利用ssr標(biāo)記與毛細(xì)管電泳鑒定甘蔗雜交種子純度的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甘蔗雜交種子純度分子鑒定技術(shù)。該技術(shù)是利用SSR標(biāo)記與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，具體方法包括提取甘蔗基因組DNA，選取多態(tài)性較高的SSR引物，對甘蔗DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用毛細(xì)管凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計算雜交組合F1的雜交率。SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)能精確給出片段大小，分離效率高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠有效的鑒定出雜交種子純度。
【專利說明】利用SSR標(biāo)記與毛細(xì)管電泳鑒定甘蔗雜交種子純度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于SSR-毛細(xì)管電泳的農(nóng)作物雜交種子純度的檢測方法，特別涉及一種鑒定甘蔗雜交種子純度的檢測方法，屬于植物分子標(biāo)記檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]甘蔗選育種的首要程序是甘蔗雜交開花，甘蔗雜交開花是一個長期而復(fù)雜的過程，甘蔗開花的復(fù)雜性、甘蔗花粉保存等行為導(dǎo)致甘蔗種子較容易產(chǎn)生自交、混雜(雜交種子的父母親本非計劃設(shè)定的親本)，致使甘蔗選育種不能順利進(jìn)行。建立準(zhǔn)確、快速的檢測甘蔗雜交種子純度的技術(shù)方法對提高甘蔗選育種的效率具有重要意義。SSR標(biāo)記由于具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、遺傳上呈共顯性、結(jié)果穩(wěn)定可靠、實(shí)驗操作簡單、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，是目前作物雜交種子純度檢測中使用最多的分子標(biāo)記技術(shù)。而在SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用過程中技術(shù)難度較大、較復(fù)雜的環(huán)節(jié)是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis, CE)也叫高效毛細(xì)管電泳(HPCE)。Jorgenson等(1981)利用高電壓在內(nèi)徑為75 ym毛細(xì)管柱內(nèi)分離蛋白質(zhì)，創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。與普通電泳相比，毛細(xì)管凝膠電泳具有高靈敏度、高分辨率、高速度、樣品少等優(yōu)點(diǎn)，已被逐步應(yīng)用于檢測分子標(biāo)記技術(shù)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0003]易紅梅等(2006)為了將毛細(xì)管熒光檢測方法與變性PAGE銀染檢測方法做對比，應(yīng)用7對SSR引物對192份玉米品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，兩種方法檢測的SSR標(biāo)記片段大小一致，毛細(xì)管熒光檢測方法檢測的結(jié)果更為精確、靈敏、高效。陳雅瓊等(2011)應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)對9份煙草材料進(jìn)行SSR位點(diǎn)分析，建立并優(yōu)化了毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測方法應(yīng)用于煙草SSR標(biāo)記分析的技術(shù)體系，通過與聚丙烯酰胺凝膠電泳相對比，說明毛細(xì)管電泳技術(shù)具有簡便、可靠及高通量的優(yōu)點(diǎn)。目前毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)已在作物品種鑒別、指紋鑒定、遺傳分析等研究中得到廣泛應(yīng)用。在雜交種子的純度鑒定過程中，使用最為普遍，鑒定結(jié)果最好的分子標(biāo)記技術(shù)為SSR標(biāo)記，已在柑桔、水稻、油菜、玉米、棉花等作物的鑒定中得到證實(shí)，但在這些研究中擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法均為普通的PAGE。張鳳娟等(2004)在研究雜交水稻品種R優(yōu)527種子的真實(shí)性和純度時，嘗試建立了熒光檢測體系，應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)對SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，認(rèn)為將熒光標(biāo)記應(yīng)用于雜交種子的鑒定能夠提高檢測的靈敏度及自動化水平。McIntyre等(2001)利用RAPD標(biāo)記方法對8個澳大利亞甘蔗雜交組合雜交進(jìn)行鑒定，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，自交率范圍在O~17.6%。但目前還未見關(guān)于應(yīng)用基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的SSR分子標(biāo)記對甘蔗雜交種子純度鑒定的報道。本發(fā)明利用SSR分子標(biāo)記與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合對6個甘蔗雜交組合進(jìn)行純度鑒定，篩選出適合鑒定甘蔗雜交種子的SSR熒光引物，擬尋找一種高通量甘蔗雜交種子純度的SSR標(biāo)記與毛細(xì)管電泳鑒定方法，為提高甘蔗選育種效率提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決甘蔗雜交種子純度鑒定難的問題，提供一種高效率、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的甘蔗雜交種子純度的鑒別方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的甘蔗雜交種子純度的鑒別方法，包括以下步驟:
提取甘蔗雜交種子實(shí)生苗嫩葉的DNA，然后利用2對SSR熒光引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增后構(gòu)建穩(wěn)定、清晰的SSR-毛細(xì)管電泳擴(kuò)增圖譜。由所得圖譜中讀取條帶大小，對雜交后代擴(kuò)增結(jié)果與親本擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較分析，對甘蔗雜交組合Fl的純度進(jìn)行鑒定。
[0006]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述2對SSR熒光引物為能在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性，且在雜交種Fl代中能擴(kuò)增出兩個親本互補(bǔ)型條帶的引物，其中正向引物5’端以“CY5 ”磷熒光染料標(biāo)記，合成熒光引物，并避光保存，引物信息如下:
引物名稱:SMC7CUQ，擴(kuò)增總帶數(shù):12，條帶大小:158-171Bp，引物退火溫度60°C，引物序列:GCC AAA GCA AGG GTC ACT AGA 正向，AGC TCT ATC AGT TGA AAC CGA 反向；
引物名稱:mSSCIR43，擴(kuò)增總帶數(shù):17，條帶大小:168_256Bp，引物退火溫度52°C，引物序列:ATT CAA CGA TTT TCA CGA G 正向，AAC CTA GCA ATT TAC AAG AG 反向。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述DNA提取方法為:(I)用75%的酒精擦洗過的剪刀剪取0.02~0.04 cm2的葉片裝入96孔板的孔中，加入100 μ L DNA提取緩沖液，再加入0.2μ L的100 mg/mL蛋白酶K和I μ L的10 mg/mL核糖核酸酶,用PCR板硅膠蓋封蓋好后于漩渦振蕩儀上混勻10 s；(2)在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置以下反應(yīng)程序并保存:首先設(shè)置溫度為37 °C，時間為30 min ;接著設(shè)置溫度為68 °C，時間為20 min ;然后設(shè)置溫度為37 °C，時間為30 min ;最后設(shè)置溫度為4 °C,時間為； (3)將步驟(1)得到的PCR板放入設(shè)置好的PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；(4)反應(yīng)結(jié)束后立刻將PCR板轉(zhuǎn)置于冰面上進(jìn)行冰浴10 min ； (5)將PCR板放入冷凍離心機(jī)中，在4 1:下3000 rpm離心10 min，取上清液保存?zhèn)溆谩?br> 作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系及程序為:PCR總反應(yīng)體系為20μ L，其中 20 ng DNA 樣品，10 mmol/ L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L MgCl2, dATP,dTTP、dGTP 和 dCTP 各 80 mmol/L，正反向引物各 0.4 mmol/L, Taq DNA 聚合酶 IU ;PCR 反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀Biometra Tproffessional Thermocycler上按以下程序進(jìn)行:首先95°C預(yù)變性5 min ;隨后的30個循環(huán)為:94 °C變性30 S，退火30 s，72 °C延伸30 s ;最后72 V下延伸2 min。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，PCR的產(chǎn)物在BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀上利用毛細(xì)管電泳法(CE)檢測；PCR產(chǎn)物稀釋100倍備用。每個CE樣品中含有I PLPCR產(chǎn)物稀釋液、0.2 μL Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品和20 μL去離子甲酰胺。設(shè)定電泳檢測程序為:90 °C變性2 min ;進(jìn)樣電壓2 kV，時間30 s ;分離電壓7.5 kV，時間40 min。在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定,所述SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)分析方法為:用GeneMapper_V3.0軟件對BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計得出不同甘蔗屬材料的SSR標(biāo)記片段。利用軟件將SSR標(biāo)記片段與Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到SSR標(biāo)記片段長度大小。在所有SSR標(biāo)記片段上，參試材料中若擴(kuò)增出記為“ I ”，無擴(kuò)增出記為“O”，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
[0010]本發(fā)明篩選出2對多態(tài)性好的SSR引物SMC7⑶Q和mSSCIR43，其中引物5’端以“ CY5 ”磷熒光染料標(biāo)記合成熒光引物。[0011]本發(fā)明利用SSR-毛細(xì)管電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記與高效、自動化技術(shù)的結(jié)合，檢測結(jié)果由分析軟件自動保存，分析速度快，分離效率高，有利于大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)分析及結(jié)果的永久保存，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為SSR分子標(biāo)記技術(shù)在甘蔗雜交種子純度鑒定中的推廣和應(yīng)用打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
