一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法，包括以下步驟：選擇豚鼠50只，隨機分成正常對照組以及病毒感染6、12、28和42d組；通過滴鼻方法接種副流感病毒，Buxco肺功能儀測定咳嗽反射敏感性；檢測副流感病毒抗原和核酸、肺組織勻漿的P物質(zhì)含量、肺組織P物質(zhì)受體NK1、辣椒素受體亞型1的mRNA水平、肺組織P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物的表達及半定量分析；并對P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物與咳嗽反射敏感性的相關(guān)性進行分析。本發(fā)明的方法簡單，得出了神經(jīng)肽的釋放增加提示神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生，CRS和神經(jīng)肽的時空變化以及兩者的正相關(guān)提示神經(jīng)源性炎癥在CRS增高和病毒感染性咳嗽中起重要作用。
【專利說明】一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試 驗方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于神經(jīng)源炎癥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽 反射敏感性關(guān)系的試驗方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 咳嗽；咳嗽反射敏感性；神經(jīng)源性炎癥；副流感病毒；P物質(zhì)急性上呼吸道感染 (upper respiratory tract infection, URI)是急性咳嗽（3周以內(nèi)）最常見的原因。而 感染后咳嗽（URI恢復之后，咳嗽遷延不愈大于3周，而胸片正常）是亞急性咳嗽中的最常 見原因，一般由病毒感染引起。然而，病毒感染引起的咳嗽，尤其是感染后咳嗽的機制不甚 明確，對于治療更是面臨困惑。人類副流感病毒型（parainfluenza virustype3, PIV3)是 人類URI的一個非常常見的病原，絕大部分人在兒童時代已受副流感病毒型（PIV3)感染。 血清學監(jiān)測表示，5歲及以上兒童90%以上有抗人類副流感病毒型（PIV3)抗體。僅僅是因 為副流感病毒型（PIV3)感染，就幾乎占美國住院兒童的11%。副流感病毒型（PIV3)感染 引起的URI頻繁伴發(fā)咳嗽，而且再感染也常常發(fā)生。因此對副流感病毒型（PIV3)感染引起 咳嗽的機制研究有著重要意義?？人苑瓷涿舾行裕╟ough reflex sensitivity, CRS)異常 增高是機體咳嗽反應的一個十分重要的原因。支氣管肺C纖維興奮導致其含有的以P物質(zhì) (substance P，SP)為主的神經(jīng)肽釋放引起的神經(jīng)源性炎癥可能在咳嗽反射敏感性（CRS) 改變以及咳嗽發(fā)病中起重要作用。無髓鞘感覺神經(jīng)C纖維相當于興奮型的非膽堿能-非腎 上腺素能（conadrenergic noncholinergic nerve, NANC)神經(jīng)。Carr等發(fā)現(xiàn)豚鼠副流感病 毒感染后表達SP明顯增加。Sekizawa等發(fā)現(xiàn)，健康人霧化吸入SP并不直接誘導咳嗽，而呼 吸道感染患者吸入SP則可誘發(fā)咳嗽。OConnell等的臨床研究報道，URI患者吸入辣椒素刺 激咳嗽后咳嗽反射敏感性（CRS)升高。但是，迄今為止，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)URI感染動物的咳嗽 和咳嗽反射敏感性（CRS)的研究，URI引起咳嗽反射敏感性（CRS)增高的機制還不是很清 楚。病毒感染可以引起神經(jīng)肽的異常表達,但這些神經(jīng)肽在病毒感染性咳嗽發(fā)病中的表達 和作用究竟如何均有待明確。辣椒素受體亞型I (vanilloid receptor subtype-1，VR1)，是 瞬時受體電位通道蛋白的超家族的成員之一。C纖維最顯著特征是纖維末梢上有VRl的功 能性表達。VRl受體的活化可誘導C纖維末梢釋放神經(jīng)肽SP等。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性咳嗽患 者VRl顯著高于健康者；而且，CRS與支氣管黏膜的VRl表達呈高度相關(guān)；氣道平滑肌VRl 的表達也增強。