一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法。本發(fā)明所述微流控芯片包括偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球、異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體以及芯片盒，還可以包括梯度濃度的大腸桿菌菌懸液、磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液及磁鐵。本發(fā)明基于免疫磁珠技術(shù)對水中大腸桿菌進行了準確、簡便的含量檢測，檢測周期短，程序簡單易操作，能夠適應(yīng)污染源快速診斷的需要。
【專利說明】—種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌(Escherichia coli)是指示水體中糞便污染的最重要細菌學指標之一，相對于總大腸菌群和糞大腸菌群，大腸桿菌對糞便污染的指示作用最強。目前，世界各國及國際組織都將大腸桿菌作為重要環(huán)境衛(wèi)生學指標，并對其提出了嚴格的限制。世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)標準》(第二版)中規(guī)定，大腸桿菌在任意IOOmL用于飲用的水中不得檢出；現(xiàn)行美國飲用水水質(zhì)標準國家一級飲用水標準規(guī)定大腸桿菌的限值為OCFU/ml ;中華人民共和國國家標準《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定，大腸桿菌在每IOOmL水樣中不得檢出。
[0003]大腸桿菌(E.coli 0157:H7)是腸出血性大腸桿菌的一個主要菌型，此菌在世界范圍內(nèi)發(fā)生過多次暴發(fā)，并造成嚴重危害。它能引起人類出血性腹瀉，并發(fā)溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫瘢(TTP)等，老人和兒童并發(fā)HUS時病死率可高達50%。因此，做好水中E.coli 0157:H7的檢測具有重要的意義。
[0004]檢測大腸桿菌的傳統(tǒng)方法主要有多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法適用于各種樣品，但操作復雜，檢測時間較長，濾膜法主要用于檢測雜質(zhì)較少的水樣，操作比多管發(fā)酵法更為簡單，但是不適合檢測高濁度和其他復雜水樣。這兩種方法都具有檢測周期長，程序繁瑣的缺點，難以適應(yīng)污染源快速診斷的需要。目前，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展了一些新方法進行大腸桿菌的快速檢測，主要包括酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、免疫分析法、生物傳感器法等。
[0005]與傳統(tǒng)方法相比，這些方法雖然縮短了一定的檢測時間，但是仍然不能滿足快速檢測的需要，如申請?zhí)?01010284474.5的快速檢測大腸桿菌的方法及所用到的微流控芯片及其制備工藝。該方法基于電化學與電測量技術(shù)的電化學生物傳感技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)對樣品中的大腸桿菌(E.coli 0157:H7)進行了快速檢測，但是該技術(shù)在實際檢測中除熒光檢測裝置外還需要一些電極和電子設(shè)備，仍不能更方便的快速的檢測大腸桿菌(E.coli0157:H7)o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法，使得通過本發(fā)明所述微流控芯片能夠快捷、方便、準確檢測出水中大腸桿菌含量。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片，包括:
[0009]偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的大腸桿菌抗體以及芯片盒；
[0010]所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測反應(yīng)主通道以及和檢測反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口。
[0011]作為優(yōu)選，所述添加試劑的分通道為5個，呈放射狀與檢測反應(yīng)主通道相連接，示意圖見圖1。
[0012]作為優(yōu)選，所述芯片盒規(guī)格為10mmX5mmX2mm，所述檢測反應(yīng)主通道規(guī)格為8mmX 200 μ mX 40 μ m。
[0013]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述微流控芯片還包括:梯度濃度的大腸桿菌菌懸液、磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液及磁鐵。其中，所述磁鐵優(yōu)選為電磁鐵，可直接安裝到芯片盒上，通電時有磁性，斷電時無磁性。
[0014]作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球為偶聯(lián)有大腸桿菌兔抗的磁性微球，異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體為異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌鼠抗。
[0015]作為優(yōu)選，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH 為 7.2。
[0016]作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為E.coli 0157:H7。
[0017]作為優(yōu)選,所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度0.8mg/ml,所述異硫氰酸突光素標記的大腸桿菌抗體濃度50 μ g/mlo
