā)展成排列致密的角質(zhì)層，能夠模擬天然皮膚的屏障功能。
[0009]在歐美體外皮膚刺激試驗(yàn)驗(yàn)證方法中，三種商品化的再造人類皮膚模型
HpiSKin":、SkinHihic!< i;!丨「piDcnn ":被歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM，European
Centre for the Validation of Alternative Methods)所接受,批準(zhǔn)用于驗(yàn)證試驗(yàn)。這些模型在某些方面(例如形態(tài)學(xué)、脂類組成和生化標(biāo)記)顯示出和天然人類皮膚的相似性，被證明是光毒性、腐蝕性、刺激性試驗(yàn)方面有用的工具。
[0010]除了化妝品的毒性檢測(cè)外，這些人造表皮模型也被用在化學(xué)品的皮膚吸收、滲透和通透性檢驗(yàn)。這些模型也可以用來(lái)評(píng)估外用制劑、藥物、針對(duì)皮膚疾病的其他治療方法以及保護(hù)皮膚抵抗紫外線侵害的材料。同樣的技術(shù)也適用于燒傷、受傷及外科手術(shù)后覆蓋并保護(hù)傷口的人工皮膚。
[0011]在國(guó)內(nèi)的研究中，2001年伍津津申請(qǐng)了專利“復(fù)合人工皮膚的制備方法”(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01107099.4)，該專利包括溶液的制備、I和III型人膠原基質(zhì)凝膠的制備和成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞呈三維方向生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。但該專利沒(méi)有對(duì)表皮細(xì)胞的來(lái)源及性質(zhì)進(jìn)行論述。
[0012]中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)N0.03134535.2公開(kāi)了覆蓋生物支架材料及組織工程真皮的制備方法。但該方法制備的人工皮膚僅由膠質(zhì)層和成纖維細(xì)胞層組成的真皮組織，不含角質(zhì)細(xì)胞及其分化而形成的角質(zhì)層。因此，與人體皮膚組織結(jié)構(gòu)差異較大。這兩個(gè)模型主要用于燒傷、創(chuàng)傷、潰瘍等病人的臨床治療。
[0013]中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)N0.200810029210.8涉及采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方法。
[0014]中國(guó)發(fā)明專利CN101352586B涉及利用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法，其中采用干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚，包括高分子真皮支架制備與修飾、全層皮膚培養(yǎng)基的制備及全層皮膚的構(gòu)建方法。該專利強(qiáng)調(diào)利用胚胎干細(xì)胞和皮膚組織來(lái)源的人表皮干細(xì)胞，進(jìn)行構(gòu)建人皮膚模型。
[0015]然而，盡管現(xiàn)有的皮膚模型在一定程度上模仿了人類皮膚的結(jié)構(gòu)，但由于這些皮膚模型不含有黑色素細(xì)胞，因而并不適用于黃色、棕色及黑色人種皮膚的驗(yàn)證試驗(yàn)，也不適合用于評(píng)估臨床藥物和美白化妝品功效。
[0016]黃色、棕色及黑色人種的皮膚含有大量的黑色素細(xì)胞，能分泌大量的黑色素。人皮膚、頭發(fā)和眼睛的顏色是由黑色素的量和其分布來(lái)決定的。在皮膚里，黑色素是由黑色素細(xì)胞中的黑色小體產(chǎn)生的。黑色素細(xì)胞本身不是黑色的，而是具有分泌黑色素顆粒的功能，能吸收陽(yáng)光中的紫外線，阻止紫外線射入體內(nèi)，避免深層組織受到傷害。在高強(qiáng)度紫外線下，黑色素母細(xì)胞會(huì)分泌黑色素，在細(xì)胞上形成吸收紫外線的黑色保護(hù)傘，保護(hù)細(xì)胞不被紫外線射傷。在紫外線的誘導(dǎo)下，許多從角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌出來(lái)的因子，例如干細(xì)胞因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干擾素-Y、內(nèi)皮素-1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白介素-1等。這些細(xì)胞因子也能夠調(diào)節(jié)色素沉著。
[0017]雖然已經(jīng)有一些研究者在現(xiàn)有的皮膚模型中添加了黑色素細(xì)胞，以開(kāi)發(fā)包含黑色素細(xì)胞的皮膚類似物，然而，由于在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有紫外線的存在，這些改進(jìn)的皮膚模型仍存在很多缺陷。特別是這些皮膚類似物需要額外的紫外線照射才能刺激提高黑色素的產(chǎn)生，而在接受紫外照射前僅具有本底的黑色素表達(dá)，且表達(dá)水平不均一，因而無(wú)法獲得可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0018]近年來(lái)，人們開(kāi)始把釀氣Ife酶抑制劑用于臨床治療和化妝品中。在臨床中，這種抑制劑用來(lái)治療黑色素高度聚集癥及在化妝品中用于美白皮膚。建立臨床藥物和美白化妝品功效及安全評(píng)估系統(tǒng)是目前急需解決的問(wèn)題。
