一種采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法，其特征在于使用了電噴霧檢測器(CAD)流動相補償技術，包括以下步驟：(1)優(yōu)化液相色譜條件基線分離人參提取物中的主要化學成分；(2)采用液質聯(lián)用技術(LC-MS)輔助確認人參皂苷目標峰的位置；(3)人參提取物中單個代表性人參皂苷的含量測定；(4)采用電噴霧檢測器(CAD)流動相補償技術一測多評人參提取物中多個或總人參皂苷的含量。本發(fā)明無需校正因子，可實現(xiàn)一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷的含量，方法簡便、可行性好。
【專利說明】一種采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥和化學【技術領域】，具體地涉及一種基于電噴霧檢測器柱后流動相補償法測定人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法。
【背景技術】
[0002]基于中藥有效成分的復雜多變，多個或總結構類似物含量測定成為中藥質量有效的控制模式。但中藥化學對照品貨源緊缺阻礙了這一模式的發(fā)展。通過測定一個易得對照品的含量實現(xiàn)對多個或總結構類似物的含量分析是解決上述問題的可行策略(一測多評)。
[0003]目前，公開報道的利用一測多評法測定人參提取物中多個人參皂苷含量的方法，主要采用陣列管檢測器(DAD)，選定一個容易獲得的單體人參皂苷標準品作為內參，然后在校正因子的幫助下同時測定多個人參皂苷的含量(Gao XY, Jiang Y，Lu JQ, et al.JChromatogr A，2009，1216(11):2118-2123 ；Zhu JJ,Wang ZM,Kuang YH,et al.Yao Xue XueBao, 2008,43 (12):1211-1216.)。然而，這個方法也存在諸多問題。比如:在一測多評法建立的過程中，所有能引起檢測器響應值變化的因素均有可能引起相對校正因子的波動。不同實驗室、不同型號的高效液相色譜儀、檢測器燈的工作狀態(tài)、不同色譜柱以及流動相的組成比例、pH值、柱溫、流速、檢測波長等微小改變均會引起相對校正因子的改變，在實測值與計算值之間引入誤差。面對上述問題，尋求一種不需要校正因子即可實現(xiàn)一測多評或一測總評的分析方法，是廣大分析工作者面臨的共同任務和難題。

【發(fā)明內容】

[0004]發(fā)明目的:為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種采用電噴霧檢測器(CAD)流動相補償技術，實現(xiàn)無需校正因子也可采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是根據電噴霧檢測器(CAD)流動相補償技術，提供一種無需校正因子也可采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法。
[0006]技術方案:本發(fā)明的目的是通過如下方案實現(xiàn)的:
[0007](I)優(yōu)化液相色譜條件基線分離人參提取物中的主要化學成分；(2)采用液質聯(lián)用技術(LC-MS)輔助確認人參皂苷目標峰的位置；(3)人參提取物中單個代表性人參皂苷的含量測定；(4)采用電噴霧檢測器(CAD)流動相補償技術一測多評人參提取物中多個或總人參皂苷的含量。具體步驟如下:
[0008]①液相色譜分離條件:C18反相色譜柱(150mmX2.Imm;粒徑，2.2μπι);柱溫(30 0C );流動相(溶劑A為0.2%甲酸；溶劑B為乙腈)；進樣體積(2yL);梯度洗脫程序(0-25min，18 % B ;25_30min，18-23 % B ;30_65min，23-38 % B ;65_75min，38-58 % B ；75-83min, 58-78% B ；83-90min, 78% B)。[0009]②LC-MS參數(shù):電噴霧電離源(ESI)，噴霧電壓(4.0kV)，鞘氣壓力(35psi)，輔助氣體壓力(15psi)，毛細管溫度(350°C)，碰撞電壓(1.5psi)，負離子檢測模式(掃描范圍m / ZlOO?1，600)。對人參皂苷目標峰的指認基于3點，一是高分辨質譜提供準確的m /z值，二是和標準品比對，三是在沒有標準品的情況下，基于文獻報道的人參皂苷色譜保留行為，進行輔助推測。
[0010]③基于LC-CAD色譜系統(tǒng)，采用外標一點法對人參提取物中人參皂苷Rgl、Re以及Rd進行含量測定。
