一種用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，包含F(xiàn)uc-PON1半定量檢測ELISA板，所述的Fuc-PON1半定量檢測ELISA板由AAL-ELISA板和Protein-ELISA板組成。本發(fā)明的試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測快速準確等突出優(yōu)點，對肝癌的診斷具有重要的臨床價值。
【專利說明】—種用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，與應(yīng)用性基礎(chǔ)醫(yī)學研究和臨床研究相聯(lián)系；涵蓋腫瘤學、診斷學，糖生物學。
【背景技術(shù)】
[0002]HCC是一種多基因、多因素、病理機制復(fù)雜的常見惡性腫瘤。在我國，乙肝病毒攜帶者占人口的7.18%，是全世界乙肝攜帶者的2 / 3。與此相關(guān)的HCC患者數(shù)量龐大，占全世界的一半左右。絕大多數(shù)患者發(fā)病隱匿，出現(xiàn)臨床癥狀后就醫(yī)時已屬晚期，喪失了治療的良機，因此早期診斷對于提高患者的生存率至關(guān)重要。理想的肝癌標志物需要有較高的特異性，能夠?qū)⒏伟┡c肝硬化、肝炎、肝臟再生結(jié)節(jié)等疾病區(qū)分開來；同時還需較高的敏感性，能夠在肝癌早期即提示診斷，同時應(yīng)具有易檢測、可重復(fù)、可經(jīng)非侵入性操作測定等特點。
[0003]糖蛋白聚糖存在著宏觀和微觀的不均一性，其結(jié)構(gòu)功能變化和與疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。聚糖在很多關(guān)鍵的生物學過程中起到重要作用，比如細胞黏附、分子運輸和清除、受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及內(nèi)吞作用等。在生物體發(fā)育過程中，聚糖結(jié)構(gòu)也在變化，在不同的分化階段，聚糖有不同的表達。在癌癥的發(fā)生過程中，糖基化的改變是普遍存在的，如能關(guān)注糖基化的變化，可以提升診斷的特異性和敏感性。因此，利用檢測糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)的異常來診斷惡性腫瘤已引起相當重視，如AFP-L3的變化已成為檢測肝癌的重要聚糖標志等。目前檢測糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)方法有生物質(zhì)譜、液相色譜和植物凝集素親和印跡等，其中植物凝集素是一類存在于多數(shù)植物中的糖蛋白，其最大特點是能夠識別糖蛋白和糖脂中的聚糖，特別是細胞膜中復(fù)雜結(jié)構(gòu)的聚糖即細胞膜表面決定簇，它們與聚糖的結(jié)合是非共價且可逆的。AAL是一種親和α連接巖藻糖(Terminal a Fuc和土Sia-Lex)的植物凝集素，巖藻糖修飾能賦予聚糖很多獨特的功能特性，其在輸血反應(yīng)、凝集素介導(dǎo)的白細胞和內(nèi)皮的粘附、宿主和微生物相互作用和個體發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。此外，巖藻糖還參與構(gòu)成某些重要粘附分子的聚糖結(jié)構(gòu)，與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在癌癥中發(fā)現(xiàn)sialylLewisx和sialyl Lewisa含量增多，許多腫瘤中A和B型血型抗原丟失伴隨著H血型抗原和Lewisy表達升高。
[0004]PONl是由肝臟合成的一種糖蛋白，與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合，存在于血液和肝臟中，當慢性肝病有活動性病變時，肝細胞持續(xù)壞死，合成減少，相應(yīng)地進人循環(huán)的PONl減少，導(dǎo)致血清PONl活性降低。肝炎后肝硬化既有肝細胞的持續(xù)壞死，又有肝纖維化，其病理過程非常復(fù)雜，血清PONl活性顯著降低。血清PONl活性可作為判斷植入肝臟存活的生化指標之一，協(xié)同其他生化指標用來監(jiān)測肝移植患者的肝臟功能。據(jù)報道，HCV引起的炎癥繼而纖維化，PONl水平會持續(xù)下降，作為聯(lián)合許多氧化和抗氧化的分子一起作為臨床有用的監(jiān)測指標。最新發(fā)現(xiàn)HDL微粒和一些脂質(zhì)的蛋白含量異常，包括PONl的糖基化都會導(dǎo)致肝病患者血清中PONl的表達水平減少。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清單位PONl親和AAL能力顯著增強，說明肝癌患者的單位PONl巖藻糖基化聚糖含量增多。本發(fā)明應(yīng)用AAL對巖藻糖化聚糖的高親和性，通過AAL-ELISA和Protein-ELISA的制備與檢測，分別形成PONl抗體-抗原-生物素標AAL復(fù)合物和PONl抗體-抗原-生物素標抗體復(fù)合物，獲得PONl結(jié)合AAL的吸光度與PONl蛋白的吸光度比值Fuc-PONl，通過對臨床資料進行回顧性研究，建立腫瘤判別診斷函數(shù)，獲得ROC曲線和Cut off值，同時比較AFP-L3和Fuc-PONl對肝癌診斷的準確率差異。本發(fā)明適用于肝癌高發(fā)現(xiàn)場或者肝病人群大規(guī)模篩查，對于提高肝癌的診斷率，實現(xiàn)早期干預(yù)治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種具有較高準確率的用于診斷肝細胞性肝癌(HCC)的試劑盒。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，包含F(xiàn)uc-PONl半定量檢測ELISA板，所述的Fuc-PONl半定量檢測ELISA板由AAL-ELISA 板和 Protein-ELISA 板組成。