表明VRl參與了慢性咳嗽的發(fā)病過程。但病毒感染后，VRl表達是否增高， 以及與咳嗽反射敏感性（CRS)的關(guān)系如何，目前仍未見報道。有研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道病毒感染 引起蛋白基因產(chǎn)物（protein gene produc，t PGP-9. 5)的表達水平改變，可能是豚鼠肺內(nèi) 發(fā)生神經(jīng)源性炎癥的一個標志。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明實施例的目的在于提供一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性 關(guān)系的試驗方法，旨在解決現(xiàn)有缺少副流感病毒感染后，辣椒素受體亞型1是否增高，以及 與咳嗽反射敏感性的關(guān)系如何的問題。
[0004] 本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān) 系的試驗方法，該辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法包括以下步 驟：
[0005] 選擇豚鼠50只，隨機分成正常對照組以及病毒感染6、12、28和42d組；通過滴鼻 方法接種副流感病毒，Buxco肺功能儀測定咳嗽反射敏感性；
[0006] 免疫熒光和FQ-PCR方法檢測副流感病毒抗原和核酸，ELISA法檢測肺組織勻漿的 P物質(zhì)含量；FQ-PCR檢測肺組織P物質(zhì)受體NKl、辣椒素受體亞型1的mRNA水平；免疫組化 方法檢測肺組織P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物的表達及半定量分析；
[0007] 并對P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物與咳嗽反射敏感性的相關(guān)性進行 分析。
[0008] 進一步，副流感病毒型的培養(yǎng)、傳代、凍存及定量，具體包括以下步驟：
[0009] 第一步，細胞培養(yǎng)細胞株人恒河猴腎細胞，來源于ATCC，LLC細胞是對PIV3敏感的 細胞，用于毒株的傳代培養(yǎng)；
[0010] 第二步，病毒的培養(yǎng)、傳代及凍存副流感病毒型來源于ATCC，LLC細胞在培養(yǎng)瓶中 長至70%?80%融合，取病毒懸液20(^接種于細胞上，每151^11搖動1次，吸附211后倒 出病毒液，加入2%胎牛血清的培養(yǎng)基，于第2d?3d開始出現(xiàn)細胞病變，待病變達50%? 60(%時收獲病毒，將病毒反復凍融2次?3次后100001'/1^114#離心201^11，去除細胞碎片， 收集上清分裝后液氮中凍存；
[0011] 第三步，空斑技術(shù)測定病毒感染滴度，使用常規(guī)空斑技術(shù)，培養(yǎng)基為DMEM/F12培 養(yǎng)基，以空斑形成單位t PFU來表示病毒感染滴度。
[0012] 進一步，該辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法具體包括 以下步驟：
[0013] 第一步，實驗動物及分組，雄性純白SPF級豚鼠，體重250g?300g之間，隨機分成 5組，即正常對照組和4個病毒感染組，每組10只，病毒感染組按病毒感染后天數(shù)又分為6、 12、28 和 42d4 個組；
[0014] 第二步，動物飼養(yǎng)及病毒接種方法，動物在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，感染組動物單獨飼 養(yǎng)，在適應新的環(huán)境1周后開始接種病毒，病毒滴鼻，乙醚麻醉后，兩側(cè)鼻孔分別滴入75uL 的擴增凍存好的病毒液，病毒滴度為33 3 105pfu，接種當天同時進行空斑實驗再次鑒定接 種病毒的滴度，對照組豚鼠滴入病毒培養(yǎng)用培養(yǎng)基MEM ;
[0015] 第三步，豚鼠咳嗽反射敏感性的測定，應用單腔非限制型小動物體描儀來測定豚 鼠的咳嗽反射敏感性，判斷咳嗽反射敏感性的指標主要是咳嗽總次數(shù)，單腔非限制型小動 物體描儀通過采集氣流變化信號，計算曲線下面積以及氣流半數(shù)峰值轉(zhuǎn)換時間，經(jīng)過模擬 方程換算后判斷是否為咳嗽動作，還是打噴嚏或者其它不規(guī)則的活動，而辣椒素激發(fā)溶液 濃度為50mol/L，總量為ImL,觀測記錄IOmin內(nèi)的CCnt。
[0016] 進一步，豚鼠副流感病毒型感染的病毒學檢測，具體方法為：