[0012]本發(fā)明利用毛細(xì)管凝膠電泳檢測方法與遺傳分析系統(tǒng)相匹配的電腦軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)一處理分析。靈敏度較高，在微量PCR產(chǎn)物分析中表現(xiàn)出強(qiáng)大的分析能力，本實(shí)驗將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后去WL進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，條帶清晰。并且能準(zhǔn)確讀出片段大小，區(qū)分度在Ibp之內(nèi)，提高了種子純度鑒定的準(zhǔn)確性。
[0013]本發(fā)明簡便快捷，應(yīng)用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)，一次檢測只需一塊96孔板，每孔可上3個不同引物標(biāo)記，相當(dāng)于一次檢測288個樣，不僅簡化了實(shí)操作步驟，而且避免了同位素標(biāo)記或銀染過程中出現(xiàn)的假帶現(xiàn)象。
【具體實(shí)施方式】[0014]實(shí)施例:
6個甘蔗雜交組合的種子純度的鑒定
1.種子樣品的選取
選取6個甘蔗雜交組合，分別編號為01、02、03、04、05、06，從每個雜交組合中隨機(jī)選取20粒種子的實(shí)生苗。
[0015]2.甘蔗雜交種子實(shí)生苗基因組DNA的提取
(1)用75%的酒精擦洗過的剪刀剪取0.02、.04 cm2的甘蔗種子實(shí)生苗的葉片裝入96孔板的孔中，加入100 uL DNA提取緩沖液，再加入0.2 μ L的100 mg/mL蛋白酶K和Iμ L的10 mg/mL核糖核酸酶,用PCR板硅膠蓋封蓋好后于鏇潤振蕩儀上混勻10 sec ；
(2)在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置以下反應(yīng)程序并保存:首先設(shè)置溫度為37°C，時間為30min ;接著設(shè)置溫度為68 °C，時間為20 min ;然后設(shè)置溫度為37°C，時間為30 min ;最后設(shè)置溫度為4°C,時間為；
(3)將步驟(1)得到的PCR板放入設(shè)置好的PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；
(4)反應(yīng)結(jié)束后立刻將PCR板轉(zhuǎn)置于冰面上進(jìn)行冰浴10min ；
(5)將PCR板放入冷凍離心機(jī)中，在4°C下3000rpm離心10 min，取上清液保存?zhèn)溆谩?br> [0016]3.PCR 擴(kuò)增
PCR 反應(yīng)體系(20 μ I):包括 20 ng DNA 樣品，10 mmol/ L Tris-HCl (pH 8.3)，50mmol/L KC1，2.5 mmol/L MgCl2，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 80 mmol/L，正反向引物各 0.4mmol/L, Taq DNA 聚合酶 1U。
[0017]PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性5 min ;隨后的30個循環(huán)為:94°C變性30 S，退火30 s,72°C延伸30 s ;最后72°C下延伸5 min。
[0018]4.毛細(xì)管凝膠電泳檢測
PCR的產(chǎn)物在BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀上利用毛細(xì)管電泳法(CE)檢測。PCR產(chǎn)物稀釋100倍備用。每個CE樣品中含有I μL PCR產(chǎn)物稀釋液、0.2 μLGenescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品和20 μL去離子甲酰胺。設(shè)定電泳檢測程序為:90°C變性2min ;進(jìn)樣電壓2 kV，時間30 s ;分離電壓7.5 kV，時間40 min。在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。
[0019]5.數(shù)據(jù)分析
用GeneMapper-V3.0軟件對BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計得出不同甘蔗屬材料的SSR標(biāo)記片段。利用軟件將SSR標(biāo)記片段與Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到SSR標(biāo)記片段長度大小。在所有SSR標(biāo)記片段上，參試材料中若擴(kuò)增出記為“ 1”，無擴(kuò)增出記為“0”，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
[0020]6.鑒定結(jié)果分析
本試驗共選取了 6個雜交組合，每個組合選取20株雜交種子實(shí)生苗，利用篩選出的SSR標(biāo)記對這些實(shí)生苗雜交純度進(jìn)行檢測，得到了穩(wěn)定、清晰的SSR-毛細(xì)管電泳擴(kuò)增圖譜。由所得圖譜中讀取條帶大小，對20個雜交后代擴(kuò)增結(jié)果作比較分析，如雜交組合04 (表1),其中子代Fl雜交種子I只含有一個親本的條帶，屬于自交型；而雜交種子8、11、12、18含有親本以外的其它條帶，屬于混雜型；原因可能是因為親本自交系的若干位點(diǎn)上產(chǎn)生了變異，或是在制種過程中母本產(chǎn)生了自交。其余的雜交種子均含有親本雙方的互補(bǔ)條帶，屬于雜交型。6個雜交組合檢測結(jié)果見表2，其中雜交組合04雜交成功率最高。本實(shí)驗所檢測的6個雜交組合雜交成功率都不是太高，平均雜交成功率為50%，最高為75% (雜交組合04)。自交率平均為17.5%，最高為50% (雜交組合02)?；祀s率平均為32.5%，最高為65% (雜交組合01)。自交率較高可能與本試驗只利用2對SSR引物檢測這些雜交種子有關(guān)，若要更加準(zhǔn)確地判斷雜交種子是否為自交種子，需要采用更多的引物進(jìn)行驗證。
【權(quán)利要求】