[0018]此外，本發(fā)明還提供一種檢測水中大腸桿菌的方法，包括以下步驟:
[0019]步驟1、在芯片盒上設(shè)置磁鐵，所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測反應(yīng)主通道以及和檢測反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口 ；
[0020]步驟2、將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道，通過磁鐵將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球固定于微流控芯片主通道內(nèi)，然后將已知濃度的大腸桿菌菌懸液也通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道；
[0021]步驟3、488nm激發(fā)光照射檢測反應(yīng)主通道，檢測525nm熒光強度，獲得熒光強度值Fl ；
[0022]步驟4、將異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道，通過添加試劑的分通道泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個檢測反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強度穩(wěn)定，獲得熒光強度值F2，計算獲得檢測熒光強度值F=F2-F1 ；
[0023]步驟5、斷電消除磁鐵磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個檢測反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強度接近空白值；
[0024]步驟6、按照步驟1-步驟5的方法，用梯度濃度的大腸桿菌菌懸液分別獲得多個熒光強度值F，然后獲得不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對數(shù)值與對應(yīng)檢測熒光強度的標準曲線；
[0025]步驟7、將待測水樣按照步驟1-步驟5的方法獲得檢測熒光強度值，代入到步驟6得到的標準曲線中獲得水中大腸桿菌的濃度。
[0026]所述標準曲線可經(jīng)軟件計算得到計算方程，直接帶入計算。
[0027]本發(fā)明所述方法檢測原理為:
[0028]利用微流控芯片外部的磁鐵來固定偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球，接著捕獲大腸桿菌，然后再用異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體標記所捕獲的大腸桿菌，檢測其熒光強度，如此制作標準曲線以及檢測待測水樣熒光強度，獲得待測水樣的大腸桿菌含量，最后斷電消除磁鐵磁性，用洗滌液沖洗檢測反應(yīng)主通道，準備進行下一次檢測。
[0029]其中，作為優(yōu)選，所述添加試劑的分通道為5個，呈放射狀與檢測反應(yīng)主通道相連接，不意圖見圖1。
[0030]作為優(yōu)選，所述芯片盒規(guī)格為10mmX5mmX2mm，所述檢測反應(yīng)主通道規(guī)格為8mmX 200 u mX 40 U m。
[0031]作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球為偶聯(lián)有大腸桿菌兔抗的磁性微球，異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體為異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌鼠抗。
[0032]作為優(yōu)選，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH 為 7.2。
[0033]作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為E.coli 0157:H7。
[0034]作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度0.8mg/ml，所述異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體濃度50 V- g/mlo
[0035]取同一檢測水樣分別進行檢測，本發(fā)明檢測方法檢測結(jié)果為52cfu/ml，而傳統(tǒng)濾膜法檢測結(jié)果為52cfu/ml。兩者數(shù)據(jù)沒有明顯差異，表明本發(fā)明檢測方法準確度很高。
[0036]此外，經(jīng)過對比檢測，本發(fā)明方法最低檢出大腸桿菌濃度為5cfu/ml，檢測范圍為5至lX108cfu/ml，整體耗時為30min左右；而申請?zhí)?01010284474.5的方法最低檢出大腸桿菌濃度為6.4cfu/ml，線性范圍為6.4至I X 107cfu/ml，整體耗時大于80min。
[0037]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明基于免疫磁珠技術(shù)對水中大腸桿菌進行了準確、簡便的含量檢測，檢測周期短，程序簡單易操作，能夠適應(yīng)污染源快速診斷的需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1所示為本發(fā)明所述芯片盒結(jié)構(gòu)示意圖，其中A所示為添加試劑的分通道，B所示為檢測反應(yīng)主通道；
[0039]圖2所示為不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對數(shù)值與對應(yīng)檢測熒光強度的標準曲線，其中Ctl為大腸桿菌菌懸液的濃度。
【具體實施方式】