[0017] 第一步，直接免疫熒光法檢測副流感病毒型抗原，蘋果綠熒光視為陽性，副流感病 毒型是胞漿發(fā)熒光，可呈不規(guī)則的顆粒熒光；
[0018] 第二步，SYBR Green熒光定量PCR方法檢測副流感病毒型RNA的含量， 副流感病毒型上游引物為 5-TTTGCCCTTGGACCGAC-3,5-AACCCTGCCCTTTGTGC-3,產(chǎn)物 大小為134bp ;GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物5-TGGTGCCAAAAGGGTCA-3下游引物為 5-CCTCCACAATGCCGAAGT-3,產(chǎn)物大小為176bp，含有和待測樣品相同擴增片段的副流感病毒 型病毒質(zhì)粒DNA標準品，病毒核酸含量為28 3 1O15coPiesZL;首先提取肺組織病毒RNA， 測定濃度和變形瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量后，每組取Ig RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，RNA逆轉(zhuǎn)錄 為cDNA，20L反應體系，反轉(zhuǎn)錄反應條件為：37#15m in和85#5s，最后進行real-ti me PCR 反應，兩步法PCR擴增標準程序如下：預變性，95#30sl個循環(huán)；PCR反應，95#5s，60#30s，40 個循環(huán)，結(jié)果計算：用已知濃度的病毒標準品10倍稀釋，和未知樣品一起進行PCR反應，通 過稀釋標準品得到的標準曲線來確定未知樣品中的病毒拷貝數(shù)。
[0019] 進一步，檢測豚鼠肺組織P物質(zhì)含量的肺組織勻漿液的制備及檢測方法，具有包 括以下步驟；
[0020] 稱取IOOmg豚鼠肺組織，先加 lmol/L醋酸3mL，100#水浴IOmin以滅活內(nèi)源性激 肽酶活性，然后按比例加入一定量的PBS，用Iml?3mL玻璃勻漿器勻漿，3500r/min離心 20min，取上清-70#保存；或水浴后-70#保存，用前勻漿，ELISA法檢測豚鼠肺組織P物質(zhì) 的含量。
[0021] 進一步，SYBR Green real-ti me PCR 方法檢測方法為：
[0022] 豚鼠肺組織NKl、VRlmRNA的相對表達量NKl上游引物為 5-CTTCCTCCTGCCCTACATCAAC-3,5-CTGCCCTGGGTCTGGAAATAC-3,產(chǎn)物大小為 240bp ;VR1 上 游引物為 5-TCAAAGACCCGGAAACAGGG-3, 5-CTCTACCAGGAGGGTCACCA-3,產(chǎn)物大小為 224bp， GAPDH內(nèi)參照同前，測定濃度和變形瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量后，每組取Ig RNA進行反轉(zhuǎn) 錄反應，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，20L反應體系，反轉(zhuǎn)錄反應條件為：37#15min和85#5s，最后進 行real-ti me PCR反應，兩步法PCR擴增標準程序如下：預變性，95#30sl個循環(huán)；PCR反 應，95#5s，60#30s，40個循環(huán)，結(jié)果計算：用已知濃度的病毒標準品10倍稀釋，和未知樣 品一起進行PCR反應，結(jié)果計算：采用GAPDH作為內(nèi)參照和2-Ct相對定量法來計算NK1、 VRlmRNA的表達水平。
[0023] 進一步，免疫組化方法檢測豚鼠肺組織P物質(zhì)、VRl和PGP-9. 5蛋白的表達及免疫 組化結(jié)果圖像分析免疫組化圖片用Leica顯微鏡觀察、拍照，進行蛋白表達強度或灰度的 比較，根據(jù)以下染色深淺行半定量分析：〇=無染色；1 =輕度著色；2 =中度著色；3 =強著 色；4 =很強著色，每張片子至少隨機分析5個高倍視野。
[0024] 進一步，統(tǒng)計學處理采用SPSS160統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)％標準差或者 中位數(shù)表示，符合正態(tài)分布并且方差齊時多組間的總體檢驗采用One-way AN0VA，組間比較 采用ANOVA中的最小顯著差異法；不符合正態(tài)分布或者方差不齊時各組間總體檢驗采用非 參數(shù)經(jīng)驗Kruskal-Wallis法,兩組間比較采用Bonferroni的組間比較檢驗法。