[0019]本領(lǐng)域還需要能夠在沒(méi)有額外紫外線刺激的條件下，穩(wěn)定地表達(dá)類似于天然水平黑色素的皮膚模型，以用于臨床藥物和美白化妝品功效及安全評(píng)估。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明提供了含有黑色素細(xì)胞的皮膚模型、所述皮膚模型的構(gòu)建方法，及其用于美白化妝品安全和功效評(píng)價(jià)，或用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚的刺激性和/或腐蝕性的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的第一方面涉及一種皮膚模型，其包含表皮層和成纖維細(xì)胞層，其中所述表皮層包括角質(zhì)層和含有黑色素細(xì)胞的基層，且所述基層與成纖維細(xì)胞層直接接觸。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的皮膚模型不包含膠原層或者所述表皮層還包括棘層，所述棘層介于角質(zhì)層與基層之間。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞層由連續(xù)的成纖維細(xì)胞組成。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述表皮層中，黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例可以在1:50至50:1之間，例如，1:25至25:1之間，例如1:15至15:1之間，或例如1:10至10:1之間，優(yōu)選黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例為1:10。
[0025]本發(fā)明的第二方面涉及如上所述皮膚模型的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0026]I)在用膠原處理過(guò)的膜上或固化的膠原層上加入成纖維細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)產(chǎn)生成纖維細(xì)胞層；
[0027]2)在所述成纖維細(xì)胞層上方加入角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的混懸液，并進(jìn)行浸沒(méi)式
培養(yǎng)；
[0028]3)可選地，在浸沒(méi)式培養(yǎng)之前、同時(shí)或0.5-2.5天或后用相應(yīng)添加有促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的試劑如神經(jīng)因子-1或其活性片段的培養(yǎng)基培養(yǎng)1-5天；和
[0029]4)待角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)物抵達(dá)氣-液面后，進(jìn)行氣-液面培養(yǎng)，獲得所述皮膚模型，可選地，步驟4)使用含有促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的試劑如神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1或其活性片段的氣液面培養(yǎng)基進(jìn)行。
[0030]在某個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)為在浸沒(méi)式培養(yǎng)I天后更換為相應(yīng)添加有神經(jīng)因子-1或其活性片段的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天。
[0031]在某個(gè)實(shí)施方案中，所述膠原來(lái)自大鼠尾部。
[0032]在某個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法還包括步驟5)剝離所述膜，或殘余的膠原層。
[0033]本發(fā)明的第三方面涉及所述皮膚模型的用途，其用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚的影響，其中所述化學(xué)品包括化妝品、藥品、農(nóng)藥、生物制劑、洗滌劑。[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述皮膚模型用于檢測(cè)美白化妝品或藥品的美白功效。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥品用于治療黑色素高度聚集癥。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1:本發(fā)明的包含黑色素細(xì)胞皮膚模型的示意圖，其中膠原層為支持層，成纖維細(xì)胞層位于膠原層的上面。角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞層位于成纖維細(xì)胞層的上面。
[0037]圖2:本發(fā)明的包含含黑色素細(xì)胞的皮膚模型的H&E染色照片。
[0038]圖3:顯示了經(jīng)過(guò)神經(jīng)活性因子活性片段9 (WC-9)調(diào)節(jié)的皮膚組織的黑色素含量提高，與未添加組(即陰性對(duì)照，NC)相比，差異顯著(p〈0.05)。NC:陰性對(duì)照組；WC-9:添加活性片段9組。
[0039]圖4:顯示了經(jīng)過(guò)神經(jīng)活性因子活性片段10 (WC-10)調(diào)節(jié)的皮膚組織的黑色素含量提高，與未添加組(即陰性對(duì)照，NC)相比，差異顯著(p〈0.05)。NC:陰性對(duì)照組；WC-10:添加活性片段10組。
[0040]圖5:顯示了 MTT檢測(cè)細(xì)胞活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果，MTT測(cè)試細(xì)胞存活率大于15%為非腐蝕性化學(xué)品，小于15%為腐蝕性化學(xué)品。10種由OECD試驗(yàn)指南提供的參考化合物，其中5種為腐蝕性，5種為非腐蝕性，檢測(cè)結(jié)果與參考值相同。
【具體實(shí)施方式】
[0041]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種皮膚模型，其能夠在沒(méi)有紫外線刺激的條件下，通過(guò)促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的試劑如神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1或其活性片段刺激皮膚模型穩(wěn)定地表達(dá)類似于天然水平的黑色素。所述促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的試劑如神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1或其活性片段既可以是皮膚模型的細(xì)胞自身產(chǎn)生的也可以外源添加的。