[0011]④選取人參二醇(pro)、人參三醇(PPT)以及8個人參皂苷單體成分(Rgl、Re、Rhl、Rbl、Fl、Rd、化合物CK和Rh2)，分別在沒有流動相補償和有流動相補償?shù)那闆r下，通過計算相對標準偏差(RSD)，比較它們在相同濃度下CAD的響應情況。RSD〈5%可說明檢測器對相同質量的不同分析物具有一致的響應。
[0012]⑤方法學驗證:柱后流動相補償下的CAD對相同質量的不同分析物有一致的響應，因此目標分析物在提取物中的含量可通過以下公式計算得出(一測多評):目標分析物含量=內參標準含量X(目標分析物峰面積/內參標準峰面積)。比較采用外標一點法和CAD柱后流動相補償技術下的一測多評法計算得出的目標分析物含量，計算RSD，RSD<5%可說明方法學可靠。進一步，內參標準和目標分析物為人參皂苷Rgl、Re以及Rd。
[0013]⑥采用CAD柱后流動相補償技術下的一測多評法測定人參提取物中多個人參皂苷的含量，或者測定人參提取物中所有人參皂苷的含量，求和得出總人參皂苷的含量。
[0014]有益效果:
[0015]本方法無需校正因子也可采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷的含量，很好地解決了校正因子的波動引入的檢測誤差。且在沒有中藥化學對照品的情況下也可以采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷的含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是人參皂苷的化學結構圖和m / z值。人參皂苷單體的排序(I?18)反應了它們在反相色譜上出峰的先后次序。
[0017]圖2是柱后流動相補償示意圖。
[0018]圖3是人參粗提取物代表性Ultra-HPLC-CAD色譜圖。峰I=Rgl，峰2=Re，峰3=Rf，峰 4=F3,峰 5 = Rhl 和 Rg2,峰 66=Rbl,峰 7 和峰 8=Rc、Rb2 或 Rb3,峰 9=Rd,峰 10=未知，峰11=F2和/或Rg3,峰12和峰13=非人參皂苷。
[0019]圖4是人參粗提取物的總離子色譜圖。峰I(Peakl)=Rgl,峰2 (Peak2) =Re，峰 3 (Peak3) =Rf,峰 4(Peak4)=F3,峰 5 (Peak5) =Rhl 和 Rg2,峰 6 (Peak6) =Rbl,峰 7 和峰8 (Peak7、8) =Rc,Rb2 或 Rb3,峰 9 (Peak9) =Rd，峰 10 (PeaklO)=未知，峰 11 (Peakll) =F2 和 /或Rg3,峰12和峰13 (Peakl2、13)=非人參皂苷。
[0020]圖5是人參粗提取物中目標峰提取的離子色譜圖(峰I?7)。
[0021]圖6是人參粗提取物中目標峰提取的離子色譜圖(峰8?13)。
[0022]圖7是無流動相補償下相同濃度的人參皂苷單體Ultra-HPLC-CAD分離色譜圖。
[0023]圖8是流動相補償下相同濃度的人參皂苷單體Ultra-HPLC-CAD分離色譜圖。
[0024]圖9是人參高純提取物代表性Ultra-HPLC-CAD色譜圖。峰I=Rgl,峰2=Re，峰3=Rf，峰 4=F3,峰 5=Rhl 和 Rg2,峰 66=Rbl，峰 7 和峰 8=Rc、Rb2 或 Rb3,峰 9=Rd，峰 10=未知，峰11=F2和/或Rg3,峰12和峰13=非人參皂苷。
[0025]圖10是人參高純提取物的總離子色譜圖。峰I (Peakl)=Rgl,峰2 (Peak2) =Re，峰 3 (Peak3) =Rf,峰 4(Peak4)=F3,峰 5 (Peak5) =Rhl 和 Rg2,峰 6 (Peak6) =Rbl,峰 7 和峰8 (Peak7、8) =Rc,Rb2 或 Rb3,峰 9 (Peak9) =Rd，峰 10 (PeaklO)=未知，峰 11 (Peakll) =F2 和 /或Rg3,峰12和峰13 (Peakl2、13)=非人參皂苷。
[0026]圖11是人參高純提取物中目標峰提取的離子色譜圖(峰6?8)。人參高純提取物中峰1、2、3、4、5、9、10、11、12和13提取的離子色譜圖與人參粗提取物中相對應峰的離子
色譜圖一致。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例和附圖對本發(fā)明進行進一步說明。
[0028]本發(fā)明的儀器和試劑、材料
