一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的lc-qtof分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，以虎杖來(lái)源的白藜蘆醇和葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇為研究對(duì)象，利用高靈敏度高分辨率的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-QTOF)以提供更多化合物結(jié)構(gòu)信息的特點(diǎn)，研究白藜蘆醇樣品中的微量成分差異，找到了可以區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的四種標(biāo)示化合物，進(jìn)一步確認(rèn)了虎杖和葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇樣品中的微量成分差異，對(duì)于區(qū)分不同原料來(lái)源的白藜蘆醇樣品提供了方法借鑒，對(duì)天然保健食品-白藜蘆醇的真實(shí)屬性識(shí)別具有重要的意義。同時(shí)，該技術(shù)方法也可以廣泛的推廣應(yīng)用于進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品和生物原料的真實(shí)屬性檢測(cè)和鑒別標(biāo)準(zhǔn)中，為天然產(chǎn)物原料真實(shí)屬性的識(shí)別提供技術(shù)示范和參考標(biāo)準(zhǔn)的建立。
【專利說(shuō)明】—種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，提供了一種識(shí)別白藜蘆醇原料來(lái)源的LC-QTOF(液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用)分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白藜蘆醇具有抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)及抗菌等廣泛的生物活性，它所具有的特殊保健功效使得其在市場(chǎng)上廣受歡迎。隨著白藜蘆醇的生物活性逐漸被認(rèn)識(shí)，越來(lái)越多的保健品生產(chǎn)企業(yè)都非?？春冒邹继J醇的功能性，它作為終端產(chǎn)品的應(yīng)用面有望不斷拓寬?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)白藜蘆醇的需求量越來(lái)越大，白藜蘆醇將會(huì)更加廣泛、更安全的應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域當(dāng)中。
[0003]通常白藜蘆醇的來(lái)源有化學(xué)合成、微生物、生物合成及天然植物提取?；瘜W(xué)合成能大量的生產(chǎn)白藜蘆醇，但現(xiàn)階段化學(xué)合成白藜蘆醇的各種方法存在不同程度的環(huán)境污染等問(wèn)題；而微生物發(fā)酵生物合成白藜蘆醇技術(shù)的投入較大，在市場(chǎng)上尚未大規(guī)模形成產(chǎn)業(yè)化前景。因此市場(chǎng)上98%原料級(jí)白藜蘆醇主要源自于天然植物虎杖中提取獲得和合成獲得，但市場(chǎng)上有5%-20%不同規(guī)格的產(chǎn)品分別來(lái)自虎杖和其他植物如葡萄藤等。
[0004]中藥虎杖原材料本身含有少量的白藜蘆醇，但其含有高達(dá)3%左右的虎杖苷，通過(guò)生物酵解的方法可以得到高含量的白藜蘆醇，所以虎杖是工業(yè)生產(chǎn)白藜蘆醇的極為重要的原材料。中藥虎杖中白藜蘆醇主要開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品規(guī)格為50%、98%，產(chǎn)品價(jià)格約為800-3000元/公斤左右，具有較為廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。但由于虎杖為中國(guó)傳統(tǒng)藥材中的一種，并非藥食同源植物，在國(guó)外如日本，從虎杖中提取開(kāi)發(fā)的白藜蘆醇產(chǎn)品只能應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，在食品行業(yè)中使用具有一定的法律瓶頸。
