羊駝TGF-β1-3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種羊駝TGF-β1-3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其構(gòu)建和應(yīng)用，所述報(bào)告基因載體是將SEQ?ID?No.3所示的核苷酸序列插入到載體pmirGLODual-LuciferasemiRNATargetExpression的SacI和XbaI位點(diǎn)之間構(gòu)建而成，用于檢測(cè)miR663對(duì)TGF-β1基因的調(diào)控作用，為后續(xù)在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上研究miR-663對(duì)候選靶基因TGF-β1生物學(xué)功能的驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，也可以對(duì)靶基因是TGF-β1的microRNA的功能進(jìn)行研究。
【專利說(shuō)明】羊駝TGF-β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于羊駝TGF-β I基因的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，以及該載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β , TGF-β )是細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)蛋白之一，在細(xì)胞外基質(zhì)形成、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及腫瘤發(fā)生等過(guò)程中起重要作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在TGF-β 1、TGF-0 2和TGF-0 3三種亞型，其中以TGF-β I含量最高，幾乎參與了所有的病理和生理過(guò)程。TGF-β I在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和抑制上皮角朊細(xì)胞的生長(zhǎng)等方面也起著重要的作用。
[0003]MicroRNA (即miRNA)是由18-25個(gè)核苷酸組成的一類內(nèi)源性、短序列非編碼單鏈RNA,它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不翻譯蛋白質(zhì)，通過(guò)和mRNA 3’ UTR區(qū)結(jié)合來(lái)調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。miRNA主要是通過(guò)5’端被稱為種子序列(Seed Sequence)的7nt序列與位于革EmRNA 3’UTR的miRNA調(diào)控兀件(miRNA Regulatory Element, MRE)相互作用以識(shí)別革E mRNA。作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小分子RNA，在動(dòng)物中主要通過(guò)與靶mRNA的3’ UTR區(qū)特異性互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA翻譯或引起靶mRNA的降解，從而參與調(diào)控細(xì)胞分化、組織發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生命過(guò)程。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的一種方式，在生物體內(nèi)形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由于miRNA調(diào)控涉及的方便廣，調(diào)控控作用明顯，本身序列短，便于操作和研究，越來(lái)越受到人們對(duì)其生物學(xué)功能研究的重視。
[0004]miR-663在細(xì)胞的凋亡、免疫及腫瘤抑制中發(fā)揮著重要的作用，比如miR-663的甲基化與胃癌和乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。而TGF-β I是生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的miR-663的靶基因
之一 O

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種羊駝TGF- β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供該羊駝TGF-β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)克隆并且構(gòu)建了羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，本發(fā)明所述的羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體包含有雙熒光素酶報(bào)告基因載體，以及SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊駝TGF-β I基因的3’UTR區(qū)。
[0009] 其中，優(yōu)選的雙熒光素酶報(bào)告基因載體為pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression,由美國(guó) Promega 公司提供。[0010]具體而言，本發(fā)明的羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體是通過(guò)下述方法構(gòu)建而成的。
[0011]根據(jù)生物信息學(xué)軟件Targetscan (http://www.targetscan.0rg/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.un1-bielefeld.de/rnahybrid/)和 RNA22 (http://cbcsrv.watson.1bm.com/rna22.html),在線預(yù)測(cè) miR-663 與 TGF-β 1-3’UTR 可能的相互結(jié)合的革巴位點(diǎn)。
[0012]通過(guò)對(duì)GenBank中登錄的人、小鼠、牛等哺乳動(dòng)物的TGF-β 1基因序列進(jìn)行同源性比較，選擇保守性高的編碼區(qū)，以?；蛐蛄?登錄號(hào):ΝΜ_001166068)為模板，用primer5軟件設(shè)計(jì)羊駝TGF-β I基因編碼區(qū)引物，并在上游引物中加入酶切位點(diǎn)I的序列，下游引物中加入酶切位點(diǎn)油a I的序列，設(shè)計(jì)出如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的特異的TGF-β 1-3’UTR 引物。
[0013]TGF-β 1-3’ UTR-5ac 1-PF:5’ CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3’。
[0014]TGF-β 1-3’ VTR-1ba 1-PR:5’ GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3’。
[0015]以TRizol法提取羊駝黑色素細(xì)胞總RNA，用上述特異TGF-β 1_3’UTR引物擴(kuò)增，得到具有SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的TGF- β 1_3’ UTR基因片段，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)得到的TGF-β 1-3’ UTR片段進(jìn)行回收。
