用于確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性以及確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的方法以及一種確立患者敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的方法，其中：a.從患者獲得生物樣品，并從所述生物樣品提取生物材料，b.制備對至少一種靶基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的至少一種試劑，所述靶基因選自S100A9和S100A8靶基因；c.測定靶基因S100A9和S100A8中至少一種的表達(dá)，相對于指定閾值的過表達(dá)是發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的指征和敗血性綜合征進(jìn)展的較差預(yù)后的指征。
【專利說明】用于確定患者發(fā)生醫(yī)卩元內(nèi)感染的易感性以及確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的方法
本申請為申請日為2010年I月18日、申請?zhí)枮?01080004721.X、發(fā)明名稱為“用于確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性以及確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及一種確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的方法。本發(fā)明還涉及一種確立患者的敗血性休克進(jìn)展的預(yù)后的方法。
醫(yī)院內(nèi)感染構(gòu)成真正的公共衛(wèi)生問題。在法國，每年發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的患者數(shù)目據(jù)估計(jì)為500,000到800,000。醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生與多種因素有關(guān)，諸如使用的醫(yī)療技術(shù)，以及患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性。因此，患有免疫系統(tǒng)缺陷的患者，營養(yǎng)不良的人，嬰兒，老年人，患敗血性綜合征的人，大面積燒傷患者，以及處于創(chuàng)傷狀態(tài)的人可能比其他人更容易發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染。
敗血性綜合征(對感染的全身應(yīng)答)代表了重癥監(jiān)護(hù)室的一種主要死亡原因。它可以源于細(xì)菌，病毒，真菌病或寄生蟲感染?？梢园凑账鼈兊膰?yán)重性將敗血性綜合征分類。下面按照增加的嚴(yán)重性區(qū)分=SIRS (全身性炎性應(yīng)答綜合征)，敗血癥，嚴(yán)重?cái)⊙Y和敗血性休克。因此，在2001 年，專家組提出了確定這4種臨床綜合征的標(biāo)準(zhǔn)[1]:
?SIRS是多種感染性或非感染性原因引發(fā)的炎性全身性應(yīng)答。在非感染性原因引發(fā)的SIRS狀態(tài)中，我們可以提及創(chuàng)傷狀態(tài)，燒傷，胰腺炎，和急性呼吸綜合征。炎性全身性應(yīng)答顯示為下列癥狀的至少兩種:a)體溫高于38°C或低于36°C ；b)心率高于90次搏動每分鐘；c)呼吸頻率高于20次呼吸每分鐘；d)白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于12000/mm3或低于4000/mm3，
?敗血癥是與感染有關(guān)的炎性全身性應(yīng)答綜合征，
?嚴(yán)重?cái)⊙Y是與低動脈壓和/或灌注不足和/或至少一種器官的功能異常有關(guān)的敗血癥，
?敗血性休克是與長期低血壓有關(guān)的嚴(yán)重?cái)⊙Y，可由以下確定:
?被鑒定的感染部位的存在，
?盡管足夠的灌注并用血管升壓藥治療，仍長期低血壓。通常，敗血癥、嚴(yán)重?cái)⊙Y和敗血性休克的癥狀是非常類似的，這3種情況的差異主要在于所有生活機(jī)能紊亂的水平。在敗血性休克期間，我們主要觀察到血壓降低，心動過速，呼吸急促，皮膚的紋理化，體溫過低或體溫過高，顫抖。這些癥狀還伴有“靶”器官的功能異常，以及遠(yuǎn)離感染病灶的器官(腎，肺，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，消化系統(tǒng)和凝血系統(tǒng))的功能惡化，反映在少尿(〈0.5ml/kg/h)，腎功能不全，低氧血，血小板減少，激動和精神混亂。
