一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于：其測試過程是24小時尿液在室溫下解凍，混合均勻離心過濾，通過OasisMCX固相萃取小柱凈化富集，混勻后引入LC-MS/MS系統(tǒng)分析，可準(zhǔn)確檢測出尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤，3-MeA；3-乙基腺嘌呤，3-EtA；3-羥乙基腺嘌呤，3-HOEtA)的含量水平。本發(fā)明采用氘代標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過程中引起的誤差、串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準(zhǔn)確性和靈敏度。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機(jī)溶劑的消耗量。
【專利說明】一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，主要涉及尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ；3-乙基腺嘌呤3_EtA; 3-羥乙基腺嘌呤3-HOEtA)的測定技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體說是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-ES1-MS/MS)測定尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ;3_乙基腺嘌呤3_EtA; 3-羥乙基腺嘌呤3-HOEtA)的方法的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ;3_乙基腺嘌呤3_EtA; 3_羥乙基腺嘌呤3-HOEtA)是外源性化合物體內(nèi)代謝生成的自由基與腺嘌呤結(jié)合后的產(chǎn)物。由于尿中內(nèi)源性3-烷化腺嘌呤本底值低，又能較為準(zhǔn)確的反映原型化合物的特性，因此作為生物監(jiān)測指標(biāo)廣泛用于環(huán)境烷基化污染物的生物監(jiān)測。據(jù)報道，尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羥乙基腺嘌呤3-HOEtA)與吸煙者煙氣接觸水平有較強(qiáng)的相關(guān)性，能夠用于評價煙氣中有害成分亞硝胺的接觸水平。
[0003]目前，關(guān)于尿液中DNA加合物的分析檢測方法應(yīng)用的報道較多，但是大規(guī)模采集中國吸煙者尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ;3_乙基腺嘌呤3_EtA; 3-羥乙基腺嘌呤3-HOEtA)進(jìn)行分析的未見報導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提出的一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)應(yīng)用于分析大規(guī)模尿液樣品中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羥乙基腺嘌呤3-HOEtA)的方法。該方法具有快速、準(zhǔn)確，可靠等特點(diǎn)，可用于大規(guī)模吸煙者尿液中3-烷化腺嘌呤的定性定量分析。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，即監(jiān)測3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、3-乙基腺嘌呤(3_EtA)和3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的應(yīng)用，包括以下具體過程:
(1)取樣，招募吸煙者、非吸煙者志愿者，對志愿者進(jìn)行篩選，采集入選志愿者24小時排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分別存放于_80°C超低溫冰箱中保存；
(2)逐一對志愿者尿液進(jìn)行處理、測定，得到每一個志愿者尿液樣品中3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)和3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的含量，對志愿者尿液進(jìn)行處理、測定的具體步驟如下:
a、樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4 mL尿液，加入4mL超純水，力口Λ 100 μ L混合內(nèi)標(biāo)，用水浴鍋調(diào)節(jié)溫度到75-85°C，取超純水稀釋至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；所述混合內(nèi)標(biāo)為d3-3-MeA和d5-3-EtA混合溶液，其中d3-3-MeA濃度為100ng/ml, d5-3_EtA 濃度為 2ng/ml。
[0006]固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，預(yù)先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上樣量為8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液(47.5: 47.5: 5)洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮?dú)獯抵粮桑缓笥?00 μ L水溶液溶解，供LC-MS/MS分離分析；
b、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:用乙腈配制不同濃度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
C、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
[0007]在色譜測定中,選取了 Waters HILIC色譜柱,規(guī)格150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm流動相體系選取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5，色譜測定中的洗脫條件:流動相A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5 ;流速0.25 mL/min ;柱溫25° C ;進(jìn)樣量3 PL，洗脫時間:0?20 min。
[0008]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；噴霧(IS)電壓為5500 V ;霧化氣(Gasl)壓力為 344.5 kPa(50 psi);氣簾氣(CUR)壓力為 206.7 kPa(30 psi);輔助霧化氣(Gas2)壓力為310.0 kPa(45 psi);離子源溫度(TEM)為500°C ;去蔟電壓(DP)為100eV ;碰撞能(CE)為30 eV ;駐留時間為100 ms，監(jiān)測離子對為3-MeA:150 — 123 (定量離子對)，150 — 108 (定性離子對);內(nèi)標(biāo) ds-3-MeA 為 153 — 126 ；3-EtA:164 — 136 (定量離子對)，164 — 119 (定性離子對);內(nèi)標(biāo) d5-3-EtA 為 169 — 137 ；3-H0EtA:180 — 136 (定量離子對)，180 — 119 (定性離子對)；內(nèi)標(biāo)d5-3-EtA為169 — 137。 (3)將每一志愿者尿液樣品的測定數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理，找出吸煙者尿液中3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)和3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的含量規(guī)律，所述的數(shù)據(jù)分析軟件為Office excel或SPSS統(tǒng)計分析軟件。