[0042]對(duì)此，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)在成纖維細(xì)胞層上設(shè)置包含黑色素細(xì)胞的表皮層實(shí)現(xiàn)黑色素的穩(wěn)定表達(dá)，從而解決了上述問(wèn)題。
[0043]因此，一方面，本發(fā)明提供了一種皮膚模型，其包含表皮層和成纖維細(xì)胞層，其中所述表皮層包括角質(zhì)層和含有黑色素細(xì)胞的基層，且所述基層與成纖維細(xì)胞層直接接觸。
[0044]本發(fā)明的含黑色素細(xì)胞皮膚模型在結(jié)構(gòu)上區(qū)別于現(xiàn)有的其它模型。在本發(fā)明的皮膚模型中，黑色素細(xì)胞與成纖維細(xì)胞層的直接接觸或相互作用及由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1和/或加入神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1的活性片段是使黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的重要條件。通過(guò)與由成纖維細(xì)胞構(gòu)成的成纖維細(xì)胞層的直接接觸，本發(fā)明的皮膚模型真實(shí)再現(xiàn)了天然皮膚中黑色素細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的信息分子傳遞和相互作用，從而實(shí)現(xiàn)了類似于天然水平黑色素的穩(wěn)定表達(dá)。
[0045]本發(fā)明的皮膚模型可以進(jìn)一步包含膠原層，所述成纖維細(xì)胞層位于膠原層上。所述膠原層主要用于支持所述表皮層和成纖維細(xì)胞層。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的皮膚模型可以不包含膠原層。不包含膠原層的所述皮膚模型更有利于直接且敏感地檢測(cè)外源物(例如，待測(cè)化妝品、藥物等化學(xué)品)對(duì)皮膚模型中細(xì)胞、黑色素產(chǎn)生等的影響。
[0046]本發(fā)明所述的成纖維細(xì)胞層由連續(xù)的成纖維細(xì)胞組成。所述成纖維細(xì)胞層通過(guò)將成纖維細(xì)胞接種在用膠原蛋白處理過(guò)的膜上或膠原蛋白膠層上并進(jìn)行培養(yǎng)而獲得。而在常規(guī)的皮膚模型制備方法中，為了模擬真皮結(jié)構(gòu)，將成纖維細(xì)胞混入膠原溶液中，經(jīng)培養(yǎng)后，形成在大量膠原中嵌入成纖維細(xì)胞的真皮類似物。與現(xiàn)有皮膚模型相比，本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞層中的成纖維細(xì)胞形成了連續(xù)的細(xì)胞層，提高了成纖維細(xì)胞的密度，并且與所述表皮層中的基層直接接觸，從而大大提高了成纖維細(xì)胞層與黑色素細(xì)胞直接的相互作用和諸如神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1的細(xì)胞因子的傳遞?！坝蛇B續(xù)的成纖維細(xì)胞組成”是指所述成纖維細(xì)胞均勻地分布在所述皮膚模型中，既可以是高度匯合的致密組成，也可以是松散的均勻分布形態(tài)。
[0047]所述表皮層包括角質(zhì)層和含有黑色素細(xì)胞的基層。任選地，所述表皮層還包括棘層，即角質(zhì)層與基層之間的過(guò)渡層。所述角質(zhì)層由角質(zhì)細(xì)胞分化而構(gòu)成。所述基層含有黑色素細(xì)胞，并且與所述成纖維細(xì)胞層直接接觸。任選地，在本發(fā)明皮膚模型中，所述黑色素細(xì)胞主要位于基層中，優(yōu)選所有黑色素細(xì)胞都位于基層中。
[0048]在所述表皮層中，黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例可以在1:50至50:1之間，優(yōu)選黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例為1:10。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的含量。
[0049]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述皮膚模型的制備方法。因此，在第二方面，本發(fā)明提供了上述皮膚模型的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0050]I)在用膠原處理過(guò)的膜上或固化的膠原層上加入成纖維細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)產(chǎn)生成纖維細(xì)胞層；
[0051]2)在所述成纖維細(xì)胞層上方加入角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的混懸液，并進(jìn)行浸沒(méi)式培養(yǎng)；和
[0052]3)待角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)物抵達(dá)氣-液面后，進(jìn)行氣-液面培養(yǎng)，獲得所述皮膚模型。
[0053]所使用的膜可以是通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的膜，例如聚碳酸酯膜插入式培養(yǎng)皿(polycarbonate membrane insert),其可購(gòu)自，例如 Nunc (Nunc, Cat N0.140620)。
[0054]所使用的膠原可以是來(lái)自大鼠尾部的膠原，或來(lái)自牛、魚(yú)或任何其他天然膠原。所述膠原是可商購(gòu)的，例如可購(gòu)自GIBC0?；蛘?，也可以根據(jù)例如Yang, EunKyung et al.,"Tissue Engineered Artificial Skin Composed of Dermis andepidermis", Artificial 0rgans24(l):7-17, 2000的記載，從大鼠尾部，牛、魚(yú)等天然來(lái)源制備。