敗血性綜合征患者對于醫(yī)院內(nèi)感染(即與待在衛(wèi)生機(jī)構(gòu)有關(guān)的感染)多多少少也是敏感的。這種敏感性對于這些患者的存活和良好恢復(fù)具有相當(dāng)大的影響。
敗血性綜合征從敗血癥階段進(jìn)展到嚴(yán)重?cái)⊙Y階段，然后到敗血性休克階段不是系統(tǒng)性的，因?yàn)榧s64%的敗血癥患者發(fā)展成為嚴(yán)重?cái)⊙Y，23 %的嚴(yán)重?cái)⊙Y患者進(jìn)展到敗血性休克。在敗血性休克這個最終階段之前，必須對患者進(jìn)行治療，以便終止并逆轉(zhuǎn)病理生理過程。因此，必須恢復(fù)令人滿意的血液動力學(xué)狀態(tài)，并且必須提供有效通氣量。還必須有同時的休克對癥療法和盡可能基于細(xì)菌學(xué)數(shù)據(jù)的抗生素治療。
看起來盡管可以通過標(biāo)準(zhǔn)控制(諸如在獲得表明感染源的細(xì)菌學(xué)分析結(jié)果之前進(jìn)行廣譜抗生素治療)使一些敗血性綜合征(尤其是敗血性休克)患者恢復(fù)，但是其他患者(患有更加嚴(yán)重的敗血性綜合征)需要實(shí)施強(qiáng)化療法，諸如活化的蛋白C。除了非常高的花費(fèi)外，這種療法將患者置于嚴(yán)重不良作用(凝血病癥等等)的風(fēng)險中。因此有效靶向很可能受益于這類治療的患者是非常重要的。
因此，了解炎性全身性應(yīng)答的病因?qū)W和確定炎性全身性應(yīng)答患者對發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性對于建議適于患者的治療來說是非常重要的。對于患者來說非常重要的另一個因素是能夠盡早確立敗血性休克進(jìn)展的預(yù)后。
迄今為止，還沒有確定患者患上醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的檢測，尤其是針對炎性全身性應(yīng)答的患者，而無論所述炎性全身性應(yīng)答是否與感染有關(guān)。本發(fā)明人出乎意料地證實(shí)，基因S100A9和/或S100A8的表達(dá)分析尤其適于確定所述易感性，此外它適合于確立敗血性休克進(jìn)展的預(yù)后。
在下一步之前，給出下列定義用于更好的理解本發(fā)明。
敗血件綜合征表示對感染的全身應(yīng)答。這種敗血性綜合征可以處于SIRS，敗血癥，嚴(yán)重?cái)⊙Y或敗血性休克的階段。優(yōu)選地,敗血性綜合征是敗血性休克。
醫(yī)院內(nèi)感染表示在患者在衛(wèi)牛機(jī)構(gòu)入院時不存在佰在入院后48小時在所述機(jī)構(gòu)發(fā)生的任何感染。
術(shù)語靶某閔表示S100A9基因和S100A8基因，尤其是參考GenBank中登錄號為NM002965.3的S100A9基因和參考GenBank中登錄號為NM002964.3的S100A8基因。
S100A9基因和S100A8某閔的表汰產(chǎn)物表示信伸RNA或mRNA的片段，cDNA或cDNA的片段，蛋白或蛋白片段。
生物樣品表示獲自患者的任何材料，其可能含有能夠檢測基因表達(dá)的生物材料。它尤其可以是患者的血液，血清，唾液或組織或循環(huán)細(xì)胞的樣品。這類生物樣品可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何取樣方式獲得，諸如尤其是血液樣品。
生物材料表示能夠檢測基因表達(dá)的任何材料，諸如尤其是核酸或蛋白，或其編碼序列。核酸可以尤其是RNA (核糖核酸)諸如mRNA (信使RNA)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，生物材料是核酸，甚至更優(yōu)選是mRNA。
從生物樣品提取生物材料可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的提取核酸或蛋白的所有方案來實(shí)施。
作為指導(dǎo)，核酸可以尤其是通過以下步驟提取:
?生物樣品中存在的細(xì)胞的裂解階段，以便釋放微生物的蛋白和/或脂質(zhì)包膜(作為干擾后續(xù)反應(yīng)的細(xì)胞碎片 )中包含的核酸。作為實(shí)例，有可能使用下列專利申請描述的裂解方法:
ο W0-A-00/05338,關(guān)于混合型磁性和機(jī)械裂解，
ο TO-A-99/53304，關(guān)于電裂解，和