[0029]Thermo Scientific Dionex Ultimate3000UHPLC+FocusedX 2 雙梯度系統(tǒng)(包括一個3000RS泵，一個3000RS自動進樣器，一個3000RS柱溫箱和一個Corona Ultra RS CAD檢測器)，PerkinElmer Flexar SQ300MS 系統(tǒng)，Mill1-Q 純水系統(tǒng)。
[0030]人參皂苷Rgl，Re, Rhl，Rbl，F(xiàn)l, Rd, Rh2, PPT，PPD, and 化合物 K(CK)標準品(中國藥品食品監(jiān)督局)，10個化合物的化學結構和標準rn / Z值見圖1。乙腈和甲酸(HPLC級，F(xiàn)isher)，鹽酸、氫氧化鈉和乙醇(分析級，南京化學試劑公司)，D201陰離子交換樹脂(聚苯乙烯骨架鍵合-N+(CH3)3功能團)，D113陽離子交換樹脂(聚甲基丙烯酸酯骨架鍵合-COOH功能團)，DlOl大孔吸附樹脂(邢臺民生樹脂科技有限公司)，人參飲片(同仁堂)。
[0031]樹脂預處理:樹脂用乙醇浸泡48h后裝柱，繼續(xù)用乙醇沖洗至加3倍水到洗脫液中無渾濁產生。然后，用純水將乙醇洗凈，待用。D201樹脂進一步用IN鹽酸、水、IN氫氧化鈉和水分別洗脫后，待用。D113樹脂進一步用IN氫氧化鈉、水、IN鹽水和水分別洗脫后，待用。
[0032]人參水煎液:150g干燥的人參飲片分別用1.2L純水煎煮3次后,合并水煎液,過濾后濃縮至相對密度1.06g/mL，儲存于4°C冰箱內，待用。
[0033]柱后流動相補償技術:柱后流動相補償采用同規(guī)格色譜柱方案，兩根規(guī)格一致的色譜柱分別與兩個泵相連，流動相分別通過兩個泵，流經兩根色譜柱，最后經三通混合器混合，進入CAD檢測器(圖2)。經過補償，最終進入CAD檢測器的是固定組成的流動相(50%乙腈)。
[0034]實施例1
[0035]電噴霧檢測器柱后流動相補償法檢測人參粗提取物中多個人參皂苷的含量，包括以下步驟:
[0036]人參粗提物的制備:人參水煎液以50mL / h的速度流經50g DlOl樹脂填充的層析柱(20mmX300mm)，飽和吸附后，10倍柱體積的純水沖洗柱子以洗去水溶性雜質。然后，用5倍柱體積的60%乙醇以60mL / h的速度洗脫柱子，收集洗脫液，60°C真空干燥，得人參粗提取物(3.716g)。[0037]液相色譜分離條件:C18反相色譜柱(150mmX 2.1mm ；粒徑,2.2 μ m);柱溫(300C );流動相(溶劑A為0.2%甲酸;溶劑B為乙腈);進樣體積(2 μ L);流速(0.4mL /min);梯度洗脫程序(0-25min，18 % B ；25-30min, 18-23 % B ;30_65min，23-38 % B ；65-75min, 38-58% B ；75-83min, 58-78% B ；83-90min, 78 % B)。人參粗提取物用甲醇溶解后(IOmg / mL),進樣2 μ L,色譜分離效果見圖3。
[0038]LC-MS分析:電噴霧電離源(ESI)，噴霧電壓(4.0kV)，鞘氣壓力(35psi)，輔助氣體壓力(15psi)，毛細管溫度(350°C)，碰撞電壓(1.5psi)，負離子檢測模式(掃描范圍m / ZlOO~1，600)。人參粗提取物的總離子色譜圖見圖4，目標峰提取的離子色譜圖見圖5和圖6。圖3中，峰I和峰3m / z值分別為845.4837和845.4839的離子可表示成[800.4922+COOHr。在已知的人參皂苷中，Rgl和Rf的m / z值為800.4922。由于峰I的保留時間和標準品Rgl的保留時間一致，因此峰I是Rgl，而峰3可能是Rf。峰2和峰9m / z值分別為991.5406和991.5430的離子可表示成[946.5501+(Χ)0Η。在已知的人參皂苷中，Re和Rd的m / ζ值為946.5501。此外，峰2和峰9的保留時間和標準品Re和Rd的保留時間一致，因此峰2是Re，而峰9是Rd。峰4m / ζ值為815.4741，可表示成[770.4816+C00H]-。在已知的人參皂苷中，F(xiàn)3的m / ζ值為770.4816，進一步根據文獻報道的F3反相色譜保留行為，可推測峰4為F3.[0039]峰5中m / ζ值為683.4323，可表示成[638.4394+ΟΧ)Η，在已知的人參皂苷中，Rhl和Fl的m / ζ值為638.4394。峰5和峰11中m / ζ值分別為829.4898和829.4895可表示成[784.4973+C00H]-。在已知的人參皂苷中，Rg2、F2和Rg3的m / ζ值均為784.4973。標準品比對顯示:F1對照品的保留時間與峰5不一致，而Rhl標準品與峰5的保留時間一致。與此同時，Rg2的反相色譜保留行為與Rhl比較接近。因此，峰5中存在Rhl和Rg2。同理，峰11中可能有F2和/或Rg3.
