一種結(jié)核分枝桿菌全蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌全蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種有如下1）-7）中至少一種功能的蛋白芯片，所述蛋白芯片上連有如下4168種蛋白，且每種蛋白單獨(dú)成立一個(gè)檢測點(diǎn)；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌全蛋白質(zhì)芯片，由基片和包含95%以上的結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的蛋白質(zhì)組成。該全蛋白質(zhì)芯片在尋找血清生物標(biāo)識物、與小分子化合物c-di-GMP相互作用底物，與蛋白質(zhì)激酶的相互作用的激酶底物，與巨噬細(xì)胞相互作用的底物都有明顯的意義。本發(fā)明相對現(xiàn)有的研究手段具備全局性、高通量的篩選特點(diǎn)，簡化了研究設(shè)計(jì)及操作過程，顯著提高研究效率。
【專利說明】—種結(jié)核分枝桿菌全蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種結(jié)核分枝桿菌全蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染所致，侵?jǐn)_了人類有7000年的歷史?？ń槊绾涂股氐某霈F(xiàn)使結(jié)核病一度得到控制。但耐藥的產(chǎn)生及與HIV共感染等問題使結(jié)核病在世界范圍內(nèi)又死灰復(fù)燃。WHO于1993年史無前例地宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”，1998年又重申了“遏制結(jié)核病刻不容緩”。目前全球60億人約有20億感染了結(jié)核桿菌，現(xiàn)有結(jié)核病患者2000萬，每年死亡300萬，結(jié)核病已成為傳染病中的頭號殺手。我國為全球22個(gè)結(jié)核病疫情嚴(yán)重的國家之一，年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占17%，位居全球第2位。然而，耐藥的出現(xiàn)使得結(jié)核病問題雪上加霜。目前全球感染了結(jié)核桿菌的20億人有5000萬是耐藥的。全球已有50多個(gè)國家報(bào)告發(fā)生了廣泛耐藥結(jié)核病例。中國是耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病疫情最嚴(yán)重的國家之一，耐多藥結(jié)核病人14萬，占全球1/3?1/4的耐多藥結(jié)核病人在中國。再加上全球的城市化進(jìn)程加快、交通日益發(fā)達(dá)以及人口老齡化等又為結(jié)核病的流行創(chuàng)造了有利條件，其結(jié)果導(dǎo)致結(jié)核病的流行正在全球復(fù)活。
[0003]結(jié)核病疫情嚴(yán)重，但臨床防治存在困難:1)因無特異的結(jié)核病生物標(biāo)識物及其靈敏、快速的檢測方法等導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)現(xiàn)率低；2)目前無有效疫苗進(jìn)行結(jié)核病預(yù)防。盡管卡介苗的普及大大降低了新生兒和青少年結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率，但其存在保護(hù)時(shí)效較短、不同人群差異很大、對成人無效等問題。3) 60年來無抗結(jié)核新藥導(dǎo)致耐藥性、不良反應(yīng)和療效不足等問題產(chǎn)生。目前，結(jié)核病治療世界范圍內(nèi)推廣使用DOTS策略。這是一種標(biāo)準(zhǔn)化療程，即前期4種藥物聯(lián)用(異煙肼+利福平+吡嗪酰胺+乙胺丁醇)加后期的兩種藥物聯(lián)用(異煙肼+利福平)。這種策略雖然在結(jié)核病治療方面起著非常重要的作用，但結(jié)核病治療時(shí)間長達(dá)6-9個(gè)月，導(dǎo)致耐藥性及不同人群差異很大，導(dǎo)致死亡率的升高。因此迫切需要發(fā)展新的結(jié)核病診斷試劑、新型疫苗和藥物。
[0004]造成目前結(jié)核病防控方面被動的最根本原因之一在于結(jié)核病和導(dǎo)致結(jié)核病的肺結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)研究方面的薄弱。結(jié)核病是結(jié)核桿菌與宿主免疫系統(tǒng)復(fù)雜斗爭的結(jié)果。結(jié)核桿菌不分泌毒素，也不像病毒是有限的幾個(gè)基因致病，它由4000多個(gè)蛋白組成，而且除蛋白質(zhì)之外還有糖類和脂類等功能分子對于其致病性至關(guān)重要，但目前結(jié)核桿菌哪些蛋白質(zhì)引起致??？哪些蛋白質(zhì)可以作為新藥研發(fā)的靶標(biāo)？哪些蛋白質(zhì)引起宿主的免疫反應(yīng)還不清楚。這些基本的科學(xué)問題不清楚導(dǎo)致結(jié)核病診斷，疫苗和藥物相關(guān)的研發(fā)無從下手。傳統(tǒng)的結(jié)核病研究主要集中在單一因素或單一水平。需要認(rèn)識到結(jié)核桿菌致病的關(guān)鍵問題是病原與宿主的互作，需要采用多因素、多水平的分析思路和高通量的篩選方法來理解多個(gè)因子協(xié)同作用導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生。要想在結(jié)核病的防控方面取得突破，必需站在全局性的高度從基礎(chǔ)的新生物標(biāo)識物、新免疫原發(fā)現(xiàn)以及藥物作用機(jī)制的揭示方面甚至更基礎(chǔ)的結(jié)核菌的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)入手。但由于結(jié)核菌研究的一些特殊性，如生長極其緩慢、難以破碎、基因組GC含量高、蛋白質(zhì)難以重組表達(dá)以及致病菌必需在P3實(shí)驗(yàn)室中操作等，結(jié)核病 及肺結(jié)核分枝桿菌的基礎(chǔ)研究方面長期滯后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白芯片。