ο W0-A-99/15321，關(guān)于機(jī)械裂解。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用公知的其他裂解方法，諸如熱或滲透壓休克或通過離液劑諸如胍鹽的化學(xué)裂解(US-A-5，234，809)。?純化階段，允許將核酸與裂解階段鹽析的其它細(xì)胞組分分離。這個階段通常能夠濃縮核酸。舉例來說，可以使用任選包被寡核苷酸(通過吸附或共價)的磁性顆粒(參考專利US-A-4，672，040和US-A-5，750，338)，從而通過洗滌階段純化與這些磁性顆粒附著的核酸。如果需要后續(xù)擴(kuò)增所述核酸，這個階段的核酸純化是尤其有益的。這些磁性顆粒的尤其感興趣的實(shí)施方案描述于專利申請W0-A-97/45202和W0-A-99/35500。核酸純化方法另一個感興趣的實(shí)例是使用柱形式或惰性顆粒M或磁性顆粒形式(Merck: MagPrep τ ΜSilica, Promega:MagneSilTM Paramagnetic顆粒)的二氧化娃。其他廣泛使用的方法基于柱或順磁微粒形式(Whatman:DEAE_Magarose)的離子交換樹脂(Levison PR et al.,J.Chromatography, 1998,p.337-344)。高度相關(guān)但非本發(fā)明專有的另一個方法是吸附到金屬氧化支持物(來自公司Xtrana Atra-Bind?基質(zhì))。這個提取階段可以在自動裝置中進(jìn)行。easyMAG?自動裝置是尤其合適的。
特異性試劑表示與生物材料反應(yīng)以直接或間接證實(shí)靶基因表達(dá)(其可以通過分析得自這些基因的mRNA或通過分析該基因編碼的蛋白來測定)的試劑。
作為指導(dǎo)，當(dāng)我們希望通過分析該基因編碼的蛋白來測定靶基因的表達(dá)時，這種特異性試劑包括對該靶基因編碼的蛋白特異的至少一種抗體。
作為指導(dǎo)，當(dāng)我們希望通過分析從該基因開始轉(zhuǎn)錄的mRNA來測定靶基因的表達(dá)時，這種特異性試劑包括對該mRNA的互補(bǔ)DNA特異的至少一種擴(kuò)增引物(它然后被稱作對靶基因特異的擴(kuò)增引物)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方案獲得與mRNA互補(bǔ)的DNA。作為指導(dǎo)，從生物樣品提取總RNA(包括核糖體RNA，轉(zhuǎn)移RNA，mRNA)。然后通過逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其能夠從RNA片段獲得DNA互補(bǔ)片段(cDNA)。這個階段的實(shí)施是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。當(dāng)我們更希望只獲得與信使RNA互補(bǔ)的DNA時，這種酶促階段是在只包括胸腺嘧啶堿基(PolyT)的核苷酸片段(其通過互補(bǔ)性與各種mRNA的polyA序列雜交以形成polyT-polyA復(fù)合物，其然后作為利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起點(diǎn))的條件下進(jìn)行。然后獲得各種DNA，它們與最初存在于生物樣品中的各種信使RNA互補(bǔ)。下文中，cDNA表示與信使RNA互補(bǔ)的DNA。
擴(kuò)增引物表示一種核苷酸片段，具有5到100個核苷酸單位，優(yōu)選15到25個核苷酸單位，并且在啟始酶促聚合的確定條件下(例如在酶促擴(kuò)增反應(yīng)中)具有雜交特異性。
酶擴(kuò)增反應(yīng)表示通過至少一種酶的作用借助特異性擴(kuò)增引物產(chǎn)生靶核苷酸片段的多個拷貝的過程。這些擴(kuò)增反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，我們特別提及的是下列技術(shù):PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，RCR(修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，利用專利申請W0-A-90/06995的3SR(自動維持序列擴(kuò)增)，NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)，和利用專利US-A-5, 399，491的TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)。
術(shù)語擴(kuò)增子則表示通過酶促擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的多核苷酸。優(yōu)選地，當(dāng)酶促擴(kuò)增是PCR時，特異性試劑包括至少2個特異性擴(kuò)增引物，以便擴(kuò)增與源于靶基因的mRNA互補(bǔ)的DNA特定區(qū)域。當(dāng)酶促擴(kuò)增是在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行的PCR時，其被稱作RT-PCR。