[0025] 本發(fā)明提供的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法，通過 選擇豚鼠50只，滴鼻方法接種副流感病毒，測定咳嗽反射敏感性、副流感病毒抗原和核酸、 肺組織勻漿的P物質(zhì)含量、肺組織P物質(zhì)受體NKl、辣椒素受體亞型1的mRNA水平、肺組織 P物質(zhì)、辣椒素受:體亞型1和蛋白基因廣物的表達及半定量分析；對P物質(zhì)、辣椒素受:體亞 型1和蛋白基因產(chǎn)物與咳嗽反射敏感性的相關(guān)性進行分析。本發(fā)明的方法簡單，得出了神 經(jīng)肽的釋放增加提示神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生，咳嗽反射敏感性和神經(jīng)肽的時空變化以及兩者 的正相關(guān)提示神經(jīng)源性炎癥在咳嗽反射敏感性增高和病毒感染性咳嗽中起重要作用，較好 的解決了現(xiàn)有缺少副流感病毒感染后，辣椒素受體亞型1是否增高，以及與咳嗽反射敏感 性的關(guān)系如何的問題，為臨床醫(yī)學的發(fā)展提供了保障條件。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1是本發(fā)明實施例提供的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試 驗方法的流程圖；
[0027] 圖2是本發(fā)明實施例提供的豚鼠 CRS測定結(jié)果示意圖；
[0028] 圖3是本發(fā)明實施例提供的豚鼠肺組織PIV3RNA含量測定結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】
[0029] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0030] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。
[0031] 如圖1所示，本發(fā)明實施例的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的 試驗方法包括以下步驟：
[0032] SlOl :選擇豚鼠50只，隨機分成正常對照組以及病毒感染6、12、28和42d組；通過 滴鼻方法接種副流感病毒，Buxco肺功能儀測定咳嗽反射敏感性；
[0033] S102 :免疫熒光和FQ-PCR方法檢測副流感病毒抗原和核酸，EL ISA法檢測肺組織 勻漿的P物質(zhì)含量；FQ-PCR檢測肺組織P物質(zhì)受體NKl、辣椒素受體亞型1的mRNA水平；免 疫組化方法檢測肺組織P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物的表達及半定量分析；
[0034] S103 :并對P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物與咳嗽反射敏感性的相關(guān) 性進行分析。
[0035] 結(jié)合本發(fā)明的具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明：
[0036] 1、實驗試劑及儀器胎牛血清及MEM、DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco ;辣椒素購自 Sigma ;P物質(zhì)ELISA檢測試劑盒購自R&D，RNAisoTMP Ius (病毒RNA提取試劑盒）、組織 總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green熒光定量PCR反應試劑盒均購自TaKaRa， PIV3DFI免疫熒光檢測試劑盒購自M illipore，VRl兔抗多克隆抗體、SP和PGP-9. 5鼠抗 單克隆抗體均購自Abca m，HRP標記免疫組化V抗購自Invitrogen ;SABC免疫組化試劑盒 及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，單腔非限制型小動物體描儀購自Buxco ; MK3型酶標儀購自上海賽默飛世兒儀器公司；Leica DM4000智能型生物顯微鏡購自Leica;
[0037] 2、細胞培養(yǎng)和副流感病毒型（PIV3)的培養(yǎng)、傳代、凍存及定量，具體包括以下步 驟：
[0038] 第一步，細胞培養(yǎng)細胞株人恒河猴腎細胞，來源于ATCC，LLC細胞是對PI V3敏感 的細胞，用于毒株的傳代培養(yǎng)；