[0016]用Sac I和油al限制性內(nèi)切酶酶切回收的TGF-β 1_3’ UTR片段，fee I和油al限制性內(nèi)切酶酶切 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression 載體，將擴(kuò)增獲得的羊駝TGF- β 1-3’ UTR基因片段插入雙熒光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression的fee I和油a I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，經(jīng)酶切驗(yàn)證和測(cè)序鑒定后，命名為pmirGLO-TGF-β 1-3' UTR0
[0017]本發(fā)明構(gòu)建的羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體可用于檢測(cè)miR663對(duì)TGF-β I基因的調(diào)控作用，具體的，可用于在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上研究miR-663對(duì)候選靶基因TGF-β I的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制。
[0018]以本發(fā)明構(gòu)建的pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR質(zhì)粒載體進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，證明miR-663能夠直接靶向TGF-β I基因的3’UTR，并對(duì)該基因起到負(fù)調(diào)控作用。
[0019]進(jìn)而，本發(fā)明構(gòu)建的羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體還可用于其他靶基因是TGF-β I的microRNA的功能研究。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為羊駝黑色素細(xì)胞RNA的電泳圖。
[0021]圖2為PCR擴(kuò)增羊駝TGF-β 1-3’ UTR基因的電泳圖。
[0022]圖3為PCR檢測(cè)pmirGLO-TGF-β 1-3’UTR質(zhì)粒載體的電泳圖(a)及雙酶切檢測(cè)pmirGLO-TGF- β 1-3’ UTR質(zhì)粒載體的電泳圖(b)。
[0023]圖4為pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0025]實(shí)施例1:羊駝TGF- β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建。[0026]一、材料。
[0027]1、質(zhì)粒。
[0028]pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression載體(簡(jiǎn)寫(xiě)為pmirGLO),購(gòu)自美國(guó)Promega公司。
[0029]2、試劑。
[0030]Trizol Reagent (Invitogen,美國(guó))，PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒(TaKaRa，中國(guó))，DNA Marker,LA Taq DNA聚合酶、普通DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及純化、回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，DNA限制性內(nèi)切酶fee I,Xbal (NEB，英國(guó))。PCR引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0031]二、試驗(yàn)方法。
[0032]1、引物設(shè)計(jì)。
[0033]通過(guò)對(duì)GenBank中登錄的人、小鼠、牛等哺乳動(dòng)物的TGF-β I基因序列進(jìn)行同源性比較，選擇保守性高的編碼區(qū)，以牛基因序列(GenBank登錄號(hào):ΝΜ_001166068)為模板，用primerf軟件設(shè)計(jì)羊駝TGF-β I基因編碼區(qū)引物，再根據(jù)測(cè)序得到的羊駝TGF-β I基因序列設(shè)計(jì)特異的TGF-β 1-3’UTR引物，并在上游引物中加入酶切位點(diǎn)fee I的序列，下游引物中加入酶切位點(diǎn)油al的序列，設(shè)計(jì)出如下的特異的TGF-β 1-3’ UTR引物。
[0034]TGF-β 1-3’ MTR-Sac 1-PF:5’ CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3’。
[0035]TGF-β 1-3’ VTR-1ba 1-PR:5’ GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3’。
[0036]2、羊駝TGF-β 1-3’UTR基因的克隆。
[0037]用Trizol法提取羊駝皮膚組織中的總RNA(圖1)，并以核酸蛋白檢測(cè)儀(NanodropND-1000，Thermo)和電泳鑒定其濃度和質(zhì)量。
[0038]按PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成 cDNA 第一鏈，并以此為模板，用引物 TGF- β 1-3’ MW-Sac 1-PF 和 TGF- β 1-3’ UTR-J^a 1-PR 擴(kuò)增TGF-β I中間片段。
[0039]PCR 反應(yīng)體系 50μ L:cDNA I μ L，IOXLA PCR 緩沖液 5 μ L，2.5mmol.L-1 dNTPs5 μ L, IOymol.L 的上下游引物各 5 μ L，LA 酶(5U.μ L-1) 0.5 μ L, ddH20 28.5 μ L0擴(kuò)增條件如下:94°C 2min ；94°C 30s, 58°C 30s,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0040]PCR反應(yīng)結(jié)束后,取2 μ L反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物,然后送華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證， 得到153bp的羊駝TGF-β I基因序列(圖2)。
[0041]3、pmirGLO-TGF-β 1-3’UTR 載體的構(gòu)建。
[0042]用Sac I和油al限制性內(nèi)切酶酶切回收的TGF-β 1_3’ UTR片段，fee I和油al限制性內(nèi)切酶酶切pmirGLO載體。將TGF-β 1-3’UTR的酶切產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，pmirGLO載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收大片段。
[0043]回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。在含有Amp的LB平板上挑選陽(yáng)性單克隆，采用TGF-β 1_3’ UTR擴(kuò)增引物進(jìn)行質(zhì)粒PCR，歷./?(! III和I雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證后，命名為pmirGLO-TGF-β 1_3’ UTR，其核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示。圖4為構(gòu)建的pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。
[0044]實(shí)施例2:pmirGL0-TGF- β 1-3’ UTR轉(zhuǎn)染細(xì)胞和雙熒光素酶活性檢測(cè)。