[0055]配制膠原溶液的方法是本領(lǐng)域已知的，可參見(jiàn)文獻(xiàn),例如Dongari BagtzoglouA et al., "Development of a Highly Reproducible Three-Dimensional OrganotypicModel of the Oral Mucosa", Nat Protoc, I (4): 2012-8，2006 的記載。所述膠原溶液可包含培養(yǎng)基成分，例如 DMEM 培養(yǎng)基(GIBC0，Cat N0.31600-034),Epilife 培養(yǎng)液(GIBC0，CatN0.MEPI500CA)，以及適合的緩沖劑等。還可以向膠原溶液中添加適合的皮膚組分，例如層粘連蛋白、纖連蛋白、透明質(zhì)酸等。在配制獲得膠原溶液后，將其在細(xì)胞培養(yǎng)皿中靜置，以使其固化。靜置時(shí)間可在10?60分鐘，優(yōu)選30分鐘。
[0056]所使用的成纖維細(xì)胞可以來(lái)自人皮膚，例如成人皮膚，或新生兒包皮切除術(shù)后獲得的皮膚組織；或者源自可向成纖維細(xì)胞分化的干細(xì)胞，或者經(jīng)遺傳修飾的成纖維細(xì)胞；也可以是商購(gòu)的成纖維細(xì)胞系，例如購(gòu)自LifeLine Cell Technology的成纖維細(xì)胞(LifeLine Cell Technology,貨號(hào):Fc_0001)。[0057]分離及培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的方法是已知的，例如可參照參考文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行，例如伍津津等，“表皮真皮分離方法的探索”，第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，26 (24): 2242-2244，2004 ;孫曙光等，“人表皮細(xì)胞分離條件的優(yōu)化”，山東醫(yī)藥，45(29): 12-14，2005。常用于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括，例如GIBCO的106培養(yǎng)液(GIBCO, Cat N0.M-106-500)和 LifeLine Cell Technology 的Fibrolife 培養(yǎng)液(LifeLineCell Technology, Cat N0.LL-0011)等。
[0058]首先，將所述成纖維細(xì)胞鋪在用膠原蛋白處理過(guò)的膜上或膠原蛋白膠層上并進(jìn)行培養(yǎng)。
[0059]具體地，可將分離、制備的成纖維細(xì)胞懸液加入到用膠原蛋白處理過(guò)的膜上或固化的膠原層上方，并培養(yǎng)使其形成成纖維細(xì)胞層。所述成纖維細(xì)胞懸液含有IxlO4至IxlO6/ml的成纖維細(xì)胞，例如2xl05/ml的成纖維細(xì)胞。在加入后，通常在37°C，補(bǔ)充5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30~180分鐘，例如在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。
[0060]角質(zhì)細(xì)胞包括黑色素細(xì)胞被鋪在成纖維細(xì)胞層的上面。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化產(chǎn)生表皮層和角質(zhì)層。
[0061]所使用的角質(zhì)細(xì)胞可以來(lái)自于人皮膚，例如由包皮環(huán)切術(shù)獲得的皮膚組織，或者經(jīng)遺傳修飾的角質(zhì)細(xì)胞；也可以是商購(gòu)的角質(zhì)細(xì)胞系，例如購(gòu)自Invitrogen的商品化細(xì)胞株(Invitrogen, Cat N0.C-001-5C)。
[0062]制備及培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞的方法是已知的，例如可參照文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行(伍津津等，“表皮真皮分離方法的探索”，第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，26 (24): 2242-2244，2004 ;孫曙光等，“人表皮細(xì)胞分離條件 的優(yōu)化”，山東醫(yī)藥，45(29): 12-14，2005)。常用于角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括，例如 GIBCO 的 Epilife 培養(yǎng)液(GIBCO, Cat N0.MEPI500CA)。
[0063]所使用的黑色素細(xì)胞可以來(lái)自于人皮膚，例如由包皮環(huán)切術(shù)獲得的皮膚組織，或者經(jīng)遺傳修飾的黑色素細(xì)胞；也可以是商購(gòu)的黑色素細(xì)胞系，例如Invitrogen的商品化黑色素細(xì)胞株(Invitrogen, Cat No C-202-5C)。
[0064]制備及培養(yǎng)黑色素細(xì)胞的方法是已知的，例如可參照文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行(Methods in Molecular Medicine, Chapter2, HUMANA PRESS, ISSN: 1543-1894)。常用于黑色素細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括，例如GIBCO的DMEM培養(yǎng)基(GIBC0，Cat N0.31600-034)。
[0065]可將分離的角質(zhì)細(xì)胞與黑色素細(xì)胞混合，制成混懸液。所述混懸液中，角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的濃度可以為Ixio4至Ixio6Ail。黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例可以在1:50至50:1之間，優(yōu)選黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例為1:10。