雜交探針表示包括5到100個核苷酸單位(尤其是6到35個核苷酸單位)的核苷酸片段，并在指定條件下具有雜交的特異性以形成與靶核苷酸片段的雜交復(fù)合物。在本發(fā)明中，靶核苷酸片段可以是信使RNA包括的核苷酸序列，或通過所述信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得的互補(bǔ)DNA包括的核苷酸序列。雜交表示在合適條件下，兩個核苷酸片段(諸如例如具有足夠互補(bǔ)序列的雜交探針和靶核苷酸片段)能夠形成具有穩(wěn)定和特異性氫鍵的雙鏈的過程。與多核苷酸“能夠雜交”的核苷酸片段是在雜交條件下(每種情況下可以采用已知的方式確定)可以與所述多核苷酸雜交的片段。雜交條件由嚴(yán)格性(即操作條件的嚴(yán)格性)確定。當(dāng)嚴(yán)格性增加時，雜交的特異性也隨之增加。嚴(yán)格性被定義為探針/靶雙鏈體的堿基組成以及兩個核酸之間的錯配程度的函數(shù)。嚴(yán)格性還可以是反應(yīng)參數(shù)(諸如雜交液中存在的離子物質(zhì)的濃度和類型，變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度)的函數(shù)。進(jìn)行雜交反應(yīng)的條件的嚴(yán)格性在很大程度上取決于使用的雜交探針。所有這些數(shù)據(jù)都是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的條件。通常，取決于使用的雜交探針的長度，雜交反應(yīng)的溫度為約20到701:，尤其是在濃度約0.5到IM的鹽溶液中為35到65°C。然后進(jìn)行雜交反應(yīng)的檢測階段。
檢遍表示通過物理方法的直接檢測，或借助于標(biāo)記物的檢測方法。存在許多檢測核酸的方法[4’5]。
標(biāo)記物表示能夠產(chǎn)生信號的示蹤物。這些示蹤物的非限制性列表包括例如通過比色法、熒光或者發(fā)光產(chǎn)生可檢測信號的酶，諸如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；生色團(tuán)諸如熒光、發(fā)光或者染色化合物；通過電子顯微鏡檢查或者從它們的電性質(zhì)諸如電導(dǎo)率，通過電流分析法或伏安法，或通過阻抗測量可檢測的電子密度基團(tuán)；通過光學(xué)法(諸如衍射，表面等離子體共振，接觸角變化)或通過物理方法(諸如原子力光譜法，隧 道效應(yīng)等)可檢測的那些基團(tuán)；放射性分子諸如32p，35s*125i。因此，可以在酶促擴(kuò)增階段期間標(biāo)記多核苷酸，例如使用三磷酸核苷酸標(biāo)記用于擴(kuò)增反應(yīng)。標(biāo)記的核苷酸將是產(chǎn)生DNA的擴(kuò)增系統(tǒng)(諸如PCR)中的脫氧核糖核苷酸，或產(chǎn)生RNA的擴(kuò)增技術(shù)(諸如TMA或NASBA技術(shù))中的核糖核苷酸。還可以在擴(kuò)增階段后標(biāo)記多核苷酸，例如按照文獻(xiàn)WO-A-91/19812描述的夾心雜交技術(shù)通過雜交標(biāo)記的探針進(jìn)行。
就本發(fā)明來說，雜交探針可以是所謂的捕獲探針。在這種情況下，靶核苷酸片段可以事先通過標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。所謂的捕獲探針可以通過任何合適的方法被固定在(immobilis6e)或可固定在(immobiIisable)固相支持物上，即直接或間接地,例如通過共價結(jié)合或者吸附。然后在所述檢測探針和標(biāo)記的靶核苷酸片段之間進(jìn)行雜交反應(yīng)。
雜交探針還可以是所謂的檢測探針。在這種情況下，雜交探針可以通過標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。然后在所述捕獲探針和標(biāo)記的靶核苷酸片段之間進(jìn)行雜交反應(yīng)。
無論使用所謂的捕獲探針還是所謂的檢測探針，可以在固相支持物(包括其上固定核酸的所有材料)上進(jìn)行雜交反應(yīng)。合成材料或天然材料，任選化學(xué)修飾的，可以用作固相支持物，尤其是多糖諸如基于纖維素的材料，例如紙張，纖維素衍生物諸如醋酸纖維素和硝酸纖維素或葡聚糖，聚合物，共聚物，尤其是基于苯乙烯類型的單體的，天然纖維諸如棉花，和合成纖維諸如尼龍；礦物質(zhì)材料諸如二氧化硅，石英，玻璃，陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金屬衍生物，凝膠等。固相支持物可以是以下形式:微量滴定板，如申請W0-A-94/12670描述的膜，顆?；蛏镄酒?br> 在本發(fā)明中，可以通過給定時間轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達(dá)來分析S100A9某閔和S100A8某閔的表達(dá)測定。在這種情況下，生物材料是核酸，并且特異性試劑可以無區(qū)別的是如前所述的擴(kuò)增引物或雜交探針。