[0007]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含HCC預(yù)測模型:
[0008]P=exp(-0.915+0.275*Fuc_P0Nl) / [1+exp(_0.915+0.275*Fuc_P0Nl)]
[0009]所述的Fuc-PONl值的計算方法為:每個血清樣品中PONl結(jié)合AAL的實際OD值與相同血清樣品中PONl蛋白的實際OD值的比值，所述的血清樣品中PONl結(jié)合AAL的實際OD值通過AAL-ELISA板檢測得到，血清樣品中PONl蛋白的實際OD值通過Protein-ELISA板檢測得到，該模型區(qū)分肝癌和肝硬化的Cut off值為2.2727。
[0010]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含PONl捕獲抗體，其濃度為
lyg/ mLo
[0011]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含第一封閉劑和第二封閉齊U，第一封閉劑為3% BSA溶液，用于封閉AAL-ELISA板，第二封閉劑為含有1% BSA和
0.05% NaN3的溶液,用于封閉Protein-ELISA板。
[0012]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含第一氧化劑，第一氧化劑為PH4.0的含有IOOmM NaIO4和50mM檸檬酸的溶液，用于AAL-ELISA板的氧化。
[0013]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含生物素標記的AAL和生物素標記的抗體。
[0014]優(yōu)選地，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含采集血樣裝置及操作說明書。
[0015]本發(fā)明中提及的PONl蛋白由前期蛋白質(zhì)組學工作確定單位PONl親和AAL能力顯著增強，說明肝癌患者的單位PONl巖藻糖基化聚糖含量增多。
[0016]本發(fā)明主要是建立并優(yōu)化AAL-ELISA和Protein-ELISA方法，確定最優(yōu)的捕獲抗體濃度、血清樣品的上樣量、凝集素濃度和檢測抗體濃度；并選擇合適的AAL-ELISA封閉劑和氧化劑。排除PONl抗體與其它抗原的交叉反應(yīng)，確立AAL-ELISA和Protein-ELISA對PONl的檢測范圍和重復(fù)性，構(gòu)建可用于臨床血清樣品篩查的Fuc-PONI半定量檢測系統(tǒng)。
[0017]如圖1所示，本發(fā)明通過AAL-ELISA和Protein-ELISA的制備,聯(lián)合并行分析血清中對氧磷脂酶(PON)I的巖藻糖(Fuc)和蛋白的表達水平，用于肝癌和肝硬化病人血清中單位PONl蛋白中結(jié)合巖藻糖的含量(Fuc-PONl)的定量檢測。并根據(jù)Fuc-ΡΟΝΙ的檢測數(shù)據(jù)和臨床資料的回顧性研究，建立腫瘤判別診斷函數(shù)可用于原發(fā)性肝細胞肝癌的早期診斷。[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0019]本發(fā)明通過AAL (楊樹茹凝集素)-ELISA和Protein-ELISA的制備與檢測，分別形成抗體-抗原-生物素標AAL復(fù)合物和抗體-抗原-生物素標抗體復(fù)合物，以PONl結(jié)合AAL的吸光度(0D值)與PONl蛋白的吸光度比值作為衡量單位PONl蛋白中結(jié)合巖藻糖的含量(Fuc-PONl)，通過對臨床資料進行回顧性研究，建立腫瘤判別診斷函數(shù)，獲得受試者工作曲線(ROC)以及判別(Cut off)值，該函數(shù)對于HCC的診斷靈敏度和特異度分別為60.3%和71.4%, AUC為0.736，優(yōu)于甲胎蛋白N-聚糖核心巖藻糖(AFP-L3)。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測快速準確等突出優(yōu)點，對肝癌的診斷具有重要的臨床價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為高通量Fuc-PONl檢測系統(tǒng)原理示意圖；
[0021]圖2a為AAL-ELISA線性檢測范圍圖
[0022]圖2b為Protein-ELISA線性檢測范圍圖。
[0023]圖3為Fuc-PONl和AFP-L3檢測系統(tǒng)分別構(gòu)建ROC曲線圖；
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。
[0025]實施例:
[0026]一、一種用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，包含如下組分:
[0027]1、Fuc-PONl半定量檢測ELISA板，所述的Fuc-PONl半定量檢測ELISA板由AAL-ELISA 板和 Protein-ELISA 板組成。
[0028]2、HCC預(yù)測模型:
[0029]P=exp(_0.915+0.275*Fuc_P0Nl) / [1+exp(-0.915+0.275*Fuc_P0Nl)]