[0040]本發(fā)明公開了一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述產(chǎn)品和方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0041]以下就本發(fā)明所提供的一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法做進一步說明。
[0042]實施例1:大腸桿菌0157:H7菌懸液的制備
[0043]將經(jīng)多次挑單菌落純化的0157:H7菌種在LB瓊脂斜面上37°C培養(yǎng)20h，用0.5%福爾馬林無菌生理鹽水洗脫下來，9000r/min離心IOmin后棄上清液，再用無菌生理鹽水重復清洗兩次，然后制成濃度為I X IO7-1 X 108/ml菌懸液。然后放入100°c水浴中煮沸3h。取出待冷卻后放入冰箱冷減備用。
[0044]實施例2:偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球的制備
[0045]選取健康的新西蘭大耳兔，實施例1中滅活大腸桿菌菌懸液與弗氏不完全佐劑(1:1)乳化,于皮下注射免疫原,初次免疫劑量Iml/只，皮下分點注射；3次追加免疫劑量均為0.2ml/只，不加佐劑，最后一次免疫后8天頸動脈放血法采血分離血清。
[0046]采用正辛酸-飽和硫酸銨法提取兔抗大腸桿菌免疫血清IgG。兩步沉淀法:先加正辛酸去雜蛋白，后加硫酸銨使抗體沉淀。凝膠層析脫鹽后在進行超濾離心濃縮得到純化兔抗大腸桿菌兔抗作為捕獲抗體，并用280nm和260nm的吸收差法測定蛋白濃度。
[0047]配制0.llmol/L的磷酸緩沖液(PBS,pH=7.2)、0.5mol/L氨基己酸溶液及0.05wt%的吐溫混合液作為活化液。取200 μ L的活化液加入2mg的磁性微球，加入2mg的碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)，室溫混勻反應(yīng)15min。重復3次。
[0048]配制0.05mol/L磷酸緩沖液和0.05%吐溫的混合液(pH=7.2)作為洗滌液。用200 μ L的洗滌液洗滌已活化的磁球I次。加入兔抗大腸桿菌抗體，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2h。
[0049]洗滌已偶聯(lián)的磁球3次。加入200 μ L含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.3%甘氨酸(Gly)的包被液，室溫反應(yīng)45min。洗滌已包被的磁球3次。加入200 μ L含有2%BSA的封閉液，放入4°C冰箱保存待用。
[0050]實施例3:異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體的制備
[0051]選取健康豚鼠，實施例1中滅活大腸桿菌菌懸液與弗氏不完全佐劑(1:1)乳化，初次免疫注射加入完全佐劑(1:1)，第2次加入不完全佐劑(1:1)。豚鼠抗原免疫I?3次均注射于四肢大腿內(nèi)側(cè)皮下淋巴結(jié)，均采用多點注射法。第4、5、6次注射加強，進行腹腔注射。于次日注射后第7天抽血，用特異性抗原測定效價，心臟放血，分離純化抗體作為檢測抗體進行下一步FITC標記。
[0052]取大腸桿菌鼠抗的適量體積溶液，蛋白總量為lmg，用pH9.0的碳酸鹽緩沖液對抗體溶液進行透析，使蛋白處于堿性環(huán)境中。用FITC對該抗體進行標記。其中FITC與蛋白質(zhì)含量比值為1:10，向反應(yīng)體系中逐滴滴入溶于二甲基亞砜的FITC，按照反應(yīng)條件為4°C、2h，20°C、4h，37°C、30min，避光反應(yīng)進行FITC標記。反應(yīng)完成后用超濾離心管9000r/min離心反應(yīng)液lOmin，重復該操作，每次收集離出液，測定熒光值(F488/525)，直至離出液無熒光值。測定標記后檢測抗體的F488/525值。
[0053]實施例4:本發(fā)明所述微流控芯片
[0054]梯度濃度的大腸桿菌0157:H7菌懸液(濃度C0: 10U02U03U0\IO5UO6UO7UO8,109cfu/ml)、濃度為50 μ g/ml異硫氰酸突光素標記的大腸桿菌鼠抗、0.8mg/ml偶聯(lián)有大腸桿菌兔抗的磁性微球、0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成的洗滌液(ρΗ7.2)、磁鐵、芯片盒；
[0055]所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測反應(yīng)主通道以及和檢測反應(yīng)主通道相連接成放射狀分布的5個添加試劑的分通道，所述檢測反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口，示意圖見圖1。
[0056]實施例5:本發(fā)明所述方法
[0057]采用實施例4中的微流控芯片。[0058]在芯片盒上設(shè)置磁鐵，將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道，通過磁鐵將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球固定于微流控芯片主通道內(nèi)，然后將已知濃度的大腸桿菌菌懸液也通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道；
[0059]488nm激發(fā)光照射檢測反應(yīng)主通道，檢測525nm熒光強度，獲得熒光強度值Fl ；
[0060]將異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道，通過添加試劑的分通道泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個檢測反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強度穩(wěn)定，獲得熒光強度值F2，計算獲得檢測熒光強度值F=F2-F1 ；
[0061]斷電消除磁鐵磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個檢測反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強度接近空白值；