[0005]而葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇含量相對(duì)較低(含量一般在幾十到幾百ppm)，其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)在我國(guó)相對(duì)滯后，但以藥食同源植物-葡萄藤為原料開(kāi)發(fā)的白藜蘆醇相關(guān)產(chǎn)品其安全性在國(guó)際市場(chǎng)上能夠得到更廣泛地接受，可以在醫(yī)藥領(lǐng)域中使用，也可以廣泛應(yīng)用到諸如保健品、食品領(lǐng)域中。同時(shí)，葡萄藤中不僅含有白藜蘆醇，而且還含有豐富的白藜蘆醇低聚物，如ε-viniferin、a-viniferin、Miyabenol C等,這些白藜蘆醇低聚物可以向單體轉(zhuǎn)化，從而提高白藜蘆醇的含量。葡萄藤中白藜蘆醇產(chǎn)品生產(chǎn)規(guī)格一般為5%或15-20%，價(jià)格分別在200歐元/公斤和1000歐元/公斤左右，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的虎杖來(lái)源白藜蘆醇產(chǎn)品價(jià)格，雖然價(jià)格昂貴，但受到健康食品制造商的青睞與歡迎。
[0006]不同植物來(lái)源生產(chǎn)的白藜蘆醇產(chǎn)品價(jià)格的巨大差異導(dǎo)致市場(chǎng)上一些不法商家為獲得高額利潤(rùn)以相對(duì)低廉的虎杖來(lái)源的白藜蘆醇假冒較昂貴的葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇應(yīng)用到保健品、食品領(lǐng)域中，市場(chǎng)上存在將高純度的虎杖來(lái)源白藜蘆醇添加到低純度葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇中的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致消費(fèi)者的身體健康受到一定程度的損害和威脅，也擾亂了相關(guān)產(chǎn)品的國(guó)際國(guó)內(nèi)的市場(chǎng)秩序，引起不同程度的貿(mào)易糾紛。國(guó)際市場(chǎng)上明確規(guī)定，具有藥用保健的產(chǎn)品不能添加到保健食品當(dāng)中，因此，為保證民眾身體健康、應(yīng)對(duì)國(guó)際貿(mào)易壁壘，維護(hù)我國(guó)產(chǎn)品的國(guó)際聲譽(yù)，維護(hù)國(guó)家經(jīng)濟(jì)社會(huì)穩(wěn)定和國(guó)際貿(mào)易健康發(fā)展，亟待加強(qiáng)白藜蘆醇產(chǎn)品原料來(lái)源的真實(shí)屬性表征與識(shí)別技術(shù)研究。
[0007]目前應(yīng)用得最多的白藜蘆醇的分析檢測(cè)方法如下:
[0008]( I)高效液相色譜法(HPLC)
[0009]白藜蘆醇的極性較小，分析檢測(cè)上普遍采用反相高效液相色譜進(jìn)行分析，常采用乙腈-磷酸水、甲醇-冰乙酸等常用流動(dòng)相分析。通用檢測(cè)器包括紫外分光光度計(jì)、二級(jí)管陣列、電化學(xué)、熒光掃描檢測(cè)等。吳波等人應(yīng)用高效液相色譜熒光檢測(cè)法建立了一種快速、靈敏、適用于水果中順、反白藜蘆醇及其苷的定量分析方法，此法已得到較好的應(yīng)用。
[0010](2)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)
[0011]由于白藜蘆醇與其衍生物結(jié)構(gòu)相近，且白藜蘆醇代謝物在植物體內(nèi)含量較低，單一的分析技術(shù)一般難以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，因此液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)成為用于分析此類復(fù)雜組分的重要手段之一，楊潤(rùn)濤等人以LichiOspher C18柱作為分析色譜柱，乙腈-水為流動(dòng)相，采用電噴霧離子源，內(nèi)標(biāo)法定量以及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，在已選定的條件下，建立了對(duì)血漿中白藜蘆醇苷及其代謝產(chǎn)物同時(shí)測(cè)定的LC-MS定量分析方法。LC-QTOF指的是液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜，LC-MS指的是液相色譜-單級(jí)質(zhì)譜，LC-QTOF技術(shù)是一種近年才興起的更先進(jìn)、更可靠、更準(zhǔn)確的質(zhì)譜技術(shù)，能獲得的化合物信息比LC-MS要多很多。
[0012](3)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)
[0013]欒天罡等人通過(guò)采用甲基硅烷化與固相微萃取技術(shù)(SPME)相結(jié)合的預(yù)處理方法，應(yīng)用GC-MS技術(shù)對(duì)葡萄藤酒中的19種極性有機(jī)物和多酚類化合物進(jìn)行定性分析，同時(shí)對(duì)反式白藜蘆醇進(jìn)行了定量分析。