[0030]所述的Fuc-PONl值的計算方法為:每個血清樣品中PONl結(jié)合AAL的實際OD值與相同血清樣品中PONl蛋白的實際OD值的比值，所述的血清樣品中PONl結(jié)合AAL的實際OD值通過AAL-ELISA板檢測得到，血清樣品中PONl蛋白的實際OD值通過Protein-ELISA板檢測得到，該模型區(qū)分肝癌和肝硬化的Cut off值為2.2727。
[0031]3、PONl 捕獲抗體，其濃度為 I μ g / mL。(R&D Systems, Catalog#DYC5816,Part#843480)
[0032]4、第一封閉劑(3% BSA in PBS, pH7.2-7.4)。
[0033]5、第二封閉劑(1% BSA，0.05% NaN3in PBS, pH7.2-7.4)。
[0034]6、第一氧化劑(IOOmM NaIO4, 50mM Citric acid, ρΗ4.0)。
[0035]7、生物素標記的AAL。
[0036]8、生物素標記的抗體(1% BSAin PBS，ρΗ7.2-7.4 稀釋)。
[0037]9、HRP-streptavidin。(Thermo Scientific, Product#N100)。
[0038]10、采集血樣裝置及操作說明書。
[0039]二、檢測方法:
[0040]( 一 ) AAL-ELISA 板和 Protein-ELISA 板的預(yù)處理方法:[0041]1、取兩塊 ELISA 板，分別用作 AAL-ELISA 板和 Protein-ELISA 板；
[0042]2、捕獲抗體:在AAL-ELISA板和Protein-ELISA板中加入PONl捕獲抗體，AAL-ELISA 中 PONl 捕獲抗體濃度為 I μ g / mL，100 μ L / well ；Protein-ELISA 中 PONl 捕獲抗體濃度為lug / mL, 100 μ L / well。室溫孵育過夜。
[0043]3、洗板:采用 PBST(0.05% Tween20in PBS，ρΗ7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300yL / well，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0044]4、封閉:AAL-ELISA 板采用第一封閉劑(3 % BSA in PBS，ρΗ7.2-7.4)；Protein-ELISA 采用第二封閉劑(1% BSA, 0.05% NaN3in PBS, ρΗ7.2-7.4)室溫封閉 Ih,200 μ L / well ο
[0045]5、洗板:采用 PBST(0.05% Tween20in PBS，ρΗ7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300yL / well，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0046]6、氧化:AAL-ELISA 板米用第一氧化劑(IOOmM NaIO4, 50mM Citric acid, pH4.0)；Protein-ELISA采用第二封閉劑(1% BSA，0.05% NaN3in PBS，pH7.2-7.4)進行氧化，4°C避光反應(yīng) Ih, 200 μ L / well。
[0047]7、洗板:采用 PBST(0.05 % Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分鐘，300yL / well，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干，分別得到處理后的AAL-ELISA板和Protein-ELISA板，用于下述步驟。
[0048]( 二)Fuc-PONl半定量檢測ELISA檢測方法:
[0049]1、加樣:AAL-ELISA板加入稀釋后血清樣品50 μ L / well (采用PBSl:30稀釋)；Protein-ELISA板加入稀釋后血清樣品100 μ L / well (0.5 μ L血清采用lmMEDTA,0.5%Triton X-1OOin PBS, ρΗ7.2-7.4 稀釋至 100 μ L)，室溫 2h。
[0050]2、洗板:采用 PBST(0.05% Tween20in PBS，ρΗ7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300yL / well，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0051]3、檢測試劑:AAL-ELISA板中加入Iyg / mL生物素標記的AAL(PBST稀釋)；Protein-ELISA 板中加入 600ng / mL 生物素標記的抗體(1% BSA in PBS, ρΗ7.2_7.4 稀#),100 μ L / well，室溫 2h。
[0052]4、洗板:采用 PBST(0.05% Tween20in PBS，ρΗ7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300yL / well，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0053]5、酶結(jié)合物工作液:AAL_ELISA板中加入HRP-sztreptavidin (采用封閉劑1,1:12500 稀釋);Protein-ELISA板中加入HRP-sztr印tavidin(采用 1%BSA in PBS, 1:12500稀釋)，100 μ L / well,室溫 30min。