靶基因的表達(dá)可以如下確定:1)從生物樣品提取總RNA后，如前所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄階段，以便獲得與生物樣品中最初存在的各種信使RNA互補(bǔ)的各種DNA (或cDNA)
2)特異性擴(kuò)增cDNA。在這種情況下，使用的特異性試劑包括至少一個如前所述的對靶基因特異的擴(kuò)增引物。尤其可以通過PCR類型的擴(kuò)增反應(yīng)或通過任何其他合適的擴(kuò)增技術(shù)來進(jìn)行這個階段。
3)通過定量cDNA來測定靶基因的表達(dá)。尤其可以通過使用進(jìn)行到飽和的擴(kuò)增反應(yīng)獲得的量化范圍來定量cDNA?？紤]到不同階段(逆轉(zhuǎn)錄，PCR等)觀察到的酶促效力的變化，可以通過同時測定所謂的持家基因(其表達(dá)在不同組的患者中是相似的)的表達(dá)來將不同組患者的靶基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。通過測定靶基因表達(dá)與持家基因表達(dá)的比值，可以校正不同實(shí)驗(yàn)之間的任何變異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員尤其可以參考下列出版物[6’7]。
靶基因的表達(dá)還 可以如下確定:
1)從生物樣品提取總RNA后，如前所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄階段，以便獲得與生物樣品中最初存在的各種信使RNA互補(bǔ)的各種DNA (或cDNA)
2)將cDNA固定到膜上
3)通過將cDNA與先前標(biāo)記的對靶基因特異的雜交探針進(jìn)行雜交來測定靶基因的表達(dá)。這些雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，我們尤其提及的是Northern印跡。尤其當(dāng)基因是弱表達(dá)時，在與靶基因的信使RNA互補(bǔ)的DNA的特異性擴(kuò)增階段后進(jìn)行這種雜交反應(yīng)。
靶基因的表達(dá)還可以通過靶基因編碼的蛋白的表達(dá)來分析。在這種情況下，生物材料是蛋白，可以使用需要或無需配體的數(shù)種檢測技術(shù)。質(zhì)譜可以用作無需配體的檢測技術(shù)。特異性試劑可以是用于需要配體的檢測系統(tǒng)中對靶基因編碼的蛋白特異的抗體。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，從原核生物體(諸如細(xì)菌)，或真核生物體(諸如酵母，哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或動物細(xì)胞)，或通過胞外生成系統(tǒng)，獲得重組抗體(對靶基因翻譯的蛋白特異)。
單克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)制備，諸如雜交瘤技術(shù)，其一般原理在下文回顧。
首先，用感興趣的靶抗原免疫動物，通常是小鼠(或體外免疫范圍內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞)，其B淋巴細(xì)胞然后能夠產(chǎn)生針對所述抗原的抗體。然后將這些抗體生成淋巴細(xì)胞與“永生化的”骨髓瘤細(xì)胞(實(shí)施例中是鼠的)融合以產(chǎn)生雜交瘤。從獲得的細(xì)胞的異質(zhì)混合物，然后挑選能夠產(chǎn)生特定抗體并且能無限增殖的細(xì)胞。每個雜交瘤以克隆形式增殖，均引起單克隆抗體的產(chǎn)生，例如可以通過ELISA，一維或二維免疫轉(zhuǎn)移，免疫熒光或生物傳感器來檢測對感興趣抗原的識別特性。然后純化(尤其是通過親和層析)如此挑選的單克隆抗體。
例如可以通過蛋白水解獲得抗體片段。因此，它們可以通過酶促消化獲得，產(chǎn)生Fab型(用木瓜蛋白酶處理[8])或F(ab)' 2型(用胃蛋白酶處理[9])的片段。它們還可以通過重組方法制備[1 °]。另一種適于本發(fā)明目的的抗體片段包括Fv片段，其是由Fab片段的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)和可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)的非共價結(jié)合(因此是兩條多肽鏈的結(jié)合)組成的二聚體。為了提高由于兩條多肽鏈的解離造成的Fv片段的穩(wěn)定性，可以通過在結(jié)構(gòu)域VL和結(jié)構(gòu)域VH之間插入合適的肽鍵進(jìn)行遺傳工程化來修飾這種Fv片段[11]。