[0039] 第二步，病毒的培養(yǎng)、傳代及凍存副流感病毒型（PIV3)來源于ATCC，LLC細胞在培 養(yǎng)瓶中長至70%?80%融合后，取病毒懸液200L接種于細胞上，每15min搖動1次，吸附 2h后倒出病毒液，加入2%胎牛血清的培養(yǎng)基，于第2d?3d開始出現(xiàn)細胞病變（CPE)，待病 變達50%?60%時收獲病毒，將病毒反復凍融2次?3次后100001'/1^114#離心201^11，去 除細胞碎片，收集上清分裝后液氮中凍存；
[0040] 第三步，空斑技術(shù)測定病毒感染滴度，使用常規(guī)空斑技術(shù)，培養(yǎng)基為DMEM/F12培 養(yǎng)基，以空斑形成單位（t PFU)來表示病毒感染滴度；
[0041] 3、具體方法：
[0042] 第一步，實驗動物及分組，雄性純白SPF級豚鼠，購自廣東省實驗動物中心，體重 250g?300g之間，隨機分成5組，即正常對照組（vehicle)和4個病毒感染組，每組10 只，病毒感染組按病毒感染后天數(shù)（PID)又分為6、12、28和42d4個組；
[0043] 第二步，動物飼養(yǎng)及病毒接種方法，動物在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，感染組動物單獨飼 養(yǎng)，在適應新的環(huán)境1周左右后開始接種病毒，病毒滴鼻：乙醚麻醉后，兩側(cè)鼻孔分別滴入 75uL的事先擴增凍存好的病毒液，病毒滴度為33 3〗〇5pfu，接種當天同時進行空斑實驗再 次鑒定接種病毒的滴度，對照組豚鼠滴入病毒培養(yǎng)用培養(yǎng)基MEM ;
[0044] 第三步，豚鼠咳嗽反射敏感性（CRS)的測定，本發(fā)明應用單腔非限制型小動物體 描儀（購自Buxco)來測定豚鼠的咳嗽反射敏感性（CRS)，各組動物分別在預定時間進行辣 椒素咳嗽激發(fā)試驗，判斷咳嗽反射敏感性（CRS)的指標主要是咳嗽總次數(shù)（cough coun，t CCnt) ,Buxco系統(tǒng)通過采集氣流變化信號，計算曲線下面積（V2)以及氣流半數(shù)峰值轉(zhuǎn)換時 間，經(jīng)過模擬方程換算后判斷是否為咳嗽動作，還是打噴嚏或者其它不規(guī)則的活動，而辣椒 素激發(fā)溶液濃度為50mol/L，總量為lmL，觀測記錄IOmin (含霧化時間）內(nèi)的CCnt ;
[0045] 4、豚鼠副流感病毒型（PIV3)感染的病毒學檢測，具體方法為：
[0046] 第一步，直接免疫熒光法檢測副流感病毒型（PIV3)抗原，蘋果綠熒光視為陽性， 副流感病毒型（PIV3)主要是胞漿發(fā)熒光，可呈不規(guī)則的顆粒熒光；
[0047] 第二步，SYBR Green突光定量PCR(real-time PCR)方法檢測副流 感病毒型（PIV3)RNA的含量（copies/mL)，副流感病毒型（PIV3)上游引物為 5-TTTGCCCTTGGACCGAC-3, 5-AACCCTGCCCTTTGTGC-3,產(chǎn)物大小為 134bp ;GAPDH 作為內(nèi)參 照，上游引物 5-TGGTGCCAAAAGGGTCA-3 下游引物為 5-CCTCCACAATGCCGAAGT-3，產(chǎn)物大小 為176bp，含有和待測樣品相同擴增片段的副流感病毒型（PIV3)病毒質(zhì)粒DNA標準品由 TaKaRa公司合成提供，其病毒核酸含量為28 3l015copies/L (構(gòu)建標準品的過程略）； 首先提取肺組織病毒RNA，測定濃度和變形瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量后，每組取Ig RNA 進行反轉(zhuǎn)錄反應（RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA)，20L反應體系，反轉(zhuǎn)錄反應條件為：37#15min和 85#5s，最后進行real-time PCR反應，兩步法PCR擴增標準程序如下：預變性，95#30sl個 循環(huán)；PCR反應，95#5s，60#30s，40個循環(huán)，結(jié)果計算：用已知濃度的病毒標準品10倍稀釋 (102-101 lcopies/L)，和未知樣品一起進行PCR反應，通過稀釋標準品得到的標準曲線來 確定未知樣品中的病毒拷貝數(shù)；
[0048] 5、檢測豚鼠肺組織SP含量的肺組織勻漿液的制備及檢測方法，具有包括以下步 驟；