[0045]1、材料。[0046]健康293T 細(xì)胞，置于液氮內(nèi)，-80°C冰箱凍存。TrizoI Reagent、Lipf ectamine2000(Invitogen,美國(guó))，Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega,美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq DNA聚合酶、T4連接酶及純化、膠回收試劑盒(TaKaRa，中國(guó))，TiplOO質(zhì)粒中提試劑盒(QIAGEN，德國(guó))。PCR引物及其它藥品、試劑由生工生物工程(上海)有限公司合成或購(gòu)自該公司的BBI系列產(chǎn)品。
[0047]2、方法。
[0048]將凍存的293T細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37°C水浴中并輕輕搖動(dòng)，使其內(nèi)容物盡快融化，吸出細(xì)胞懸液，離心后棄上清，再用培養(yǎng)基重復(fù)洗一遍。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至適當(dāng)?shù)臐舛?，接種，放入5% CO2培養(yǎng)箱，37°C靜置培養(yǎng)細(xì)胞至融合率為70%左右。
[0049]用試劑盒得到去內(nèi)毒素的pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體。
[0050]瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按Lipfectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組合:I)轉(zhuǎn)入pmirGLO載體、2)轉(zhuǎn)入 pmirGLO-TGF- β 1-3’ UTR 載體、3)轉(zhuǎn)入 pmirGLO-TGF- β 1-3’ UTR 載體和Pre-miR663。置于 5% CO2 培養(yǎng)箱，37°C靜置 24h。
[0051]轉(zhuǎn)染24h后，吸出培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細(xì)胞，盡可能的棄凈各孔內(nèi)的殘留液體。按 Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒說(shuō)明書(shū)向每孔中加入 100 μ L PLB,室溫?fù)u床搖動(dòng)20min充分裂解細(xì)胞。每孔加入20 μ L LAR-1I試劑，放入儀器上，讀取熒光素酶熒光值，然后加入20 μ L Stop & Glo試劑，放入儀器上，讀取海腎熒光素酶熒光值。通過(guò)Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組中螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光值(FLuc)和海腎熒光素酶的熒光值(RLuc)，取F/R為相對(duì)活性值進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。
[0052]以轉(zhuǎn)入pmirGLO 載體為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組NC，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR載體與NC相比變化下降2.67%，不具有顯著性差異；pmirGL0-TGF- β 1_3’ UTR載體和Pre-miR663共轉(zhuǎn)入組與NC相比變化下降26.91%，具有顯著性差異(P〈0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF- β I是miR-663的靶基因，miR-663靶向并抑制TGF- β I的表達(dá)，對(duì)TGF- β I基因起到負(fù)調(diào)控作用。
【權(quán)利要求】
1.羊駝TGF-β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，所述羊駝TGF- β 1_3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體含有雙突光素酶報(bào)告基因載體和SEQ ID N0.3所不核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊駝TGF-β I基因的3’ UTR區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊駝TGF-β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，其特征是所述的雙突光素酶報(bào)告基因載體為 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression。
3.一種羊駝TGF-β 1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟: 1)設(shè)計(jì)如SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的特異的TGF-β 1-3’ UTR引物:
TGF-β 1-3’UTR-fec 1-PF:5’CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3’ ；
TGF-β 1-3' VTR-1ba 1-PR:5’GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3’ ； 2)TRizol法提取羊駝黑色素細(xì)胞總RNA，以上述特異TGF-β 1_3’UTR引物擴(kuò)增，得到SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的TGF-β 1_3’ UTR片段； 3)USac I和油al限制性內(nèi)切酶分別酶切回收的TGF-β 1-3’UTR片段和pmirGLODual-Luciferase miRNA Target Expression雙突光素酶報(bào)告基因載體，將 TGF-β 1-3’UTR片段插入 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expressior^tJfec 1和處<31 酶切位點(diǎn)，構(gòu)建羊駝TGF- β 1-3’ UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO-TGF- β 1-3’ UTR0
4.權(quán)利要求1羊駝TGF-β1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體在檢測(cè)miR663對(duì)TGF-β I基因調(diào)控作用上的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求 1羊駝TGF-β1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體在研究miR-663對(duì)候選靶基因TGF-β I生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制上的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1羊駝TGF-β1-3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體在靶基因?yàn)門(mén)GF-β I的microRNA功能研究上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103882043SQ201410076409
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】賈小云, 賀立恒, 金雷皓, 丁娜, 范瑞文, 楊珊珊, 劉慧 , 沈潔, 李芳
申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)