[0062]按照前述獲得檢測熒光強度值F的方法，用梯度濃度的大腸桿菌菌懸液分別獲得多個熒光強度值F，然后獲得不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對數(shù)值與對應(yīng)檢測熒光強度的標準曲線(見圖2);
[0063]將待測水樣按照步驟1-步驟5的方法獲得檢測熒光強度值，代入到標準曲線中獲得水中大腸桿菌的濃度。
[0064]實施例6:待測水樣中大腸桿菌含量的檢測
[0065]檢測方法:實施例5檢測方法以及本領(lǐng)域傳統(tǒng)的濾膜法
[0066]取同一檢測水樣分別進行檢測，本發(fā)明檢測方法檢測結(jié)果為52cfu/ml，而傳統(tǒng)濾膜法檢測結(jié)果為52cfu/ml。兩者數(shù)據(jù)沒有明顯差異，表明本發(fā)明檢測方法準確度很高。
[0067]此外，經(jīng)過對比檢測，本發(fā)明方法最低檢出大腸桿菌濃度為5cfu/ml，檢測范圍為5至lX108cfu/ml，整體耗時為30min左右；而申請?zhí)?01010284474.5的方法最低檢出大腸桿菌濃度為6.4cfu/ml，線性范圍為6.4至I X 107cfu/ml，整體耗時大于80min。
[0068]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測水中大腸桿菌的微流控芯片，其特征在于，包括: 偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球、異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體以及芯片盒； 所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測反應(yīng)主通道以及和檢測反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于，還包括: 梯度濃度的大腸桿菌菌懸液、磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液及磁鐵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述微流控芯片，其特征在于，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH為7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli0157:H7o
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述微流控芯片，其特征在于，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度0.8mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述微流控芯片，其特征在于，所述異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體濃度50 μ g/mlo
7.—種檢測水中大腸桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、在芯片盒上設(shè)置磁鐵，所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測反應(yīng)主通道以及和檢測反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口； 步驟2、將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道，通過磁鐵將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球固定于微流控芯片主通道內(nèi)，然后將已知濃度的大腸桿菌菌懸液也通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道； 步驟3、488nm激發(fā)光照射檢測反應(yīng)主通道，檢測525nm熒光強度，獲得熒光強度值Fl ； 步驟4、將異硫氰酸熒光素標記的大腸桿菌抗體通過添加試劑的分通道泵入到檢測反應(yīng)主通道，通過添加試劑的分通道泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個檢測反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強度穩(wěn)定，獲得熒光強度值F2，計算獲得檢測熒光強度值F=F2-F1 ； 步驟5、斷電消除磁鐵磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個檢測反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強度接近空白值； 步驟6、按照步驟1-步驟5的方法，用梯度濃度的大腸桿菌菌懸液分別獲得多個熒光強度值F，然后獲得不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對數(shù)值與對應(yīng)檢測熒光強度的標準曲線.步驟7、將待測水樣按照步驟1-步驟5的方法獲得檢測熒光強度值，代入到步驟6得到的標準曲線中獲得水中大腸桿菌的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH為7.2。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli0157:H7o
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度.0.8mg/ml,所述異硫氰酸突光素標記的大腸桿菌抗體濃度50 μ g/mlo
【文檔編號】G01N21/64GK103777013SQ201410069183
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】單旭亮, 毛芳芳, 崔海松 申請人:杭州綠潔水務(wù)科技有限公司