[0066]在加入所述角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的混懸液后，可按照已知的方法進(jìn)行浸沒(méi)式培養(yǎng)。所述浸沒(méi)式培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域已知的，其描述于，例如Carlson etal.，"Three-Dimensional Tissue Models of Normal and Diseased Skin〃，Curr ProtocCell Biol, Dec; Chapterl9:Unitl9.9，2008。通常在在 37°C，補(bǔ)充 5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30分鐘至4天，例如在37 °C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30-60分鐘。
[0067]在培養(yǎng)過(guò)程中注意按時(shí)更換培養(yǎng)基，待角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)物達(dá)到氣-液界面后，進(jìn)行氣-液面培養(yǎng)。所述氣-液面培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域已知的，其描述于，例如 Egles C et al.，"Three-Dimensional Human Tissue Models of WoundedSkin", Methods Mol Biol, 585:345-59，2010。通常在在 37°C，補(bǔ)充 5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~15天，例如在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。
[0068]為了促進(jìn)黑色素的分泌，可以再添加有利于促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1活性片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的皮膚模型的制備方法還可任選地包含步驟2’)向培養(yǎng)物中添加促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的試劑，例如細(xì)胞因子，如神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1及其活性片段。所述步驟2’)可以任選地在步驟2)之前、之后或同時(shí)進(jìn)行。
[0069]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明所述的皮膚模型的制備方法包括以下步驟:
[0070]I)制備膠原層:由IOX DMEM，IOX重組緩沖液，IX Epilife培養(yǎng)液，L-谷氨酰胺和膠原配制膠原溶液，其中，所述IOX重組緩沖液為溶解于100毫升蒸餾水的2.2克NaHC03、477毫克HEPES和248毫克NaOH溶液；
[0071]2)吸取膠原溶液放置至插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置使其固化；
[0072]3)配制成纖維細(xì)胞懸液，按照每個(gè)插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿加入約IO6個(gè)細(xì)胞計(jì)算需要加入的細(xì)胞量，在膠原層上方加入成纖維細(xì)胞懸液；
[0073]4)在37 °C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2小時(shí)；
[0074]5)制成角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞懸液，按照每個(gè)插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿加入約3xl06個(gè)細(xì)胞計(jì)算需要加入的細(xì)胞量，其中角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的比率為10:1;
[0075]6)加入細(xì)胞懸液到每個(gè)插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30-60分鐘；
[0076]7)向插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入Epilife培養(yǎng)基，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)液面培養(yǎng)3天，從第4天進(jìn)行氣-液面的培養(yǎng)，共14天。
[0077]在培養(yǎng)獲得所述皮膚模型后，可根據(jù)需要?jiǎng)冸x所述膜或膠原層，從而獲得不包含膠原層的皮膚模型。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的皮膚模型的制備方法還可任選地包含步驟4)剝離所述膜，或殘余的膠原層。按照此類實(shí)施方式所述的方法，可以獲得不含膠原層的皮膚模型。
[0078]在另一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)先控制所述膠原層的厚度，從而在培養(yǎng)完成后，直接獲得不包含膠原層的皮膚模型。
[0079]可以通過(guò)組織學(xué)檢測(cè)和MTT法等檢測(cè)是否成功構(gòu)建了皮膚模型。具體方法可參見(jiàn)，例如Helena K., et al.，〃An in vitro skin irritation test (SIT)using the EpiDermreconstructed human epidermal (RHE)model^.J.Vis.Exp.Jul13; (29).,2009。