[0014](4)毛細(xì)管電泳法(CE)
[0015]目前已經(jīng)用于白藜蘆醇定量檢測(cè)研究的電泳模式包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、非水介質(zhì)毛細(xì)管電泳等，能同時(shí)對(duì)白藜蘆醇的正、反異構(gòu)體進(jìn)行分離檢測(cè)。毛細(xì)管電泳檢測(cè)白藜蘆醇的技術(shù)通過(guò)與連續(xù)進(jìn)樣技術(shù)和固相萃取技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了樣品的自動(dòng)化預(yù)處理過(guò)程。曹佳等人以芐基三甲基碘化胺為內(nèi)標(biāo)，建立了 7分鐘內(nèi)使白藜蘆醇與白藜蘆醇苷達(dá)到基線分離、且線性動(dòng)態(tài)范圍和檢出限效果均較好的方法。鄭妍鵬等采用三(羥甲基)氨基甲烷-硼酸(THAM-H3B03)作為支持電解質(zhì)，甲醇作為分離介質(zhì)，用電導(dǎo)檢測(cè)技術(shù)對(duì)虎杖中的白藜蘆醇進(jìn)行了測(cè)定分析，結(jié)果表明采用非水介質(zhì)毛細(xì)管電泳電導(dǎo)檢測(cè)對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行測(cè)定時(shí)其干擾物質(zhì)分離效果優(yōu)于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。
[0016](5)薄層掃描色譜法(TLC)
[0017]周國(guó)海等人以氯仿:丙酮:乙酸:水(4:4:0.5:0.2)為展開(kāi)劑，硅膠G作為薄層吸附劑，對(duì)虎杖各部位白藜蘆醇的含量測(cè)定進(jìn)行了方法學(xué)考察。舒友琴等人以苯:甲醇:甲酸(10:5:1)為展開(kāi)劑，首次采用聚酰胺薄膜作固定相，利用熒光掃描法定量分析對(duì)虎杖白藜蘆醇4種異構(gòu)體進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明其測(cè)定靈敏度比硅膠作固定相的薄層掃描法提高了將近100倍，此法同樣也可應(yīng)用于其他樣品中的白藜蘆醇及其異構(gòu)體含量測(cè)定。
[0018]此外，目前用于白藜蘆醇的檢測(cè)方法還包括二次微分簡(jiǎn)易示波伏安法，電化學(xué)方法、酶標(biāo)法、離子共振光譜法、電子順磁共振法等。
[0019]至今為止，關(guān)于白藜蘆醇原料來(lái)源真實(shí)屬性識(shí)別與質(zhì)量控制的研究相對(duì)較少，國(guó)外對(duì)不同植物來(lái)源的白藜蘆醇的識(shí)別研究鮮有報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅劉岱琳等對(duì)葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇樣品進(jìn)行研究，采用高效液相色譜法建立了葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇樣品的分析譜圖，并對(duì)譜圖中主要色譜峰進(jìn)行識(shí)別與含量測(cè)定，且對(duì)易混淆的虎杖來(lái)源白藜蘆醇樣品進(jìn)行大黃素檢測(cè)，結(jié)果顯示葡萄藤白藜蘆醇樣品中含有其特有成分ε-viniferin, ε-viniferin與白藜蘆醇成一定比例存在于植物提取物中，并且葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇樣品中不應(yīng)檢出大黃素。
[0020]國(guó)內(nèi)劉岱琳的對(duì)葡萄白藜蘆醇提取物研究的具體方法為:利用高效液相色譜法建立葡萄來(lái)源白藜蘆醇提取物的分析圖譜，對(duì)其主要色譜峰白藜蘆醇及ε -viniferin進(jìn)行了識(shí)別，并建立了含量測(cè)定方法。
[0021]葡萄來(lái)源白藜蘆醇提取物的高效液相圖譜分析條件為:
[0022]色譜柱:C18，250mm*4.6mm, 5um
[0023]流速:1.0ml/min 柱溫:25°C 檢測(cè)波長(zhǎng):310nm
[0024]流動(dòng)相:A: 1%冰醋酸水溶液B: 1%冰醋酸甲醇溶液
[0025]白藜蘆醇及ε -viniferin的含量測(cè)定方法均為:
[0026]高效液相檢測(cè)條件:流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(30:70)，檢測(cè)波長(zhǎng):303nm
[0027]色譜柱:C18,150mm*4.6mm, 5um 流速:1.0ml/min