[0040]峰6 中 m / ζ 值 1153.5926 和 599.2952 可分別表示成[1108.2069+C00H]-和[1108.2069+C00H+C00H]2。在已知的人參皂苷中，Rbl 的 m / ζ 值為 1108.2069。此外，Rbl標品的保留時間和峰6 —致。不過，峰6中m / ζ值391.2604和148.9533也說明峰6中存在其它非人參皂苷類成分。峰7和峰8中m / ζ值為1123.5808和1123.5826可表示成[1078.5924+COOHr。在已知的人參皂苷中，Re、Rb2和Rb3的m / ζ值均為1078.5924，暗示峰7和峰8中含有這些人參皂苷。對于峰10，我們未能找到與之相對應的人參皂苷。由于人參皂苷的m / ζ值最低不能小于460，因此峰12和峰13中不存在人參皂苷。
[0041]人參粗提物中Rgl、Re和Rd的含量測定:基于UPLC-CAD色譜系統(tǒng)，采用外標一點法對人參粗提取物中Rgl、Re和Rd的含量進行測定。標準曲線顯示:Rgl在0.138mg /mL ~2.260mg / mL 區(qū)間，Re 在 0.165mg/mL ~2.674mg/mL 區(qū)間，以及 Rd 在 0.117mg /mL~2.06mg/mL區(qū)間呈現(xiàn)較好的線性。標準曲線分別為:y=6.2749x(R2=0.9981, n=5)，y=6.2324x (R2=0.9988, n=5)，以及 y = 7.843Ix (R2=0.9999, n=5)。公式中 y 代表峰面積，x代表濃度。日內和日間精密度分別在0.1%~0.5%和0.5%~I %范圍之內。開發(fā)的方法應用于人參粗提取物中Rgl、Re以及Rd的含量測定,結果如下表顯示(n=3):
[0042]
【權利要求】
1.一種采用一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法，其特征在于使用了電噴霧檢測器流動相補償技術，無需校正因子，包括以下步驟:(1)液相色譜基線分離人參提取物中的主要化學成分；(2)采用液質聯(lián)用技術輔助確認人參皂苷目標峰的位置；(3)人參提取物中單個代表性人參皂苷的含量測定；(4)采用電噴霧檢測器流動相補償技術一測多評人參提取物中多個或總人參皂苷的含量。
2.根據權利要求1中所述的一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法，其特征在于所述的液相色譜中采用C18反相色譜柱，其規(guī)格為150mmX2.1mm ;粒徑，2.2 μ m0
3.根據權利要求1中所述的一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法，其特征在于所述的液相色譜條件為:柱溫30°C ;流動相溶劑A為0.2%甲酸，溶劑B為乙腈；進樣體積 2 μ L ;梯度洗脫程序為:0-25min, 18% B ；25-30min, 18-23% B ;30_65min，23-38% B ；65-75min, 38-58% B ；75-83min, 58-78% B ；83-90min, 78% B。
4.根據權利要求1中所述的一測多評檢測人參提取物中多個或總人參皂苷含量的方法，其特征在于所述的分析樣品為人參提取物，并可擴展成人參飲片、人參提取液和人參制品O
【文檔編號】G01N30/02GK103776937SQ201410075766
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權日:2014年3月4日
【發(fā)明者】趙玉男, 王中立, 戴建國, 陳琳, 黃玉芳 申請人:南京中醫(yī)藥大學