[0009]本發(fā)明通過對大規(guī)模志愿者的招募，大量尿液樣品的保存條件的優(yōu)化，建立了分析、檢測中國吸煙者尿液中3-烷化腺嘌呤的含量水平的應(yīng)用方法，適合于分析大量的吸煙人群尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA ；3-乙基腺嘌呤3_EtA; 3-羥乙基腺嘌呤3-H0EtA)水平。每個樣本在20 min內(nèi)就可完成3-烷化腺嘌呤的檢測，并使用Excel和SPSS軟件對大規(guī)模檢測樣品進(jìn)行分析
本發(fā)明具體的工藝過程進(jìn)一步詳述如下:
1、樣品前處理
樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4 mL尿液，加入4mL超純水，加入100 UL內(nèi)標(biāo)(100ng/mL)，用水浴鍋調(diào)節(jié)溫度到80°C。取超純水稀釋后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取選取Waters Oasis MCX (6 mL, 500 mg)小柱,預(yù)先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上樣量為8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后I mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水(47.5: 47.5: 5)洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮?dú)獯抵粮?，然后?00 111^水溶液溶解，供^:-1^/^3分離分析。
[0010]2、LC-MS/MS 測定
(1)LC-MS/MS 條件
色譜條件:Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm)色譜柱,流動相A:乙腈溶液,pH
4.0 (體積分?jǐn)?shù))，流動相B =IOmM的甲酸銨/水溶液，pH 4.0 ;流速0.25 mL/min ;柱溫25° C ;進(jìn)樣量3 μ?。洗脫時間:0~20 min。
[0011]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；噴霧(IS)電壓為5500 V ;霧化氣(Gasl)壓力為 344.5 kPa(50 psi);氣簾氣(CUR)壓力為 206.7 kPa(30 psi);輔助霧化氣(Gas2)壓力為310.0 kPa(45 psi);離子源溫度(TEM)為500°C ;去蔟電壓(DP)為100eV ;碰撞能(CE)為30 eV ;駐留時間為40 ms。監(jiān)測離子對及其相應(yīng)的碰撞能量(CE)見表
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[0012]表1多反應(yīng)監(jiān)測模式下3-烷化腺嘌呤及其氘代內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，即監(jiān)測3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、3-乙基腺嘌呤(3_EtA)和3-羥乙基腺嘌呤(3_H0EtA)的應(yīng)用，其特征在于:包括以下具體過程: 取樣，招募吸煙者、非吸煙者志愿者，對志愿者進(jìn)行篩選，采集入選志愿者24小時排泄的全部尿液收集存放于5L的聚丙烯桶中，每一志愿者尿液分別存放于_80°C超低溫冰箱中保存； 逐一對志愿者尿液進(jìn)行處理、測定，得到每一個志愿者尿液樣品中3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)和3-羥乙基腺嘌呤(3_H0EtA)的含量； 將每一志愿者尿液樣品的測定數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理，找出吸煙者尿液中3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、3-乙基腺嘌呤(3_EtA)和3-羥乙基腺嘌呤(3_H0EtA)的含量規(guī)律。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:對志愿者尿液進(jìn)行處理、測定的具體步驟如下: a、樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4mL尿液，加入4mL超純水，加AlOO μ L混合內(nèi)標(biāo)，用水浴鍋調(diào)節(jié)溫度到75-85°C，取超純水稀釋至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中； 固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，預(yù)先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上樣量為8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮?dú)獯抵粮桑缓笥?00 yL水溶液溶解，供LC-MS/MS分尚分 析； b、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:用乙腈配制不同濃度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； C、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、3-乙基腺嘌呤(3-EtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:所述混合內(nèi)標(biāo)為d3-3-MeA和d5-3-EtA混合溶液，其中d3-3_MeA 為 100 ng/ml, d5-3_EtA 為 2ng/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具體配比為47.5:47.5: 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:在c步驟中，選取了 Waters HILIC色譜柱，規(guī)格150 mmX 2.1 mm, 2.5 Mm，流動相體系選取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:色譜測定中的洗脫條件:流動相A:乙腈溶液，pH 4.0，流動相B:甲酸銨/水溶液(10mM)，pH 4.0，A:B=95:5 ;流速0.25 mL/min ;柱溫25。C ;進(jìn)樣量3 μ?，洗脫時間:0~20 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，正離子掃描方式；噴霧電壓為5500 V ;霧化氣壓力為344.5 kPa ;氣簾氣壓力為206.7 kPa ;輔助霧化氣壓力為310.0kPa;離子源溫度為500°C;去蔟電壓為100 eV;碰撞能為30 eV;駐留時間為100 ms，監(jiān)測離子對為3-MeA: 150 — 123定量離子對，150 — 108定性離子對；內(nèi)標(biāo)d3-3-MeA為153 — 126 ；3-EtA:164 — 136定量離子對，164 — 119定性離子對；內(nèi)標(biāo)d5-3_EtA為169 — 137 ；3-HOEtA:180 — 136 定量離子對，180 — 119 定性離子對；內(nèi)標(biāo) d5-3_EtA 為 169 — 137。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法在大規(guī)模吸煙人群樣本生物監(jiān)測3-烷化腺嘌呤的應(yīng)用，其特征在于:過程(3)中所述的數(shù)據(jù)分析軟件為Office excel或SPSS統(tǒng)計分析軟件。`
【文檔編號】G01N30/88GK103823009SQ201410093888
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】田永峰, 楊進(jìn), 王安, 劉勇, 侯宏衛(wèi), 胡清源, 韓書磊, 吳帥賓, 陳歡, 劉彤 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院