[0006]本發(fā)明提供的蛋白芯片，包括基片和與其連接的結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質(zhì)；且每種蛋白單獨(dú)成立一個(gè)檢測點(diǎn)。
[0007]上述蛋白芯片中，所述結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質(zhì)為表I所示的4168種蛋白；
[0008]所述基片為載體玻片。
[0009]上述蛋白芯片中，所述蛋白芯片是分別將所述4168種蛋白點(diǎn)樣于載體玻片上制成的。
[0010]上述蛋白芯片中，所述結(jié)核分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumM.tuberculosis) H37Rv 和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium M.tuberculosis) CDC1551。
[0011 ] 含有上述的蛋白芯片的試劑盒。
[0012]上述的蛋白芯片或試劑盒在如下I) -5)中的應(yīng)用:
[0013]I)篩選與結(jié)核病患者血清特異結(jié)合的蛋白或構(gòu)建與結(jié)核病患者血清特異結(jié)合的蛋白庫；
[0014]2)篩選與環(huán)二鳥苷酸相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與環(huán)二鳥苷酸相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫；
[0015]3)篩選與蛋白激酶相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與蛋白激酶相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫；
[0016]4)篩選與非編碼RNA相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與非編碼RNA相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫；
[0017]5)篩選與巨噬細(xì)胞蛋白相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與巨噬細(xì)胞蛋白相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫。
[0018]上述應(yīng)用中,所述蛋白激酶為PknB或PknE ;
[0019]所述非編碼RNA為MTS2823，其核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0020]所述巨噬細(xì)胞蛋白按照如下方法制備:裂解所述巨噬細(xì)胞，收集上清液得到巨噬細(xì)胞蛋白。
[0021]上述結(jié)核病患者為由結(jié)核分枝桿菌感染的患者。
[0022]上述應(yīng)用中，所述巨噬細(xì)胞為單核巨噬細(xì)胞THP-1。
[0023]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌全蛋白質(zhì)芯片，由基片和包含85%以上的結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的蛋白質(zhì)組成。該全蛋白質(zhì)芯片在尋找血清生物標(biāo)識物、與小分子化合物c-d1-GMP相互作用底物，與蛋白質(zhì)激酶的相互作用的激酶底物，與巨噬細(xì)胞裂解物相互作用的底物都有明顯的意義。本發(fā)明相對現(xiàn)有的研究手段具備全局性、高通量的篩選特點(diǎn)，簡化了研究設(shè)計(jì)及操作過程，顯著提高研究效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為所制備的結(jié)核分枝桿菌蛋白的銀染定量檢測[0025]圖2為所制備的結(jié)核分枝桿菌蛋白的免疫印跡檢測
[0026]圖3為所制備的全蛋白質(zhì)芯片的質(zhì)控結(jié)果圖
[0027]圖4為全蛋白質(zhì)芯片的血清分析結(jié)果圖
[0028]圖5為全蛋白質(zhì)芯片與小分子化合物的作用結(jié)果圖
[0029]圖6為全蛋白質(zhì)芯片與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果圖
[0030]圖7為全蛋白質(zhì)芯片上進(jìn)行蛋白質(zhì)激酶反應(yīng)的結(jié)果圖
[0031]圖8為全蛋白質(zhì)芯片與RNA相互作用的結(jié)果圖
[0032]圖9為全蛋白質(zhì)芯片與細(xì)胞裂解物相互作用的結(jié)果圖
【具體實(shí)施方式】
[0033]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]實(shí)施例1、全蛋白質(zhì)芯片的制備
[0036](一)結(jié)核分枝桿菌蛋白的高通量的制備
[0037]1、表達(dá)
[0038]由基因工程改造過的釀酒酵母利用半乳糖誘導(dǎo)過量表達(dá)，具體過程為:
[0039]首先從分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Μ.tuberculosis) H37Rv菌株(北京株)(Naturel998Novl2; 396 (6707):190 ;公眾可從中國科學(xué)院生物物理研究所，上海交通大學(xué)，中國科學(xué)院武漢病毒研究所，廣東體必康生物科技有限公司獲得.)和CDC1551 菌株(J Bacteriol.20020ctober; 184(19):5479 - 5490 ;公眾可從廣東體必康生物科技有限公司獲得..)中，分別通過PCR克隆獲得H37Rv菌株3749個(gè)蛋白和⑶C1551菌株419個(gè)蛋白基因編碼片段，共4168個(gè)蛋白，通過Invitrogen公司的BP酶將基因編碼片段連接到pD0NR221載體(購自Invitrogen)上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5_Alpha中擴(kuò)增，提取載體再通過LR酶(Invitrogen)換至經(jīng)過改造的能夠表達(dá)GST標(biāo)簽的pEGH_A載體(該載體在 “Jian Zhu，Heng Zhu, et al J.Virol.May2009vol.83ηο.105219-5231，，中公開過，公眾可從中國科學(xué)院生物物理研究所，上海交通大學(xué)，中國科學(xué)院武漢病毒研究所，廣東體必康生物科技有限公司獲得)上，再次轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5-Alpha中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Pep4釀酒酵母菌株(該菌株在文獻(xiàn)“Heng Zhu, Michael Snyder, et al:NatureGenetics26, 283 - 289 (2000) do1: 10.1038/81576”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院生物物理研究所，上海交通大學(xué)，中國科學(xué)院武漢病毒研究所，廣東體必康生物科技有限公司獲得)中。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其0D600為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為2g/L的半乳糖，誘導(dǎo)6h, 4000rpm離心收集菌，_80°C保存。
[0040]每IL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(溶劑為水)中含有的組分如表I所示:
[0041]表I
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白芯片，包括基片和與其連接的結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質(zhì)；且每種蛋白單獨(dú)成立一個(gè)檢測點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于:所述結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質(zhì)為表6所不的4168種蛋白； 所述基片為載體玻片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白芯片，其特征在于: 所述蛋白芯片是分別將所述4168種蛋白點(diǎn)樣于載體玻片上制成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的蛋白芯片，其特征在于:所述結(jié)核分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium M.tuberculosis) H37Rv 和結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumM.tuberculosis)CDC1551。
5.含有權(quán)利要求1-4中任一所述的蛋白芯片的試劑盒。
6.權(quán)利要求1-4中任一所述的蛋白芯片或權(quán)利要求5所述的試劑盒在如下I)-5)中的應(yīng)用: 1)篩選與結(jié)核病患者血清特異結(jié)合的蛋白或構(gòu)建與結(jié)核病患者血清特異結(jié)合的蛋白庫； 2)篩選與環(huán)二鳥苷酸相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與環(huán)二鳥苷酸相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫； 3)篩選與蛋白激酶相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與蛋白激酶相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫； 4)篩選與非編碼RNA相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與非編碼RNA相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫； 5)篩選與巨噬細(xì)胞蛋白相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白或構(gòu)建與巨噬細(xì)胞蛋白相互作用的結(jié)合分枝桿菌蛋白數(shù)據(jù)庫。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于: 所述蛋白激酶為PknB或PknE ； 所述非編碼RNA為MTS2823，其核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述巨噬細(xì)胞蛋白按照如下方法制備:裂解所述巨噬細(xì)胞，收集上清液得到巨噬細(xì)胞蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述巨噬細(xì)胞為單核巨噬細(xì)胞THP-1。
【文檔編號】G01N33/68GK103884847SQ201410095163
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】張先恩, 陶生策, 畢利軍, 鄧教宇, 張治平, 江何偉, 周盈, 谷晶, 郭書娟, 張鴻泰, 王緒德, 鄧瑞萍, 王宗秀, 劉鐘慧, 顧佳, 李陽, 李文娟 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所, 上海交通大學(xué), 中國科學(xué)院武漢病毒研究所, 廣東體必康生物科技有限公司