[0080]建立含有黑色素細(xì)胞的皮膚評(píng)估模型是建立臨床藥物和美白化妝品功效及安全評(píng)估系統(tǒng)的重要手段。因此，在第三方面，本發(fā)明提供了上述皮膚模型用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚影響的應(yīng)用，其中所述化學(xué)品包括化妝品、藥品、農(nóng)藥、生物制劑、洗滌劑等。例如，本發(fā)明的皮膚模型可用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚的刺激性和/或腐蝕性、評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)皮膚的安全性等。[0081 ] 特別地，本發(fā)明的皮膚模型適合用于檢測(cè)化妝品的功效，例如美白化妝品的功效。本發(fā)明的皮膚模型也適合用于檢測(cè)藥品的功效，例如用于治療黑色素高度聚集癥的藥物、退色素劑等。所述“黑色素高度聚集癥”是指由于黑色素高表達(dá)或過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的疾病或狀況，如黑色素?；蚝谏亓?。
[0082]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些【具體實(shí)施方式】。[0083]實(shí)施例1:含黑色素細(xì)胞的人工皮膚模型的構(gòu)建
[0084]1.材料
[0085]I)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基的配制:106培養(yǎng)液(GIBCO, Cat N0.M-106-500)，含2%的低血清生長(zhǎng)添加劑(GIBCO, Cat N0.S-003-10,0.2%慶大霉素/兩性霉素B溶液(GIBCO, Cat.N0.R-015-10)。
[0086]2)角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基的配制:Epilife培養(yǎng)液(GIBCO, Cat N0.MEPI500CA)，含1%的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(GIBC0，Cat N0.S-001-5)，0.2%慶大霉素/兩性霉素B溶液(GIBCO, Cat.N0.R-015-10)。
[0087]3) IOX 重建緩沖液的配制:2.2g NaHCO3(aMResco, Cat N0.0865-1KG)、477 毫克HEPES (aMResco, Cat N0.0511-1KG)、248毫克NaOH溶解于100毫升蒸餾水，無(wú)菌過(guò)濾后，分裝長(zhǎng)期保存放置在_20°C。
[0088]4)原代黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基的配制:10XDMEM培養(yǎng)液的配制:13.48克DMEM粉(GIBCO, Cat N0.31600-034)溶解于100毫升蒸懼水(無(wú)Na2CO3),無(wú)菌過(guò)濾后,分裝長(zhǎng)期保存放置在_20°C。
[0089]5) 10 X DMEM 培養(yǎng)液的配制:13.48 克 DMEM 粉(GIBCO, Cat N0.31600-034)溶解于100毫升蒸餾水(無(wú)Na2CO3)，無(wú)菌過(guò)濾后，分裝長(zhǎng)期保存放置在_20°C。
[0090]6)其他材料:24孔插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(Nunc，Cat N0.620140)、胎牛血清(Hyclone, Cat N0.SH30070.03)、L-谷氨酰胺 200mM(GIBCO, Cat N0.25030)、胰酶 /EDTA液-TE (GIBCO, Cat N0.R-OO1-100)、胰酶中和劑-TN(GIBCO, Cat N0.R-002-100)、蒸餾水(GIBCO, Cat N0.15230-162，Lot N0.1134207)。
[0091]2.成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0092]I)將包皮環(huán)切術(shù)后的皮膚組織放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗，小心剔除脂肪后將組織剪碎；
[0093]2)將碎塊放在50毫升離心管中，加入10毫升Dispase II溶液(Roche, CatN0.04942078001，含0.2%的慶大霉素/兩性霉素B溶液和1%的青霉素/鏈霉素)，在4°C消化過(guò)夜；
[0094]3)第2天將組織和Dispase II溶液一起轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，將組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，PBS沖洗3遍；
[0095]4)使組織浸泡在磷酸緩沖液(PBS)中，將表皮和真皮分離開(kāi)，將真皮切碎，轉(zhuǎn)移至15毫升離心管中；
[0096]5)加入I毫升膠原酶I溶液(Sigma, Cat N0.C0130_100mg)，在37°C消化15分鐘后,加入5暈升106培養(yǎng)液；
[0097]6)室溫下，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；
[0098]7)棄上清，將沉淀重懸在2毫升106培養(yǎng)液中；
[0099]8)將細(xì)胞懸液(含小塊的組織)用移液管轉(zhuǎn)移進(jìn)T75培養(yǎng)瓶中，放置在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)3天，得到成纖維細(xì)胞；
[0100]9)在培養(yǎng)皿中加入0.5毫升的膠原酶I溶液，把表皮輕輕地轉(zhuǎn)移到膠原酶I溶液中，基底層朝下，室溫下消化20分鐘；
[0101]10)加入2毫升Epilife培養(yǎng)液，將表皮組織在培養(yǎng)皿上一小塊地方輕輕摩擦，分離細(xì)胞；
[0102]11)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中，用2毫升新鮮Epilife培養(yǎng)基沖洗，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中。室溫下離心(1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘)；