[0028]大黃素的含量測(cè)定方法為:
[0029]高效液相檢測(cè)條件:流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(85:15)，檢測(cè)波長(zhǎng):254nm
[0030]色譜柱:C18,150mm*4.6mm, 5um 流速:1.0ml/min
[0031]劉岱琳文章中采用不同的分析方法對(duì)葡萄白藜蘆醇提取物中白藜蘆醇、ε-葡萄素及大黃素進(jìn)行了分析和含量測(cè)定，其結(jié)果表明，葡萄來(lái)源的白藜蘆醇中含有其特有成分ε -葡萄素，并與白藜蘆醇成一定比例存在于植物提取物中，且葡萄來(lái)源白藜蘆醇提取物中不應(yīng)檢測(cè)出大黃素。
[0032]劉岱琳等人的研究方法只針對(duì)葡萄來(lái)源的白藜蘆醇提取物進(jìn)行了研究，得出葡萄來(lái)源白藜蘆醇中含有其特有成分ε -葡萄素，并猜測(cè)性的對(duì)葡萄來(lái)源白藜蘆醇中大黃素的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示葡萄來(lái)源白藜蘆醇中不應(yīng)檢測(cè)出大黃素，故此將ε-葡萄素與大黃素兩種化合物作為區(qū)別葡萄來(lái)源白藜蘆醇的依據(jù)。若將高純度的虎杖白藜蘆醇與葡萄白藜蘆醇混在一起，采用此法則無(wú)法辨別白藜蘆醇的真實(shí)來(lái)源，此法也未將其他原料來(lái)源白藜蘆醇如虎杖來(lái)源白藜蘆醇進(jìn)行對(duì)比研究，也不能明確如何鑒別不同原料來(lái)源的白藜蘆醇，在白藜蘆醇的識(shí)別技術(shù)上存在一定的缺陷。
[0033]該方法在一定程度上為識(shí)別葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇產(chǎn)品提供了借鑒與參考，但并未形成一套識(shí)別不同來(lái)源白藜蘆醇真實(shí)屬性的完整體系，該方法不能明確如何鑒別不同原料來(lái)源的白藜蘆醇，在白藜蘆醇的識(shí)別技術(shù)上存在一定的缺陷。因此，對(duì)于進(jìn)一步完善白藜蘆醇的分析檢測(cè)方法以及不同原料來(lái)源的白藜蘆醇識(shí)別技術(shù)，深化對(duì)白藜蘆醇真實(shí)屬性識(shí)別研究，研究出一套完整的白藜蘆醇識(shí)別研究方法，對(duì)其產(chǎn)品質(zhì)量管理控制具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0034]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，用同一種分析方法即可區(qū)分白藜蘆醇的不同來(lái)源，對(duì)天然保健食品-白藜蘆醇的真實(shí)屬性識(shí)別具有重要的意義。[0035]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0036]一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，具體步驟為:
[0037](I)配制檢測(cè)樣品:取白藜蘆醇質(zhì)量含量相同的虎杖提取物樣品和葡萄藤提取物樣品，加入醇溶解，配制成樣品質(zhì)量濃度相同的溶液，在25°C -30°C下超聲25-35min，靜置冷卻，微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為檢測(cè)樣品；
[0038](2)檢測(cè):將檢測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行分析，得到液相色譜圖和質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)；其中，分析條件控制如下:
[0039]a)液相色譜分析條件
[0040]色譜柱:XUnionC18 ；
[0041]流動(dòng)相:乙腈-水；
[0042]梯度洗脫:0-30min，流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10%_50% ；
[0043]30-40min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為50%_95% ；
[0044]40-42min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為95%_10% ；
[0045]42-50min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10% ；
[0046]流速:0.1-0.3mL/min ；
[0047]柱溫:25°C-35 °C ；
[0048]檢測(cè)波長(zhǎng):287nm；
[0049]b)質(zhì)譜分析條件
