高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒及檢測方法，所述試劑盒主要包括：固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜，雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，生物素或鏈霉親和素標記的多聚酶，以及與所述多聚酶對應的底物顯色劑；本發(fā)明試劑盒可高靈敏地定性或半定量地快速檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體IgE濃度，并可一次篩查數(shù)十種過敏原，快速、準確、樣品用量少，適宜進行高通量檢測。
【專利說明】高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒及方法 (-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高靈敏地定性或半定量地篩査或檢測人血清或血漿中的多個過 敏原特異性I班抗體水平的檢測試劑盒，及其檢測方法。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 2011?2012年世界變態(tài)反應組織（WAO)關(guān)于變態(tài)反應(也稱過敏反應，Allergy) 的白皮書指出："過敏性疾病的流行在發(fā)達國家和發(fā)展中國家全世界范圍內(nèi)正戲劇性地上 升。過敏性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、嚴重過敏反應，藥物、食物及昆蟲過敏反應， 濕疹、専麻疹(枯草熱）和血管性水腫。過去二十年尤其是兒童患過敏性疾病人數(shù)的增加有 暴發(fā)的趨勢。"（Pawankar R et al, WAO White Book on Allergy2011-2012;Executive Summary.)僅食物引發(fā)的過敏性疾病的流行率就達3%?6%D(Sicherer S H，Epidemiology of food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2011 ;127 :594-602.)過敏性疾病是患者吸入 或攝食入含有致敏成分的物質(zhì)(稱為過敏原或變應原，Allergen)后觸發(fā)機體的B細胞產(chǎn)生 過量的免疫球蛋白E (Immunoglobulin E，I班），當I班抗體在體內(nèi)再次接觸過敏原時就與 過敏原交聯(lián)結(jié)合到服大細胞和嗜堿性粒細胞表面上的高親和受體化e Rl上，導致化e Rl 受體的聚集，使服大細胞和嗜堿性粒細胞活化。服大細胞在活化過程中脫顆粒并釋放儲存 在細胞漿顆粒里的炎性介質(zhì)：組胺，與通過花生四帰酸途徑合成的白H帰、免疫反應性前列 腺素和IL4、IL5等細胞因子及趨化因子，引發(fā)過敏反應的疾病癥狀。過敏性疾病的發(fā)生， I班抗體起關(guān)鍵作用，稱為I班介導的過敏反應（即Gell-CoombsI型超敏反應，或稱I班介 導的速發(fā)性超敏反應)。I班介導的過敏性疾病的特征是患者體內(nèi)循環(huán)血液中的過敏原特異 性I班（Si班）抗體濃度較正常狀況下高，且病癥越嚴重，Si班抗體濃度越高。（Bloebaum 民 M et al，2004， Mechanisms of IgE-mediated allergic reactions， In :Lockey RF et al ed， Allergens and allergen immunotherapy， Marcel Dekker， Inc， New York， USA， PP65-84.)
[0003] 過敏性疾病的臨床診斷在美國臨床醫(yī)師實用指南中指出，根據(jù)患者病史結(jié)合 點刺或血液檢測過敏原特異性I班（Si班）抗體濃度，篩查致病過敏原（Siles R I， Hsieh F H, Allergy blood testing：A practical guide for clinicians. Am Clin J Medicine. 2011 ;78 :585-592.)。目前，檢測血液中過敏原特異性I班（si班）抗體濃度， 篩查致病過敏原的方法有酶免疫法（EIA)、免疫印跡法（Immunoblotting Assay)、膠體金 側(cè)流層析法化FA)、蛋白芯片法（Proteins microarray)等，發(fā)展趨勢并符合市場要求的 是：自動化、快速、準確、樣品用量少，一次篩查幾十種過敏原。市場上產(chǎn)品不少，其中，瑞 典Pharmacia公司產(chǎn)品ImmunoCAP250系統(tǒng)是酶免疫法的代表，ImmunoCAP Rapid是膠體金 側(cè)流層析法的代表，ImmunoCAP ISAC是蛋白芯片法的代表，開創(chuàng)了過敏原分子診斷；而德 國Mediwiss-anal}ftic公司的AllergyScreen則是免疫印跡法的代表（AIIeisaScreen飯 Immunoblot for analysing specific IgE in human serum)。