[0049] 稱取IOOmg新鮮豚鼠肺組織，先加 lmol/L醋酸3mL，100#水浴IOmin以滅活內(nèi)源 性激肽酶活性，然后按比例加入一定量的PBS，用Iml?3mL玻璃勻漿器勻漿，3500r/min離 心20min，取上清-70#保存；或水浴后-70#保存，用前勻漿，ELISA法檢測豚鼠肺組織P物 質(zhì)（SP)的含量（競爭法測抗體）；
[0050] 6、SYBR Green real-ti me PCR方法檢測，豚鼠肺組織NK1、VRlmRNA的相對表達 量 NKl 上游引物為 5-CTTCCTCCTGCCCTACATCAAC-3, 5-CTGCCCTGGGTCTGGAAATAC-3,產(chǎn)物大小 為 240bp ;VR1 上游引物為 5-TCAAAGACCCGGAAACAGGG-3,5-CTCTACCAGGAGGGTCACCA-3,產(chǎn)物 大小為224bp，GAPDH內(nèi)參照同前，除了先提取組織總RNA和無需標準品做標準曲線外，其余 操作方法大致與上文中病毒RNA的檢測方法相同，均按TaKaRa公司的試劑盒說明進行；結(jié) 果計算：采用GAPDH作為內(nèi)參照和2-Ct相對定量法來計算NKl、VRlmRNA的表達水平；
[0051] 7、免疫組化方法檢測豚鼠肺組織P物質(zhì)（SP)、VRl和PGP-9. 5蛋白的表達及免疫 組化結(jié)果圖像分析（半定量方法）免疫組化圖片用Leica顯微鏡觀察、拍照，進行蛋白表達 強度（灰度）的比較，根據(jù)以下染色深淺行半定量分析：〇=無染色；1 =輕度著色；2 =中 度著色；3 =強著色；4 =很強著色（幾乎呈黑色），每張片子至少隨機分析5個高倍視野， 所有片子均由2個不知情的專業(yè)人士分析；
[0052] 8、統(tǒng)計學處理采用SPSS160統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)％標準差（X % s) 或者中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，符合正態(tài)分布并且方差齊時多組間的總體檢驗采 用One-way ANOVA，組間比較采用ANOVA中的最小顯著差異法（LSD);不符合正態(tài)分布 或者方差不齊時各組間總體檢驗采用非參數(shù)經(jīng)驗Kruskal-W allis法，兩組間比較采用 Bonferroni的組間比較檢驗法；相關(guān)性檢驗采用Spear man直線相關(guān)分析法分析；結(jié)果豚 鼠咳嗽反射敏感性（CRS)測定結(jié)果圖2結(jié)果顯示，病毒感染組豚鼠對辣椒素刺激引起咳嗽 敏感，感染后6、12、28和42d組CRS均較正常對照組明顯升高（P < 0. 05)，感染后42d組較 對照組升高最為明顯（P < 〇· 01);
[0053] 肺組織病理學結(jié)果肺組織外觀無特殊，光鏡下主要是感染組在急性期可見一些氣 道炎癥表現(xiàn)，即氣道上皮的腫脹和少許脫落，腺體分泌增加，支氣管壁和肺實質(zhì)周圍炎癥細 胞浸潤，主要是巨噬和淋巴細胞的浸潤增加；而隨著感染后時間延長氣道炎癥逐漸恢復，未 見明顯肺實質(zhì)的炎癥表現(xiàn)（常規(guī)病理切片圖省略），
[0054] 副流感病毒型（PIV3)感染的病毒學檢測結(jié)果：
[0055] 副流感病毒型（PIV3)在LLC-MK2細胞中培養(yǎng)的CPE作用副流感病毒型（PIV3)引 起細胞病變的典型表現(xiàn)為，感染后2d左右細胞開始逐漸腫脹、變圓和聚集，最后4d?5c!左 右直至貼壁細胞破碎、壞死和脫落；
[0056] 直接免疫熒光技術(shù)檢測副流感病毒型（PIV3)病毒抗原結(jié)果，與對照組比，副流感 病毒型（PIV3)感染的LLC培養(yǎng)細胞可見廣泛的綠色陽性病毒核蛋白抗原的表達；而多數(shù)急 性感染期6和12d組豚鼠肺組織可見散在綠色的病毒核蛋白抗原的表達；
[0057] Real-ti me PCR方法檢測肺組織副流感病毒型（PIV3) RNA含量感染組豚鼠肺組 織副流感病毒型（PIV3) RNA含量在感染后第6d濃度最高，隨著感染后時間推移，病毒核酸 含量呈逐步降低趨勢，很低水平表達維持至感染后42d(與感染后6d比，分別P < 0. 05和 P < 0.01)，見圖 3 ;
[0058] 豚鼠肺組織勻漿SP含量的檢測結(jié)果與對照組相比，感染組豚鼠肺組織P物質(zhì) (SP)含量感染后6d起即有明顯升高并達到最高峰（P < 0.01)，此后直至感染后42d均 維持在高水平（P < 〇. 05)，見表1，5Real-ti m e PCR方法檢測豚鼠肺組織NKl和VRl的 mRNA相對表達量結(jié)果PI V3感染后豚鼠肺組織NKl的mRNA水平除了感染后6d組豚鼠因 為個體差異大而升高沒有統(tǒng)計學意義外，其它感染組其mRNA水平較對照組均有明顯升高 (P < 0. 05)，于感染后28d達到高峰（P < 0. 01)，到感染后42d仍維持高水平（P < 0. 01)， VRl的mRNA水平較對照組在感染后均明顯升高（P < 0. 05)，而在28和42d升高更為突出 (P < 0.01)，見表 1 ;