[0050]離子源:ESI霧化氣:50_60psig ；
[0051]掃描方式:負(fù)離子模式干燥氣流速:5_7L/min ；
[0052]鞘氣溫度:400°C ;毛細(xì)管電壓:3000V ；
[0053]鞘氣流速:10-14L/min;裂解電壓:125_145V ;
[0054]錐孔電壓:50-70V ;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜；
[0055](3)對(duì)圖譜和數(shù)據(jù)分析:
[0056]對(duì)采集到的虎杖及葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到共有峰；
[0057](4)特征化合物確認(rèn)
[0058]利用質(zhì)譜分析獲得的虎杖、葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇指紋圖譜中共有峰的化合物信息，根據(jù)精確分子量進(jìn)一步對(duì)總離子流圖進(jìn)行離子提取，得到EIC圖，對(duì)比EIC圖中的出峰差異，得到兩者間具有明顯差異性的特征化合物；
[0059](5)判斷
[0060]根據(jù)特征化合物來(lái)判斷白藜蘆醇的不同來(lái)源。
[0061]步驟(3)所述對(duì)圖譜和數(shù)據(jù)分析優(yōu)選如下:
[0062]采用Agilent Mass Hunter分析軟件對(duì)采集到的虎杖及葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到11個(gè)共有峰，具體如下:
[0063]在虎杖來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時(shí)間為10.26mi的峰為虎杖苷，出峰時(shí)間為16.02min的峰為3-甲基-5-羥基-7-甲氧基-色酮，出峰時(shí)間為17.087min的峰為大黃素-8-0- β -D-葡萄糖苷，出峰時(shí)間為17.627min的峰為大黃素甲醚_1_0- β -D-葡萄糖苷，出峰時(shí)間為20.2min的峰為大黃素甲醚_1_0-β -D-葡萄糖苷，出峰時(shí)間為22.093min的峰為山奈酚，出峰時(shí)間為34.487min的峰為大黃素；[0064]在葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時(shí)間為18.427min的峰為葡萄素A，出峰時(shí)間為19.4min的峰為葡萄素H，出峰時(shí)間為20.953min的峰為ε-葡萄素，出峰時(shí)間為
22.867min的峰為α -葡萄素；
[0065]步驟(4)的特征化合物確認(rèn)優(yōu)選如下:
[0066]利用質(zhì)譜分析獲得的虎杖、葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇指紋圖譜中共有峰的化合物信息，根據(jù)精確分子量進(jìn)一步對(duì)總離子流圖進(jìn)行離子提取，得到EIC圖，虎杖來(lái)源的白藜蘆醇提取物中在保留時(shí)間為20.200min處，34.827min處有相應(yīng)峰，分別為大黃素甲醚-l-0-β -D-葡萄糖苷和大黃素，且大黃素峰較高，而葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇提取物中在20.200min處沒(méi)有色譜峰，在34.827min處也不見(jiàn)峰形；對(duì)ε-葡萄素及α-葡萄素進(jìn)行EIC提取時(shí)，葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇提取物在保留時(shí)間為21.368min及23.253min處有相應(yīng)峰，而虎杖來(lái)源白藜蘆醇提取物在相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)沒(méi)有相應(yīng)峰，因此，得到兩者間具有明顯差異性的4個(gè)特征化合物，它們分別是虎杖來(lái)源的白藜蘆醇提取物中的大黃素甲醚-l-0-β -D-葡萄糖苷和大黃素以及葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇提取物中的ε -葡萄素和α-葡萄素；
[0067]步驟(5)判斷方法優(yōu)選如下:
[0068]通過(guò)上述分析，在EIC圖中，只在20.200min處和34.827min處有相應(yīng)峰，則為虎杖來(lái)源的白藜蘆醇；只在21.368min和23.253min處有相應(yīng)峰，則為葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇；在以上四個(gè)出峰時(shí)間均不出峰，則為其它來(lái)源的白藜蘆醇；在以上四個(gè)出峰時(shí)間均出峰，則為兩者的混合物。