然后這被稱作scFv( “單鏈片段可變”)，因?yàn)槠溆蓡我欢嚯逆溄M成。優(yōu)選由15到25個氨基酸組成的肽鍵的使用能夠?qū)⒔Y(jié)構(gòu)域的C端連接到其他結(jié)構(gòu)域的N端，從而構(gòu)成具有類似于抗體完整形式的結(jié)合特性的單體分子。VL和VH結(jié)構(gòu)域的兩種排列方向都是合適的(VL-連接-VH和VH-連接-VL)，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗤墓δ芴匦?。?dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且具有上文所述的免疫特征的任何片段都適合于本發(fā)明的目的。
當(dāng)生物材料是由基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白時，后者的表達(dá)可以通過檢測和/或定量所述蛋白來測定，通過Western印跡或ELISA,或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法，諸如基于生物材料的化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行。
ELISA技術(shù)("酶聯(lián)免疫吸附測定")是固相支持物上的免疫酶促測定法。這種檢測屬于EIA("酶免疫測定")的更普通范圍，其中測定與酶催化反應(yīng)偶聯(lián)。該技術(shù)使用一種或兩種抗體。將用于檢測免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的抗體與酶偶聯(lián)，可以通過生色或熒光底物產(chǎn)生信號發(fā)射。
Western印跡是用于檢測樣品中特定蛋白的試驗(yàn)，通過對該蛋白特異的抗體進(jìn)行，包括下文描述的下列階段。
第一個階段是凝膠電泳，其能夠根據(jù)它們的大小分離樣品中的蛋白。
然后通過壓力或應(yīng)用電流將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到膜(硝酸纖維素，PVDF等)上，隨后蛋白通過疏水和離子相互作用固定到膜上。
在飽和掉非特異性相互作用的位點(diǎn)后，將對待測蛋白特異的第一抗體(一抗)與膜溫育。
然后清洗膜以去除未結(jié)合的一抗，并與所謂的二抗(其將結(jié)合一抗)溫育。這種二抗通常結(jié)合酶，所述酶允許能夠目測鑒定膜上待測的蛋白。添加用酶標(biāo)記的底物產(chǎn)生膜上可見的顏色反應(yīng)。
通過分析S100A9基因和/或S100A8基因的表達(dá)，能夠確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性，尤其是具有炎性全身性應(yīng)答的患者，并確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后?？梢岳缤ㄟ^分析患者(其發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性是未知的)中至少一種靶基因的表達(dá)并與敏感患者的靶基因平均表達(dá)的已知值和不敏感患者的靶基因平均表達(dá)的已知值進(jìn)行比較，確定患者是否有可能發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染。采用同樣的方式，可以例如通過分析至少一種靶基因的表達(dá)并與靶基因已知表達(dá)的平均值進(jìn)行比較，確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后，包括存活或死亡的預(yù)后。
因此本發(fā)明涉及一種確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的方法，其中:
a)從患者獲得生物樣品并從所述生物樣品提取生物材料
b)制備至少一個靶基因的表達(dá)產(chǎn)物的至少一種特異性試劑，所述靶基因
選自S100A9和S100A8革巴基因
c)測定靶基因S100A9和S100A8中至少一個的表達(dá)，相對于指定閾值
的過表達(dá)是發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的指征。
在階段c)，可以確定S100A9靶基因和S100A8靶基因的表達(dá)，S100A9靶基因相對于指定閾值的過表達(dá)和S100A8靶基因相對于指定閾值的過表達(dá)是發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性的指征。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知確定閾值的各種可能方法。舉例來說，我們可以提及Youden' s指數(shù)的確定。