因人血液中 IgE 抗體平均 濃度?0. 00加g/ml，是總免疫球蛋白平均濃度的0. 002%，Si班抗體濃度更低，為滿足自動 化、快速、準確、樣品用量少，一次篩查幾十種過敏原，半定量或定量檢測樣品中的過敏原特 異性I班（Si班）抗體濃度的要求，必須配置光電信號放大的檢測儀，或生物化學方法的信 號放大系統(tǒng)。如，瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品ImmunoCAP Rapid -次只能篩查十來種過敏原， 不配閱讀儀，肉眼判讀Si班抗體濃度的靈敏度只有l(wèi).OIU/ml (1IU I班=2.44ngl班），用 1. 49IU/ml區(qū)分陰性和陽性結(jié)果。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種使用生物化學方法的信號放大系統(tǒng)(雙生物素-鏈霉親和 素和多聚酶的二級信號放大系統(tǒng)）來高靈敏地檢測過敏原特異性抗體I班的檢測試劑盒及 檢測方法，用W定性或半定量地快速檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體I班濃度， 并可一次篩查數(shù)十種過敏原。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體I班的試劑盒，主要包括；固化有待測過敏原 蛋白的纖維材料膜，雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體(可市購獲 得，使用時用抑7. 4的含0. 05%Tween20的PBS配制成濃度1 ; 100?10000的工作液)，生 物素或鏈霉親和素標記的多聚酶(可市購獲得，使用時用酶緩沖液配制成濃度1 :5000? 50000的工作液)，W及與所述多聚酶對應的底物顯色劑(可市購獲得，也可自行配制）；所述 雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液為雙生物素：鏈霉親和素摩爾濃度比24?39 ; 18的混合物溶 液，所述人I班抗體為羊抗人I班抗體或兔抗人I班抗體，所述多聚酶為多聚堿性磯酸酶或 多聚辣根過氧化物酶。上述為試劑的主要成分，不包含檢測所用的常規(guī)試劑如稀釋液、洗涂 液等。
[0007] 所述雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液可按如下方法配制：
[0008] (1)將雙生物素溶解在己醇/二甲基亞諷（85/15, V/V)溶液中，制得濃度為 1. Immol/L 得 A 液；
[0009] (2)用0. 05mol/L的PBS配制1. Omg/mL的鏈霉親和素溶液，得B液；
[0010] (3)在劇烈旋潤下，按照其摩爾比，緩緩將A液加入B液內(nèi)，即得所述雙生物素-鏈 霉親和素優(yōu)化液。
[0011] 優(yōu)化液中雙生物素分子和鏈霉親和素分子混合的比例可為12 ;9、7 ;6、19 ;9、13 ;6 等，見圖1和圖2所示。
[0012] 優(yōu)選的，所述纖維材料膜可固置于反應槽的加液孔中，將該反應槽直接作為試劑 盒成分。所述反應槽可如圖4所示。
[0013] 所述纖維材料膜為硝酸纖維素膜，混合纖維素醋膜或者多孔PVF膜等(可市購獲 得)，具有足夠抗彎曲和抗折皺機械強度，固化待測過敏原蛋白后固置于反應槽內(nèi)。纖維材 料膜隨需固化的過敏原蛋白不同，可分別采用漠化膳、戊二酵、駿基變性、氨基變性、氯甲基 變性等方法活化纖維材料膜，使之能共價結(jié)合足量（0. 2?2. Oug)的相應的過敏原蛋白，W 便能充分結(jié)合樣品液中的Si班抗體，確保檢測結(jié)果的準確性。
[0014] 所述過敏原蛋白可按常規(guī)方法從下列天然原材料中提取，包括：植物花粉類(樹花 粉類、草花粉類及野草花粉類等）過敏原；霉菌類過敏原；動物皮屑類過敏原；昆蟲類過敏 原；植物食物類(包括水果類、蔬菜類、堅果類、食用菌類及谷物類）過敏原和動物食物類(包 括肉類、禽蛋類、魚和甲殼類及奶類）過敏原等。
[0015] 本發(fā)明的檢測試劑同時使用生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體捕獲劑溶液，雙生物 素-鏈霉親和素優(yōu)化液和溶液，既具雙生物素-鏈霉親和素的生物放大系統(tǒng)，又具多聚 酶-顯色放大作用，極大提高檢測靈敏度，見圖3所示意。
[0016] 所述多聚酶為多聚堿性磯酸酶時，對應的顯色劑為硝基四氮哇蘭和 5-漠-4-氯-3-日引巧磯酸的混合物（NBT/BCIP，Nit;roblueTetrazolium/5-B;romo-4-chlor o-3-Indolyl Phosphate),或?qū)κせ桨罚╬-nitrophenyl phosphate)。
[0017] 所述多聚酶為多聚辣根過氧化物酶時，對應的顯色劑為3,3'，5,5' -四甲基聯(lián)苯 胺（TMB, Tetramethy化enzidine),或鄰苯二胺（O-Phenylenediamine),或聯(lián)苯二胺（DAB, 3, 3' -diaminobenzidine tetr址y化ochloride)和底物過氧化尿素。