[0069]分析條件優(yōu)選控制如下:
[0070]a)液相色譜分析條件
[0071]色譜柱:XUnionC18 ；
[0072]流動(dòng)相:乙腈-水；
[0073]梯度洗脫:0-30min，流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10%_50% ；
[0074]30-40min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為50%_95% ；
[0075]40-42min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為95%_10% ；
[0076]42-50min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10% ；
[0077]流速:0.2mL/min ；
[0078]柱溫:30°C；
[0079]檢測(cè)波長(zhǎng):287nm；
[0080]進(jìn)樣量:5yL
[0081]b)質(zhì)譜分析條件
[0082]離子源:ESI霧化氣:55psig ；
[0083]掃描方式:負(fù)離子模式干燥氣流速:6L/min ；
[0084]鞘氣溫度:400°C ;毛細(xì)管電壓:3000V ；
[0085]鞘氣流速:12L/min ;裂解電壓:135V ;
[0086]錐孔電壓:65V ;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜。
[0087]優(yōu)選所述白藜蘆醇的質(zhì)量含量為5%,所述樣品質(zhì)量濃度lOmg/lOOmL。
[0088]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是:[0089]1、該分析方法可以通過(guò)一種分析方法來(lái)區(qū)別白藜蘆醇的不同來(lái)源，特別是在葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇中區(qū)分是否含有虎杖來(lái)源的白藜蘆醇，防止將高純度的虎杖來(lái)源白藜蘆醇添加到低純度葡萄藤來(lái)源的白藜蘆醇中的現(xiàn)象發(fā)生。
[0090]2、該分析方法精確性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0091]圖1是5%虎杖白藜蘆醇TIC圖；
[0092]圖2是5%葡萄白藜蘆醇TIC圖；
[0093]圖3是98%虎杖白藜蘆醇TIC圖；
[0094]圖4是5%虎杖RES提取TIC圖；
[0095]圖5是5%虎杖RES提取大黃素甲醚-1_0_β -D-葡萄糖苷EIC圖；
[0096]圖6是5%虎杖RES提取大黃素EIC圖；
[0097]圖7是5%虎杖RES提取ε -葡萄素EIC圖；
[0098]圖8是5%虎杖RES提取α-葡萄素EIC圖；
[0099]圖9是5%葡萄RES提取TIC圖；
[0100]圖10是5%葡萄RES提取大黃素甲醚-1-0-β -D-葡萄糖苷EIC圖；
[0101]圖11是5%葡萄RES提取大黃素EIC圖；
[0102]圖12是5%葡萄RES提取ε -葡萄素EIC圖；
[0103]圖13是5%葡萄RES提取α-葡萄素EIC圖。
【具體實(shí)施方式】
[0104]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0105]I材料與方法
[0106]1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0107]1.1.1樣品材料
[0108]同一產(chǎn)地(湖北宜昌)不同時(shí)期虎杖提取物(白藜蘆醇含量均為5%)八批，同一產(chǎn)地(湖南永安)不同時(shí)期葡萄藤提取物(白藜蘆醇含量均為5%)八批，同一產(chǎn)地(湖北宜昌)不同時(shí)期虎杖提取物(白藜蘆醇含量均為98%)均由湖南美可達(dá)生物資源有限公司提供。
[0109]1.1.2儀器與設(shè)備
[0110]Agilentl290液相色譜-G6530系列四美國(guó)安捷倫公司
[0111]級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀
[0112]超純水裝置美國(guó)Milipore公司
[0113]電子分析天平上海Mettler-Tolede儀器有限公司
[0114]KQ5200DE型數(shù)控超聲裝置昆山市超聲儀器有限公司
[0115]1.1.3主要試劑
[0116]甲醇(安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司)為色譜純、乙腈(美國(guó)默克公司)為色譜純；所用水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水(總有機(jī)碳TOC ( 5ppb)；
