尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法
【專利摘要】一種尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，其特征在于：其測試過程是24小時尿液在室溫下解凍，混合均勻離心過濾，通過OasisMCX固相萃取小柱凈化富集，混勻后引入LC-MS/MS系統(tǒng)分析，可準確檢測出尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的含量水平。本發(fā)明為全新的尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，采用氘代標準品作為內標定量分析物可以減少樣品前處理過程中引起的誤差、串聯(lián)質譜法更好的提高了方法的選擇性與準確性和靈敏度。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機溶劑的消耗量。
【專利說明】尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法
[0001]【技術領域】:
本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗【技術領域】，主要涉及尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的測定【技術領域】，具體說是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜儀(LC-ES1-MS/MS)測定尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的方法。
[0002]【背景技術】:
3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)是外源性化合物體內代謝生成的自由基與腺嘌呤結合后的產物。由于尿中內源性3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)本底值低，又能較為準確的反映原型化合物的特性，因此作為生物監(jiān)測指標廣泛用于環(huán)境烷基化污染物的生物監(jiān)測。據報道，尿液中3-輕乙基腺嘌呤(N3-(2_hydroxyethyl) adenine, 3-H0EtA)與吸煙水平有較強的相關性，能夠用于評價煙氣中有害成分亞硝胺的接觸水平。
[0003]目前，關于尿液中DNA加合物的分析檢測方法的報道較多，但是提取、凈化、檢測尿液基質中多種目標物的高通量分析方法尚不完善。
[0004]
【發(fā)明內容】
:
本發(fā)明的目的正是基于上述現有技術狀況，采用液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS )技術建立了尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA))的測定方法。該方法具有快速、準確、靈敏度高等特點，可用于尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的定性定量分析。本發(fā)明通過優(yōu)化前處理及檢測條件，建立了提取、檢測尿液中3-羥乙基腺嘌呤的方法，適合于分析吸煙與非吸煙人群尿液。在20 min內就可完成3-羥乙基腺嘌呤的分離檢測，本方法靈敏，準確，選擇性好。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的測定方法，包括以下具體步驟:
a、樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4 mL尿液，加入4mL超純水，力口Λ 100 μ L內標，用水浴鍋調節(jié)溫度到80°C。取超純水稀釋后的尿液置于固相萃取柱中。所述內標為氘代-3-乙基腺嘌呤，內標濃度為100 ng/mL。
[0006]固相萃取用Waters Oasis MCX (6 mL, 500mg)固相萃取柱,預先用2 mL甲醇、5mL水溶液活化，上樣量為8 mL。用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水(47.5: 47.5: 5)洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮氣吹至干，然后用100 μ L水溶液溶解，供LC-MS/MS分離分析。
[0007]b、標準工作液的配制:用乙腈配制不同濃度的3-羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)標準工作溶液。
[0008]C、液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的3_羥乙基腺嘌呤(3-H0EtA)的標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程。對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
[0009]本發(fā)明選取了 Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm)色譜柱,流動相體系選取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5，洗脫時間為20 min，進樣量為3μ L0
[0010]質譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；噴霧(IS)電壓為5500 V ;霧化氣(Gasl)壓力為 344.5 kPa(50 psi);氣簾氣(CUR)壓力為 206.7 kPa(30 psi);輔助霧化氣(Gas2)壓力為310.0 kPa(45 psi);離子源溫度(TEM)為500°C;去蔟電壓(DP)為85eV ；碰撞能(CE)為26 eV ;駐留時間為40 ms。監(jiān)測離子對為3-HOEtA:180 — 136 (定量離子對)，180 — 119 (定性離子對)；內標 d5-3-EtA 為 169 — 137。
本發(fā)明具體的工藝過程進一步詳述如下:
1、樣品前處理
樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4 mL尿液，加入4mL超純水，加入100 UL內標(100ng/mL)，用水浴鍋調節(jié)溫度到80°C。取超純水稀釋后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取選取Waters Oasis MCX (6 mL, 500 mg)小柱,預先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上樣量為8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水(47.5: 47.5: 5)洗脫，收集洗脫液并于60 °C下用氮氣吹至干，然后用100 μ L水溶液溶解，供LC-MS/MS分離分析。
[0011]2、LC-MS/MS 測定
(1)LC-MS/MS 條件
色譜條件:Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm)色譜柱,洗脫條件:流動相A:乙腈溶液(體積分數)，pH 4.0，流動相B:甲酸銨/水溶液(10mM)，pH 4.0, A:B=95:5 ;流速
0.25 mL/min ;柱溫25 ° C ;進樣量3 μL。洗脫時間:0~20 min。
[0012]質譜條件:電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；噴霧(IS)電壓為5500 V ;霧化氣(Gasl)壓力為 344.5 kPa(50 psi);氣簾氣(CUR)壓力為 206.7 kPa(30 psi);輔助霧化氣(Gas2)壓力為310.0 kPa(45 psi);離子源溫度(TEM)為500°C ;去蔟電壓為IOOeV ;碰撞能(CE)為26eV ;駐留時間為40 ms。監(jiān)測離子對及其相應的碰撞能量(CE)見表1。
[0013]表1多反應監(jiān)測模式下3-羥乙基腺嘌呤及其氘代內標的部分質譜參數
【權利要求】
1.一種尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，其特征在于:包括以下具體步驟: a、樣品前處理:尿液在室溫狀態(tài)下解凍并混合均勻，取4mL尿液，加入4mL超純水，力口Λ 100 μ L內標,用水浴鍋調節(jié)溫度到75-85°C,取超純水稀釋至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中； 固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，預先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上樣量為8 mL，用2 mL 10%甲醇/水溶液淋洗，然后用I mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脫，收集洗脫液并于60 1:下用氮氣吹至干，然后用100 yL水溶液溶解，供LC-MS/MS分尚分析； b、標準工作液的配制:用乙腈配制不同濃度的3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)標準工作溶液； C、液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
2.根據權利要求1所述的尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，其特征在于:所述內標為氘代-3-乙基腺嘌呤，內標濃度為100 ng/mL。
3.根據權利要求1所述的尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，其特征在于:所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具體配比為47.5: 47.5: 5。
4.根據權利要求1所述的尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，其特征在于:在c步驟中，選取了 Waters HILIC色譜柱,規(guī)格150 mm x 2.1 mm, 2.5 Mm，流動相體系選取A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5。
5.根據權利要求4所述的尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，洗脫條件:流動相A:乙腈和B:1Om mol/L甲酸銨/水溶液，A:B為95:5 ;流速0.25 mL/min ;柱溫25° C ;進樣量3 PL，洗脫時間:0?20 min。
6.根據權利要求1所述的尿液中3-羥乙基腺嘌呤(3-HOEtA)的測定方法，其特征在于:質譜條件:電噴霧離子源，正離子掃描方式；噴霧電壓為5500 V ;霧化氣壓力為344.5kPa;氣簾氣壓力為206.7 kPa;輔助霧化氣壓力為310.0 kPa ;離子源溫度為500°C;去蔟電壓為85 eV ;碰撞能為26 eV ;駐留時間為40 ms，監(jiān)測離子對為3- HOEtA:180 — 136定量離子對，180 — 119定性離子對；內標d5-3- EtA為169 — 137。
【文檔編號】G01N30/88GK103852548SQ201410095002
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權日:2014年3月14日
【發(fā)明者】田永峰, 胡清源, 王安, 侯宏衛(wèi), 劉勇, 楊進, 陳歡, 韓書磊, 張小濤, 石龍凱, 劉彤, 劉洋 申請人:國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心, 中國科學院合肥物質科學研究院