[0018] 本發(fā)明還涉及利用所述試劑盒高通量檢測過敏原特異性抗體I班的方法，所述方 法包括如下順序步驟：
[0019] (1)取加液孔內(nèi)固置有固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜的反應槽，室溫下水 平放置，備用；
[0020] (2)將200?400 U L血清或血漿加入1?2血樣品稀釋液中，混勻后加入反應槽 的加液孔內(nèi)，將反應槽置于混勻器上，室溫賠育30?60分鐘；
[0021] (3)用洗涂液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30砂；
[002引（4)將200?400 y L生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體工作液加入1?2血樣品稀釋液 中，混勻后加入反應槽內(nèi)，置于混勻器上室溫賠育30?60分鐘；
[002引（5)用洗涂液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30砂；
[0024] (6)在反應槽內(nèi)加入1?3ml雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，置于混勻器上室溫賠 育10?20分鐘；
[002引（7)用洗涂液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30砂；
[0026] (8)在反應槽內(nèi)加入1?3ml生物素或鏈霉親和素標記的的多聚堿性磯酸酶工作 液，置于混勻器上室溫賠育10?30分鐘；
[0027] (9)用洗涂液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30砂；
[0028] (10)在反應槽內(nèi)加入1?2ml稀釋的底物顯色劑溶液，置于混勻器上室溫賠育 10?20分鐘；
[0029] ( 11)流水沖洗終止酶反應；
[0030] (12)將反應槽與比色卡比對判讀，或者用閱讀儀進行判讀。
[0031] 所述比色卡依據(jù)國際通用的血清中特異性抗體I班濃度0?6級分級方法制作， 形式可W是長條形、正方形、H角形及圓形等。顏色隨顯色劑不同，可W是黃色、蘭色和黑色 等，但色彩的強度必須與國際通用的血清中特異性抗體I班濃度0?6級要求一致。
[0032] 按照本發(fā)明方法，采用比色卡或不用帶數(shù)據(jù)處理功能的閱讀儀，根據(jù)操作步驟操 作，就可方便地用肉眼定性或半定量地判讀檢測人血清或血漿中的多個過敏原特異性I班 抗體水平；使用帶數(shù)據(jù)處理功能的閱讀儀，可定量地檢測人血清或血漿中的多個過敏原特 異性I班抗體濃度。
[0033] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在；本發(fā)明試劑盒可高靈敏地定性或半定量地快速 檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體I班濃度，并可一次篩查數(shù)十種過敏原，快速、準 確、樣品用量少，適宜進行高通量檢測。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為供生物素標記的多聚酶鍵合的雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液中雙生物素分 子與鏈霉親和素分子結(jié)合方式的示意圖；圖中X表示鏈霉親和素；--表示雙生物素；
[00巧]圖2為供鏈霉親和素標記的多聚酶鍵合的雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液中雙生 物素分子與鏈霉親和素分子結(jié)合方式的示意圖；圖中X表示鏈霉親和素；W表示雙生物 素；
[0036] 圖3為雙生物素-鏈霉親和素和多聚酶-顯色劑的二級信號放大系統(tǒng)示意圖（A) 和未使用生物化學方法的信號放大系統(tǒng)示意圖（B);
[0037] 圖中A表示結(jié)合于纖維素膜的過敏原蛋白；艾表示過敏原Si班抗體；；^表示生 物素標記的抗體；X表示鏈霉親和素；^表示雙生物素；Y表示生物素標記的多聚堿性 磯酸酶；表示鏈霉親和素標記的堿性磯酸酶；M表示顯色信號；A和B示圖比較，A較B信 號放大35倍。
[0038] 圖4為試劑所用反應槽結(jié)構(gòu)示意圖。 (五）

【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0040] 實施例1 ;本發(fā)明的檢測試劑制備
[0041] 1.硝酸纖維素膜固化(共價結(jié)合）過敏原蛋白（參考化rmanson GT et al， Immunobilized affinity ligand techniques. Academic Press (New York),1992, pp53-56.)