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法，其特征在于，該 辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法包括以下步驟： 選擇豚鼠50只，隨機分成正常對照組以及病毒感染6、12、28和42d組；通過滴鼻方法 接種副流感病毒，Buxco肺功能儀測定咳嗽反射敏感性； 免疫熒光和FQ-PCR方法檢測副流感病毒抗原和核酸，ELISA法檢測肺組織勻漿的P物 質(zhì)含量；FQ-PCR檢測肺組織P物質(zhì)受體NKl、辣椒素受體亞型1的mRNA水平；免疫組化方法 檢測肺組織P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物的表達及半定量分析； 并對P物質(zhì)、辣椒素受體亞型1和蛋白基因產(chǎn)物與咳嗽反射敏感性的相關(guān)性進行分析。
2. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，副流感病毒型的培養(yǎng)、傳代、凍存及定量，具體包括以下步驟： 第一步，細胞培養(yǎng)細胞株人恒河猴腎細胞，來源于ATCC，LLC細胞是對PI V3敏感的細 胞，用于毒株的傳代培養(yǎng)； 第二步，病毒的培養(yǎng)、傳代及凍存副流感病毒型來源于ATCC，LLC細胞在培養(yǎng)瓶中長至 70%?80%融合，取病毒懸液20(^接種于細胞上，每151^11搖動1次，吸附211后倒出病毒 液，加入2%胎牛血清的培養(yǎng)基，于第2d?3d開始出現(xiàn)細胞病變，待病變達50%?60%時 收獲病毒，將病毒反復凍融2次?3次后10000r/min4#離心20min，去除細胞碎片，收集上 清分裝后液氮中凍存； 第三步，空斑技術(shù)測定病毒感染滴度，使用常規(guī)空斑技術(shù)，培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基， 以空斑形成單位t PFU來表示病毒感染滴度。
3. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，該辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法具體包括以下 步驟： 第一步，實驗動物及分組，雄性純白SPF級豚鼠，體重250g?300g之間，隨機分成5組， 即正常對照組和4個病毒感染組，每組10只，病毒感染組按病毒感染后天數(shù)又分為6、12、28 和42d4個組； 第二步，動物飼養(yǎng)及病毒接種方法，動物在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，感染組動物單獨飼養(yǎng)， 在適應新的環(huán)境1周后開始接種病毒，病毒滴鼻，乙醚麻醉后，兩側(cè)鼻孔分別滴入75uL的擴 增凍存好的病毒液，病毒滴度為33 3 105pfu，接種當天同時進行空斑實驗再次鑒定接種病 毒的滴度，對照組豚鼠滴入病毒培養(yǎng)用培養(yǎng)基MEM ; 第三步，豚鼠咳嗽反射敏感性的測定，應用單腔非限制型小動物體描儀來測定豚鼠的 咳嗽反射敏感性，判斷咳嗽反射敏感性的指標主要是咳嗽總次數(shù)，單腔非限制型小動物體 描儀通過采集氣流變化信號，計算曲線下面積以及氣流半數(shù)峰值轉(zhuǎn)換時間，經(jīng)過模擬方程 換算后判斷是否為咳嗽動作，還是打噴嚏或者其它不規(guī)則的活動，而辣椒素激發(fā)溶液濃度 為50mol/L，總量為ImL,觀測記錄IOmin內(nèi)的CCnt。
4. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，豚鼠副流感病毒型感染的病毒學檢測，具體方法為 ： 第一步，直接免疫熒光法檢測副流感病毒型抗原，蘋果綠熒光視為陽性，副流感病毒型 是胞漿發(fā)熒光，可呈不規(guī)則的顆粒熒光； 第二步，SYBR Green熒光定量PCR方法檢測副流感病毒型RNA的含量，副流感病毒型上 游引物為 5-TTTGCCCTTGGACCGAC-3,5-AACCCTGCCCTTTGTGC-3,產(chǎn)物大小為 134bp ;GAPDH 作 為內(nèi)參照，上游引物5-TGGTGCCAAAAGGGTCA-3下游引物為5-CCTCCACAATGCCGAAGT-3，產(chǎn)物 大小為176bp，含有和待測樣品相同擴增片段的副流感病毒型病毒質(zhì)粒DNA標準品，病毒核 酸含量為28 3l〇15copies/L;首先提取肺組織病毒RNA，測定濃度和變形瓊脂糖凝膠電 泳鑒定質(zhì)量后，每組取Ig RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 20L反應體系，反轉(zhuǎn)錄 反應條件為：37#15min和85#5s，最后進行real-ti me PCR反應，兩步法PCR擴增標準程序 如下：預變性，95#30sl個循環(huán)；PCR反應，95#5s，60#30s，40個循環(huán)，結(jié)果計算：用已知濃度 的病毒標準品10倍稀釋，和未知樣品一起進行PCR反應，通過稀釋標準品得到的標準曲線 來確定未知樣品中的病毒拷貝數(shù)。
5. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，檢測豚鼠肺組織P物質(zhì)含量的肺組織勻漿液的制備及檢測方法，具有包括以 下步驟； 稱取IOOmg豚鼠肺組織，先加 lmol/L醋酸3mL，100#水浴IOmin以滅活內(nèi)源性激肽酶 活性，然后按比例加入一定量的PBS，用Iml?3mL玻璃勻漿器勻漿，3500r/min離心20min， 取上清-70#保存；或水浴后-70#保存，用前勻漿，ELISA法檢測豚鼠肺組織P物質(zhì)的含量。
6. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，SYBR Green real-ti me PCR方法檢測方法為： 豚鼠肺組織NKUVRlmRNA的相對表達量NKl上游引物為 5-CTTCCTCCTGCCCTACATCAAC-3,5-CTGCCCTGGGTCTGGAAATAC-3,產(chǎn)物大小為 240bp ;VR1 上 游引物為 5-TCAAAGACCCGGAAACAGGG-3, 5-CTCTACCAGGAGGGTCACCA-3,產(chǎn)物大小為 224bp， GAPDH內(nèi)參照同前，測定濃度和變形瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量后，每組取Ig RNA進行反轉(zhuǎn) 錄反應，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，20L反應體系，反轉(zhuǎn)錄反應條件為：37#15min和85#5s，最后進 行real-ti me PCR反應，兩步法PCR擴增標準程序如下：預變性，95#30sl個循環(huán)；PCR反 應，95#5s，60#30s，40個循環(huán)，結(jié)果計算：用已知濃度的病毒標準品10倍稀釋，和未知樣 品一起進行PCR反應，結(jié)果計算：采用GAPDH作為內(nèi)參照和2-Ct相對定量法來計算NK1、 VRlmRNA的表達水平。
7. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，免疫組化方法檢測豚鼠肺組織P物質(zhì)、VRl和PGP-9. 5蛋白的表達及免疫組化 結(jié)果圖像分析免疫組化圖片用Leica顯微鏡觀察、拍照，進行蛋白表達強度或灰度的比較， 根據(jù)以下染色深淺行半定量分析：〇=無染色；1 =輕度著色；2 =中度著色；3 =強著色；4 =很強著色，每張片子至少隨機分析5個高倍視野。
8. 如權(quán)利要求1所述的辣椒素受體亞型1的變化與咳嗽反射敏感性關(guān)系的試驗方法， 其特征在于，統(tǒng)計學處理采用SPSS160統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)％標準差或者中位 數(shù)表示，符合正態(tài)分布并且方差齊時多組間的總體檢驗采用One-way AN0VA，組間比較采用 ANOVA中的最小顯著差異法；不符合正態(tài)分布或者方差不齊時各組間總體檢驗采用非參數(shù) 經(jīng)驗Kruskal-W allis法，兩組間比較采用Bonferroni的組間比較檢驗法。
【文檔編號】G01N33/53GK104372105SQ201410058739
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】劉春麗, 董沛堅, 陳鳴宇 申請人:劉春麗