[0117]白藜蘆醇(RES，≤99%)和虎杖苷(Polydatin，≤96%)、山奈酚(KaempferoI,≤96%)、大黃素(Emodin,≤98%)標(biāo)準(zhǔn)樣品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。[0118]1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0119]1.2.1混合對(duì)照品溶液制備
[0120]分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇、虎杖苷、山奈酚、大黃素適量，置于IOOmL棕色容量瓶中，加入適量色譜甲醇溶解，保持25°C超聲，直至樣品完全溶解，靜置冷卻定容，儲(chǔ)備液用色譜甲醇稀釋，配置成濃度為10-50 μ g/mL的混合對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μ m有機(jī)微孔濾膜，備用。
[0121]1.2.2供試液溶液制備
[0122]精密稱取5%、98%的虎杖提取物、5%的葡萄藤提取物樣品各10mg，置于IOOmL棕色容量瓶中，加入適量色譜甲醇溶解，保持25°C，超聲30min，靜置冷卻定容，過(guò)0.22 μ m有機(jī)微孔濾膜，濾液作為供試品溶液備用。
[0123]1.2.3色譜分析條件
[0124]色譜柱:XUnion C18(2.8ym，4.6X150mm)(華譜新創(chuàng)科技有限公司);
[0125]流動(dòng)相:乙腈(B)-水(A);梯度洗脫(0-30min，10%_50%B；30-40min, 50%-95%B ；40-42min,95%-10%B,42_50min，10%B)
[0126]流速:0.2mL/min ;
[0127]柱溫:30°C;
[0128]檢測(cè)波長(zhǎng):287nm;
[0129]進(jìn)樣量:5μ L
[0130]1.2.4質(zhì)譜分析條件
[0131]離子源:ESI霧化氣:55psig ；
[0132]掃描方式:負(fù)離子模式干燥氣流速:6L/min ；
[0133]鞘氣溫度:400°C ;毛細(xì)管電壓:3000V ；
[0134]鞘氣流速:12L/min ;裂解電壓:135V ;
[0135]錐孔電壓:65V ;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜。
[0136]2結(jié)果與分析
[0137]2.1方法學(xué)考察
[0138]2.1.1 精密度
[0139]取虎杖提取物(白藜蘆醇含量5%)樣品I號(hào)(HZ1)，按照1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄樣品色譜圖。結(jié)果表明主要色譜峰白藜蘆醇的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.52%，相對(duì)峰面積的RSD值為1.59%，如表3.1所示，符合特征圖譜要求，表明儀器的精密度良好。
[0140]表3.1精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，具體步驟為: (1)配制檢測(cè)樣品:取白藜蘆醇質(zhì)量含量相同的虎杖提取物樣品和葡萄藤提取物樣品，加入醇溶解，配制成樣品質(zhì)量濃度相同的溶液，在25°C -30°C下超聲25-35min，靜置冷卻，微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為檢測(cè)樣品； (2)檢測(cè):將檢測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行分析，得到液相色譜圖和質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)；其中，分析條件控制如下: a)液相色譜分析條件 色譜柱:XUnion C18 ； 流動(dòng)相:乙腈-水； 梯度洗脫:0-30min，流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10%_50% ； 30-40min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為50%_95% ； 40_42min,流動(dòng)相中乙臆的體積濃度為95%_10% ； 42-50min，流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10% ；
流速:0.1-0.3mL/min ；