[0042] ( I)硝酸纖維素膜條活化
[0043] A.戴好安全防護設備后在通風柜中配制濃度為Img/ml的CNBr (美國 Sigmaal化ich公司，C91492)己膳溶液；
[0044] B.將切割好的硝酸纖維素膜(美國Bio-Rad公司，162-0112)息浮于Imol/L、抑11 的化2〇)3溶液中，轉(zhuǎn)移入帶攬拌子的玻璃燒杯中，然后平放在通風柜中磁攬拌器板上；
[004引 C.邊攬拌，邊加入CNBr溶液；攬拌10分鐘，其間每隔2分鐘用的抑8 W上的精密 抑試紙測溶液的抑值；如必要，用化OH溶液調(diào)節(jié)活化液的抑為11 ;
[0046] D.將活化液中的硝酸纖維素膜條轉(zhuǎn)移入帶砂芯的玻璃漏斗，真空抽濾除去CNBr 溶液(在2%FeS04溶液里）；
[0047] E.用IOOml (1化0洗涂后，再用20ml90%的丙麗溶液洗涂；最后用IOOml pH7. 5的 磯酸軸緩沖液重復5次清洗后真空干燥，待用。
[004引（2)過敏原蛋白固化
[004引 A.將經(jīng)透析純化的過敏原蛋白用0. Imol/L，抑7. 4的PBS配巧喊適合的濃度巧口： 植物花粉類過敏原蛋白；0. 1?7. Omg/ml ;霉菌類過敏原蛋白；2. 0?5. Omg/ml ;動物皮屑 類過敏原蛋白；0. 05?3. Omg/ml ;植物食物類過敏原蛋白；1. O?8. Omg/ml ;動物食物類過 敏原蛋白；1. 5?10. Omg/ml ;昆蟲類過敏原蛋白；0. 1?3. Omg/ml等）備用；
[0050] B.轉(zhuǎn)移CNBr活化的硝酸纖維素膜條入50ml的過敏原蛋白溶液內(nèi)，4°C下在搖床上 緩慢地混合反應過夜（16小時W上）；
[0051] C.上述反應混合液4C下IOOOrpm離也10分鐘；測出上清液的過敏原蛋白濃度， 使固化的過敏原蛋白達85% W上；
[0052] D.加入40ml PBS，使纖維素膜條重息浮，然后4°C下IOOOrpm離也10分鐘；重復一 次；
[0053] E.用0. Imol/L，抑7. 5的己醇胺溶液40ml使纖維素膜條重息浮，室溫下在搖床上 緩慢地清洗4小時；
[0054] F.再用PBS重復洗S次，離也；再加入1〇/〇防腐齊U BND (5-Brom〇-5-Nitr〇-l， 3-Dioxane)溶液混勻反應1小時后真空干燥，待用。
[00巧]2.固化有過敏原蛋白的纖維材料膜裝反應槽
[0056] 識別過敏原蛋白的標識及硝酸纖維素膜條上下面后，膜上表面朝上，將固化有過 敏原蛋白的硝酸纖維素膜條裝入反應槽標識有相應過敏原蛋白的小孔內(nèi)，并蓋膜。
[0057] 3.生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體溶液配制
[0058] 生物素偶聯(lián)的鼠抗人I班抗體(美國Life Technologies公司，05-4740)，使用時 用抑7. 4的含0. 05%Tween20的PBS配制成濃度1 ;100?10000的工作液。
[0059] 4.雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液制備
[0060] A.將雙生物素（美國Pierce化emical公司，IL40)溶解在己醇/二甲基亞諷 (85/15, V/V)溶液中，制得濃度為1. Immol/L ;
[006U B.用0. 05mol/L的PBS配制I. Omg/ml的鏈霉親和素（美國Sigmaal化ich公司， 85878)溶液；然后在劇烈旋潤下按照雙生物素和鏈霉親和素摩爾濃度比例為24?39 ;18， 緩緩加雙生物素溶液入鏈霉親和素溶液內(nèi)；取出少數(shù)測出該優(yōu)化液的雙生物素：鏈霉親和 素位點比為0. 8?0. 85。
[0062] 5.生物素標記的多聚堿性磯酸酶溶液配制
[0063] 用酶緩沖液（5mmol/L Tris-HCl, pH9. 3, Immol/L MgCl], 0. lmmoVLSiClg, Immol/L 精氨酸及防腐劑1%BND)將生物素標記的多聚堿性磯酸酶(美國B化公司，BPA20,聚合度20) 配制成濃度1 :5000?50000的工作液。
[0064] 注；使用該多聚堿性磯酸酶溶液較一般堿性磯酸酶溶液可放大近100倍。
[0065] 6.堿性磯酸酶的底物顯色劑溶液配制