[0103]12)棄掉上清液，將細(xì)胞重懸在2毫升Epilife培養(yǎng)基，放置在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，得到角質(zhì)細(xì)胞。
[0104]3.黑色素細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0105]I)將包皮環(huán)切術(shù)后的皮膚組織放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，用PBS沖洗，小心剔除脂肪后將組織剪碎；
[0106]2)將碎塊放在50毫升離心管中，加入10毫升Dispase II溶液(Roche, CatN0.04942078001，含0.2%的GA溶液和1%的青霉素/鏈霉素)，在4°C消化過(guò)夜；
[0107]3)第2天將組織和Dispase II溶液一起轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，將組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，PBS沖洗3遍；
[0108]4)使組織浸泡在磷酸緩沖液(PBS)中，將表皮和真皮分離開(kāi)，丟棄真皮部分；
[0109]5)將表皮部分切割成2x2平方毫米的小塊，放在5毫升0.25%的胰酶溶液中，37°C孵育5分鐘；
[0110]6)用吸管反復(fù)吹打，使表皮分離出單個(gè)細(xì)胞；
[0111]7)在細(xì)胞懸液中加入10毫升無(wú)Ca2+、Mg2+的HBSS溶液(GIBC0，貨號(hào):14025-092)，室溫下離心(800g，5分鐘)；
[0112]8)棄掉上清液，將細(xì)胞重懸在5毫升254培養(yǎng)液中，放置在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，得到黑色素細(xì)胞。
[0113]4.鼠尾膠原蛋白的制備:
[0114]I)取大鼠尾巴，用75%酒精浸泡5分鐘，折斷尾骨后拉出尾腱；
[0115]2)將尾腱剪斷置于平皿中，生理鹽水浸泡；
[0116]3)吸去生理鹽水，將尾腱置于平皿內(nèi)剪碎，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中；
[0117]4)按每克尾腱50毫升的比例，加入0.1%醋酸溶液，搖晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4 C保存一周；
[0118]5)離心并收集上清，分裝成小瓶，4°C保存。
[0119]5.含黑色素細(xì)胞皮膚模型的制備方法:
[0120]將插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放置到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)需要生長(zhǎng)培養(yǎng)物的數(shù)目來(lái)配制試劑。
[0121]I)制備膠原層:按如下方法配制10暈升膠原溶液:1.0暈升IOX DMEM> 1.0暈升IOX 重組緩沖液[2.2 克 NaHCO3 (aMResco, Cat N0.0865-1KG)、477 毫克 HEPES (aMResco, CatN0.0511-1KG)、248毫克NaOH溶解于100毫升蒸餾水]，1.4毫升IX Epilife培養(yǎng)液，0.1暈升200mM L-谷氨酰胺,6.5暈升鼠尾膠原(3暈克/暈升);
[0122]2)吸取鼠膠原溶液放置至插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在安全柜中放置30分鐘使其固化；
[0123]3)配制成纖維細(xì)胞懸液，按照每個(gè)插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿加入100，000個(gè)細(xì)胞計(jì)算需要加入的細(xì)胞量，在膠原層上方加入成纖維細(xì)胞懸液；
[0124]4)在37 °C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)；[0125]5)配制含有神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1活性片段的細(xì)胞培養(yǎng)液以及氣液面培養(yǎng)基，活性片段 9 (WC-9)序列為:PSRYLCKC (SEQ ID NO:1);活性片段 10 (WC-10)序列為:LCKCPNEF(SEQ ID NO:2)，(由北京中科亞光生物科技有限公司合成)，濃度為IOOuM ；
[0126]6)制成角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞懸液，按照每個(gè)插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿加入300，000個(gè)細(xì)胞計(jì)算需要加入的細(xì)胞量，其中角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的比率為10:1;
[0127]7)加入細(xì)胞懸液到每個(gè)插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30_60min ；
[0128]8)向插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入Epilife培養(yǎng)基，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)液面培養(yǎng)I天。更換為相應(yīng)添加有神經(jīng)因子-1活性片段的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天；
[0129]9)第4天開(kāi)始進(jìn)行氣-液面的培養(yǎng)，并使用含有神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1活性片段的氣液面培養(yǎng)基，共14天。