1.一種利用SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)鑒定甘蔗雜交種子純度的技術(shù)，其特征在于提取甘蔗雜交種子實(shí)生苗嫩葉的DNA，然后利用2對SSR熒光引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增后構(gòu)建SSR-毛細(xì)管電泳擴(kuò)增圖譜，由所得圖譜中讀取條帶大小，對雜交后代擴(kuò)增結(jié)果與親本擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較分析，對甘蔗雜交組合Fl的純度進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)鑒定甘蔗雜交種子純度的技術(shù)，其特征在于，所述2對SSR熒光引物為能在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性，且在雜交種Fl代中能擴(kuò)增出兩個親本互補(bǔ)型條帶的引物，其中正向引物5’端以“CY5”磷熒光染料標(biāo)記，合成熒光引物，并避光保存，引物信息如下: 引物名稱:SMC7CUQ，擴(kuò)增總帶數(shù):12，條帶大小:158-171Bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:正向:GCC AAA GCA AGG GTC ACT AGA，反向:AGC TCT ATC AGT TGA AAC CGA ； 引物名稱:mSSCIR43，擴(kuò)增總帶數(shù):17，條帶大小:168_256Bp，引物退火溫度:52°C，弓丨物序列:正向:ATT CAA CGA TTT TCA CGA G，反向:AAC CTA GCA ATT TAC AAG AG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)鑒定甘蔗雜交種子純度的技術(shù)，其特征在于，所述DNA提取包括以下步驟:(I)用75%的酒精擦洗過的剪刀剪取0.02、.04cm2的葉片裝入96孔板的孔中，加入100 μ L DNA提取緩沖液，再加入0.2 μ L的100 mg/mL蛋白酶K和I μ L的10 mg/mL核糖核酸酶,用PCR板硅膠蓋封蓋好后于鏇潤振蕩儀上混勻10 s；(2)在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置以下反應(yīng)程序并保存；首先設(shè)置溫度為37 °C，時間為30 min ;接著設(shè)置溫度為68 °C，時間為20 min ;然后設(shè)置溫度為37 °C，時間為30 min ;最后設(shè)置溫度為4 °C，時間為m;(3)將步驟(1)得到的PCR板放入設(shè)置好的PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；(4)反應(yīng)結(jié)束后立刻將PCR板轉(zhuǎn)置于冰面上進(jìn)行冰浴10 min ； (5)將PCR板放入冷凍離心機(jī)中，在4。(^下3000 rpm離心10 min,取上清液保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)鑒定甘蔗雜交種子純度的技術(shù)，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系及程序為:PCR總反應(yīng)體系為20 μ L，其中20 ngDNA 樣品，10 mmol/ L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L MgCl2, dATP、dTTP、dGTP 和dCTP各80 mmol/L，正反向引物各0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶IU ;PCR反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀Biometra Tproffessional Thermocycler 上按以下程序進(jìn)行:首先 95°C預(yù)變性 5 min ;隨后的30個循環(huán)為:94 °C變性30 S，退火30 S，72 °C延伸30 s ;最后72 °C下延伸2 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)鑒定甘蔗雜交種子純度的技術(shù)，其特征在于:PCR的產(chǎn)物在BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀上利用毛細(xì)管電泳法檢測；PCR產(chǎn)物稀釋100倍備用；每個CE樣品中含有I PL PCR產(chǎn)物稀釋液、0.2 μLGenescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品和20 μL去離子甲酰胺；設(shè)定電泳檢測程序為:90 °C變性2min ;進(jìn)樣電壓2 kV,時間30 s ;分離電壓7.5 kV,時間40 min ;在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR-毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)鑒定甘蔗雜交種子純度的技術(shù)，其特征在于:用GeneMapper-V3.0軟件對BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計得出不同甘蔗屬材料的SSR標(biāo)記片段；利用軟件將SSR標(biāo)記片段與Genescan-600分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到SSR標(biāo)記片段長度大小；在所有SSR標(biāo)記片段上，參試材料中若擴(kuò)增出記為“1”，無擴(kuò)增出記為“0”，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
【文檔編號】G01N27/447GK103911435SQ201410090899
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】梁俊, 劉守廷, 甘志勇, 莫璋紅, 宋雪萍, 甘國勇 申請人:南寧泰格瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司