[0066] 用IOml Ck町0避光溶解堿性磯酸酶的底物顯色劑（BCIP/NBT)(美國SigmaaWrich 公司，B5655-5t油），該溶液含0. 15mg/ml BCIP (5-漠-4-氯-3-巧隙基-磯酸鹽)，0. 3mg/ ml NBT (四哇硝基藍），0. Imol/L 抑?9. 5Tris buffer 和 5mmol/L MgCla。
[0067] 上述配制的溶液，裝有固化過敏原蛋白的纖維材料膜條的反應槽及常規(guī)試劑如稀 釋液、洗涂液等構(gòu)成了本發(fā)明的檢測試劑。
[0068] 實施例2 (未使用生物化學方法的信號放大系統(tǒng)）；
[0069] 檢測試劑配制參見實施例1 (不包括無雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液及生物素標 記的多聚堿性磯酸酶溶液)。
[0070] 檢測方法如下：
[0071] (1)預處理：取出實驗所需檢測反應槽(結(jié)構(gòu)參見圖3,小孔內(nèi)已裝有固化有待測 過敏原蛋白的纖維材料膜)，室溫下水平放置，編號或標記患者姓名；
[0072] (2)初次賠育：將300微升血清加入1. 7ml樣品稀釋液（pH7. 4的PBS+10%新生牛 血清)內(nèi)混勻，倒入移去蓋膜的反應槽中，將反應槽置于混勻器上，室溫（20?25°C)賠育45 分鐘。
[0073] (3)清洗；用洗涂液（pH7. 4的PBS+0. 05%吐溫-20)沖洗液反應槽，重復清洗5次， 每次10砂鐘；沖洗時，使洗涂液充分流過反應槽。注意傾倒洗涂液時讓液體順著反應槽流 下，避免交叉污染。
[0074] (4)第二次賠育；加6滴(約300微升)生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體工作液(溶劑為 pH7. 4的PBS，濃度1 :10000)入1. 7ml抗體稀釋液中混勻，倒入反應槽中，將反應槽置于混 勻器上室溫（20?25 to賠育45分鐘。
[00巧](5)清洗；過程同步驟（3)。
[0076] (6)第H次賠育：在反應槽內(nèi)加入2. Oml鏈霉親和素標記的堿性磯酸酶工作液(溶 劑為pH9. 2的TBS，1 ;500)，置于混勻器上室溫（20?25°C)賠育20分鐘。
[0077] (7)清洗；過程同步驟（3)。
[0078] (8)第四次賠育；在反應槽內(nèi)加入2. Oml的NBT/BCIP底物顯色液，置于混勻器上 室溫（20?25°C)賠育15分鐘。
[0079] (9)終止反應：流水沖洗終止酶反應。
[0080] (10)讀數(shù)；將反應槽與比色卡比對判讀。半定量地判讀記錄檢測的人血清樣品中 的多個過敏原特異性I班抗體水平，結(jié)果例見表1。
[0081] 實施例3 (應用雙生物素-鏈霉親和素和多聚酶的二級信號放大系統(tǒng)）；
[0082] 檢測試劑配制參見實施例1。
[008引檢測方法如下：
[0084] (1)預處理：取出實驗所需檢測反應槽(結(jié)構(gòu)參見圖3,小孔內(nèi)已裝有固化有待測 過敏原蛋白的纖維材料膜)，室溫下水平放置，編號或標記患者姓名；
[00財 （2)初次賠育：將300微升血清加入1. 7ml樣品稀釋液（pH7. 4的PBS+10%新生牛 血清)內(nèi)混勻，倒入移去蓋膜的反應槽中，將反應槽置于混勻器上，室溫（20?25°C)賠育45 分鐘。
[0086] (3)清洗；用洗涂液（pH7. 4的PBS+0. 05%吐溫-20)沖洗液反應槽，重復清洗5次， 每次10砂鐘；沖洗時，使洗涂液充分流過反應槽。注意傾倒洗涂液時讓液體順著反應槽流 下，避免交叉污染。
[0087] (4)第二次賠育；加6滴(約300微升)生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體工作液(溶劑為 pH7. 4的PBS，濃度1 :10000)入1. 7ml抗體稀釋液中混勻，倒入反應槽中，將反應槽置于混 勻器上室溫（20?25 to賠育45分鐘。
[0088] (5)清洗；過程同步驟（3)。
[0089] (6)第H次賠育：在反應槽內(nèi)加入2. Oml雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液(雙生物素 和鏈霉親和素摩爾濃度比例為30 ;18)，置于混勻器上室溫（20?25°C)賠育15分鐘。