[0130]實(shí)施例2: 組織學(xué)檢驗(yàn)
[0131]將實(shí)施例1中構(gòu)建的皮膚模型從插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿取出，用10%中性福爾馬林的PBS溶液固定I小時(shí)，乙醇梯度脫水，石蠟包埋、切片，用蘇木素-伊紅(H&E)染色。顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)。
[0132]結(jié)果如圖2所不,實(shí)施例1中構(gòu)建的皮膚模型包含成纖維細(xì)胞層、表皮層。表皮層分界明顯并含有基層、棘層和角化層。在基層中可見(jiàn)黑色素細(xì)胞。
[0133]實(shí)施例3:皮膚模型中黑色素含量的測(cè)定
[0134]黑色素是決定皮膚顏色的主要因子，同時(shí)也是決定皮膚模型顏色的主要因子。
[0135]皮膚模型的黑色素顏色變化可用光學(xué)法來(lái)測(cè)定。凝膠成像分析系統(tǒng)具有高分辨率數(shù)字CCD相機(jī)及專業(yè)圖像分析軟件。凝膠成像分析系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)中多方面成像,如凝膠,薄層層析,點(diǎn)雜交,細(xì)胞培養(yǎng)板，Westen blot等。在選定的拍攝區(qū)域此系統(tǒng)可對(duì)被攝物的光密度進(jìn)行定性定量分析。因此，數(shù)字影像技術(shù)可用來(lái)檢測(cè)皮膚模型的顏色變化。目前已有實(shí)驗(yàn)室把數(shù)字影像技術(shù)用于3D皮膚模型的顏色變化的檢測(cè)(PhotochemPhotobiol, 85(4):1032，2009)。
[0136]皮膚模型內(nèi)黑色素含量及其變化也可用NaOH檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定，參見(jiàn)例如張目等，〃幾種中藥的美白作用研究"，香料香精化妝品，37(1):33, 2009。
[0137]具體地，將皮膚模型用PBS沖洗一遍然后用鑷子把表皮層和角質(zhì)層輕輕拿起，然后放入1.5毫升離心管中，加入100微升lmol/L NaOH(含10%DMS0)溶液，80°C下孵育30分鐘。在孵育10和20分鐘時(shí)，輕輕拍打離心管使表皮層松散開(kāi)并混勻。在30分鐘時(shí)，加入雙蒸水將NaOH稀釋至0.2mol/L,混勻后分別取100微升放入96孔板中，475nm波長(zhǎng)處測(cè)
定吸收度。
[0138]
【權(quán)利要求】
1.一種皮膚模型，其包含表皮層和成纖維細(xì)胞層，其中所述表皮層包括角質(zhì)層和含有黑色素細(xì)胞的基層，且所述基層與成纖維細(xì)胞層直接接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的皮膚模型，其不包含膠原層或者所述表皮層還包括棘層，所述棘層介于角質(zhì)層與基層之間。
3.如權(quán)利要求1或2所述的皮膚模型，其中，所述成纖維細(xì)胞層由連續(xù)的成纖維細(xì)胞組成。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的皮膚模型，其中，在所述表皮層中，黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例可以在1:50至50:1之間，優(yōu)選黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例為1:10。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述皮膚模型的制備方法，所述方法包括以下步驟: 1)在用膠原處理過(guò)的膜上或固化的膠原層上加入成纖維細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)產(chǎn)生成纖維細(xì)胞層； 2)在所述成纖維細(xì)胞層上方加入角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的混懸液，并進(jìn)行浸沒(méi)式培養(yǎng); 3)可選地，在浸沒(méi)式培養(yǎng)之前、同時(shí)或0.5-2.5天或后用相應(yīng)添加有促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的試劑如神經(jīng)因子-1或其活性片段的培養(yǎng)基培養(yǎng)1-5天；和 4)待角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)物抵達(dá)氣-液面后，進(jìn)行氣-液面培養(yǎng)，獲得所述皮膚模型，可選地，步驟4)使用含有神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1或其活性片段的氣液面培養(yǎng)基進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述膠原來(lái)自大鼠尾部。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其還包括步驟5)剝離所述膜，或殘余的膠原層。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述皮膚模型的用途，其用于檢測(cè)化學(xué)品對(duì)皮膚的影響，其中所述化學(xué)品包括化妝品、藥品、農(nóng)藥、生物制劑、洗滌劑。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述皮膚模型用于檢測(cè)美白化妝品或藥品的美白功效。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述藥品用于治療黑色素高度聚集癥。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK103983762SQ201410045511
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月8日
【發(fā)明者】杜鎮(zhèn)建, 張興民, 張春曉, 陳博, 王智 申請(qǐng)人:北京富龍康泰生物技術(shù)有限公司