柱溫:25°C -35 °C ； 檢測(cè)波長(zhǎng):287nm ； b)質(zhì)譜分析條件 離子源:ESI霧化氣:50_60psig ； 掃描方式:負(fù)離子模式干燥氣流速:5-7L/min ； 鞘氣溫度:400°C ； 毛細(xì)管電壓:3000V ； 鞘氣流速:10-14L/min ；裂解電壓:125-145V ； 錐孔電壓:50-70V; 質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜； (3)對(duì)圖譜和數(shù)據(jù)分析: 對(duì)采集到的虎杖及葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到共有峰； (4)特征化合物確認(rèn) 利用質(zhì)譜分析獲得的虎杖、葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇指紋圖譜中共有峰的化合物信息，根據(jù)精確分子量進(jìn)一步對(duì)總離子流圖進(jìn)行離子提取，得到EIC圖，對(duì)比EIC圖中的出峰差異，得到兩者間具有明顯差異性的特征化合物； (5)判斷 根據(jù)特征化合物來(lái)判斷白藜蘆醇的不同來(lái)源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，分析條件控制如下: a)液相色譜分析條件 色譜柱:XUnion C18 ； 流動(dòng)相:乙腈-水； 梯度洗脫:0-30min，流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10%_50% ； 30-40min,流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為50%_95% ； 40_42min,流動(dòng)相中乙臆的體積濃度為95%_10% ； 42-50min，流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為10% ；流速:0.2mL/min ； 柱溫:30°C ; 檢測(cè)波長(zhǎng):287nm ； 進(jìn)樣量:5yL b)質(zhì)譜分析條件 離子源:ESI霧化氣:55psig ； 掃描方式:負(fù)離子模式干燥氣流速:6L/min ； 鞘氣溫度:400°C ； 毛細(xì)管電壓:3000V ； 鞘氣流速:12L/min ; 裂解電壓:135V ; 錐孔電壓:65V;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，所述白藜蘆醇的質(zhì)量含量為5%,所述樣品質(zhì)量濃度lOmg/lOOmL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，步驟(3)所述對(duì)圖譜和數(shù)據(jù)分析如下: 采用Agilent Mass Hunter分析軟件對(duì)采集到的虎杖及葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到11個(gè)共有峰，具體如下: 在虎杖來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時(shí)間為10.26mi的峰為虎杖苷，出峰時(shí)間為.16.02min的峰為3-甲基-5-羥基-7-甲氧基-色酮，出峰時(shí)間為17.087min的峰為大黃素-8-0- β -D-葡萄糖苷，出峰時(shí)間為17.627min的峰為大黃素甲醚_1_0- β -D-葡萄糖苷，出峰時(shí)間為20.2min的峰為大黃素甲醚_1_0-β -D-葡萄糖苷，出峰時(shí)間為22.093min的峰為山奈酚，出峰時(shí)間為34.487min的峰為大黃素； 在葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時(shí)間為18.427min的峰為葡萄素A，出峰時(shí)間為.19.4min的峰為葡萄素H,出峰時(shí)間為20.953min的峰為ε -葡萄素，出峰時(shí)間為22.867min的峰為α -葡萄素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種區(qū)分不同來(lái)源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，步驟(4)所述特征化合物分別是虎杖來(lái)源的白藜蘆醇提取物中的大黃素甲醚-l-0-β-D-葡萄糖苷和大黃素以及葡萄藤來(lái)源白藜蘆醇提取物中的ε-葡萄素和α -葡萄素。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103808822SQ201410049300
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月13日
【發(fā)明者】張瑩, 曾建國(guó), 黃志強(qiáng), 李潔 申請(qǐng)人:湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院