[0090] (7)清洗；過程同步驟（3)。
[0091] (8)第四次賠育；在反應槽內(nèi)加入2. Oml生物素標記的多聚堿性磯酸酶工作液(溶 劑為pH9. 5的TBS，1 ;5000)，置于混勻器上室溫（20?25°C)賠育20分鐘。
[0092] (9)清洗；過程同步驟（3)。
[009引（10)第五次賠育；在反應槽內(nèi)加入2. Oml的NBT/BCIP底物顯色液，置于混勻器上 室溫（20?25°C)賠育15分鐘。
[0094] (11)終止反應：流水沖洗終止酶反應。
[0095] (12)讀數(shù)；將反應槽與比色卡比對判讀。半定量地判讀記錄檢測的人血清樣品中 的多個過敏原特異性I班抗體水平，結(jié)果例見表1。
[0096] 同時應用雙生物素-鏈霉親和素和多聚酶的二級信號放大系統(tǒng)(實施例3)和未使 用生物化學方法的信號放大系統(tǒng)(實施例2)實驗檢測同一份患者血淸樣本中的過敏原特異 性I班抗體水平，檢測結(jié)果列于表1，W便比較。
[0097] 表1 ;血淸樣本中的過敏原特異性I班抗體水平兩種系統(tǒng)檢測結(jié)果的比較
[0098]

【權(quán)利要求】
1. 一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒，主要包括：固化有待測過敏原蛋 白的纖維材料膜，雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，生物素或鏈 霉親和素標記的多聚酶，以及與所述多聚酶對應的底物顯色劑；所述雙生物素-鏈霉親和 素優(yōu)化液為雙生物素：鏈霉親和素摩爾濃度比24?39:18的混合物溶液，所述人IgE抗體 為羊抗人IgE抗體或兔抗人IgE抗體，所述多聚酶為多聚堿性磷酸酶或多聚辣根過氧化物 酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述纖維材料膜固置于反應槽的加液孔 中。
3. 利用權(quán)利要求1或2所述試劑盒高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的方法，所述方 法包括如下順序步驟： (1) 取加液孔內(nèi)固置有固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜的反應槽，室溫下水平放 置賃備用； (2) 將200?400 μ L血清或血漿加入1?2mL樣品稀釋液中，混勻后加入反應槽的加 液孔內(nèi)，將反應槽置于混勻器上，室溫孵育30?60分鐘； (3) 用洗滌液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30秒； (4) 將200?400 μ L生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體工作液加入1?2mL樣品稀釋液中， 混勻后加入反應槽內(nèi)，置于混勻器上室溫孵育30?60分鐘； (5) 用洗滌液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30秒； (6) 在反應槽內(nèi)加入1?3ml雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，置于混勻器上室溫孵育 10?20分鐘； (7) 用洗滌液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30秒； (8) 在反應槽內(nèi)加入1?3ml生物素或鏈霉親和素標記的的多聚堿性磷酸酶工作液，置 于混勻器上室溫孵育10?30分鐘； (9) 用洗滌液沖洗液反應槽，重復清洗3?5次，每次10?30秒； (10) 在反應槽內(nèi)加入1?2ml稀釋的底物顯色劑溶液，置于混勻器上室溫孵育10? 20分鐘； (11) 流水沖洗終止酶反應； (12) 將反應槽與比色卡比對判讀，或者用閱讀儀進行判讀。
【文檔編號】G01N33/68GK104237527SQ201410099290
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】臧榮春, 吳善東 申請人:杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司