[0054]6、洗板:采用 PBST(0.05% Tween20in PBS，ρΗ7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300yL / well，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0055]7、加底物溶液:將底物溶液按照TMB =H2O2=I:2混合，100 μ L / well，室溫20min。
[0056]8、加終止液:100yL Stop Solution / well，終止液的加入順序與底物溶液的加入順序相同。
[0057]9、檢測:立即用NanoQuant infinite M200 (TECAN)酶標儀在450nm波長測量各孔的OD值。應(yīng)提前打開酶標儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。
[0058](三)Fuc-PONl半定量檢測ELISA分析方法:[0059]1、數(shù)據(jù):每個血清樣品的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值為實際OD值。每個血清樣品PONl結(jié)合AAL的實際OD值(AAL-ELISA)與此相同血清樣品PONl蛋白的實際OD值(Protein-ELISA)比值即為 Fuc-PONl 值。
[0060]按照上述HCC預(yù)測模型計算P值，將P值與Cut off值比較，> 2.2727為肝癌，< 2.2727為肝硬化。
[0061]采用實施例中的試劑盒和檢測方法，聯(lián)合并行分析86例肝病血清樣品(肝硬化和肝癌患者各43例，均經(jīng)臨床確診)中PONl的巖藻糖和蛋白的表達水平，計算得到Fuc-PONl含量。采用SPSS軟件logistic回歸分析建立的上述HCC預(yù)測模型進行檢測區(qū)分肝癌和肝硬化的 Cut off 值為 2.2727。(AFP-L3 檢測試劑盒購自 Abnova 公司(Catalog#KA1187)，按照試劑盒操作步驟檢測上述86例肝病血清樣品中AFP-L3含量，采用SPSS軟件獲得ROC曲線。)，比較本發(fā)明試劑盒和AFP-L3對肝癌診斷的準確性和特異性，結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明試劑盒的靈敏度為60.3%，特異度71.4%，準確性為64%，AUC為0.736，而AFP-L3對HCC的診斷靈敏度、特異度和準確性均為60.5%，AUC為0.612。如表1所示，肝硬化患者AFP-L3檢測均值為0.8466，標準差為0.32 ;肝癌患者AFP-L3檢測均值為0.9779，標準差為
0.36 ；p值為0.0393。肝硬化患者Fuc-PONl檢測均值為2.6315，標準差為2.18 ;肝癌患者Fuc-PONl檢測均值為4.3609，標準差為3.08 ；p值為0.002。
[0062]表1:Fuc-P0Nl和AFP-L3檢測結(jié)果相互比較
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，包含F(xiàn)uc-PONl半定量檢測ELISA板，所述的Fuc-PONl半定量檢測ELISA板由AAL-ELISA板和Protein-ELISA板組成。
2.如權(quán)利要求1所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，還包含HCC預(yù)測模型:
P=exp(-0.915+0.275*Fuc_P0Nl) / [1+exp(-0.915+0.275*Fuc_P0Nl)] 所述的Fuc-PONl值的計算方法為:每個血清樣品中PONl結(jié)合AAL的實際OD值與相同血清樣品中PONl蛋白的實際OD值的比值，所述的血清樣品中PONl結(jié)合AAL的實際OD值通過AAL-ELISA板檢測得到，血清樣品中PONl蛋白的實際OD值通過Protein-ELISA板檢測得到，該模型區(qū)分肝癌和肝硬化的Cut off值為2.2727。
3.如權(quán)利要求1所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，還包含PONl捕獲抗體，其濃度為I μ g/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含第一封閉劑和第二封閉劑，第一封閉劑為3% BSA溶液，用于封閉AAL-ELISA板，第二封閉劑為含有I % BSA和0.05 % NaN3的溶液，用于封閉Protein-ELISA 板。
5.如權(quán)利要求1所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含第一氧化劑，第一氧化劑為PH4.0的含有IOOmM NaIO4和50mM檸檬酸的溶液，用于AAL-ELISA板的氧化。
6.如權(quán)利要求1所述的 用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含生物素標記的AAL和生物素標記的抗體。
7.如權(quán)利要求1所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒，其特征在于，所述的用于診斷肝細胞性肝癌的試劑盒還包含采集血樣裝置及操作說明書。
【文檔編號】G01N33/96GK103777026SQ201410058332
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】張舒 申請人:復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院