Youden' s指數(shù)對應(yīng)于非錯誤總體程度的測量。其在O (針對不允許鑒別兩群體的檢驗(yàn))和I (針對允許準(zhǔn)確鑒別兩個群體的檢驗(yàn))之間變化。YoudeV s指數(shù)的最大值對應(yīng)
于假結(jié)果(假陰性或假陽性)數(shù)目最低的閾值。Youden' s指數(shù)越接近1，診斷性能越好
[12]
具體來說，生物樣品取自具有炎性全身性應(yīng)答的患者，而無論所述炎性全身性應(yīng)答是否與感染有關(guān)。生物樣品可以是血液樣品，生物材料提取物可以是例如核酸。優(yōu)選地，從生物樣品提取總RNA，并通過分析mRNA的表達(dá)測定靶基因的表達(dá)。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性試劑包括對S100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的至少一種擴(kuò)增引物或至少一種雜交探針，或?qū)100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的至少一種抗體。
所述方法尤其適于確定敗血性綜合征患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性，即所述患者具有對感染(諸如SIRS，敗血癥，嚴(yán)重?cái)⊙Y和敗血性休克)的炎性全身性應(yīng)答。
因此使用對S100A9基因和/或S100A8基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的試劑來確定患者發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的易感性，尤其是確定具有炎性全身性應(yīng)答的患者的易感性，而無論所述炎性全身性應(yīng)答是否與感染有關(guān)。所述試劑可以包括至少一種對S100A9靶基因特異的雜交探針，至少一種對S100A8靶基因特異的雜交探針，至少一種對S100A9靶基因特異的擴(kuò)增引物，至少一種對S100A8靶基因特異的擴(kuò)增引物，至少一種對分子S100A9特異的抗體或至少一種對分子S100A8特異的抗體。
S100A9和/或S100A8基因的表達(dá)分析還能夠確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后(包括存活和死亡的預(yù)后)。
因此，本發(fā)明提供一種確立患者的敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的方法，其中:
a)從患者獲得生物樣品并從所述生物樣品提取生物材料
b)制備至少一種靶基因的表達(dá)產(chǎn)物的至少一種特異性試劑，所述靶基因 選自S100A9和S100A8革巴基因
c)測定靶基因S100A9和S100A8中至少一種的表達(dá)，相對于指定閾值 的低表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的良好預(yù)后的指征，而相對于指定閾值 的過表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的較差預(yù)后的指征。
在階段c)，可以確定S100A9靶基因和S100A8靶基因的表達(dá)，S100A9靶基因相對于指定閾值的低表達(dá)和S100A8靶基因相對于指定閾值的低表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的良好預(yù)后的指征；
S100A9靶基因相對于指定閾值的過表達(dá)和S100A8靶基因相對于指定閾值的過表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的較差預(yù)后的指征。
確定閾值在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。舉例來說，我們可以提及Youden' s指數(shù)的確定。Youden' s指數(shù)對應(yīng)于非錯誤總體程度的測量。其在O (針對不允許鑒別兩群體的檢驗(yàn))和I (針對允許準(zhǔn)確鑒別兩個群體的檢驗(yàn))之間變化。Youden' s指數(shù)的最大值對應(yīng)于假結(jié)果(假陰性或假陽性)數(shù)目最低的閾值。Youden' s指數(shù)越接近1，診斷性能越好[1 2 ]。
生物樣品可以是血液樣品，生物材料提取物可以是例如核酸。優(yōu)選地，從生物樣品提取總RNA并通過分析mRNA的表達(dá)測定靶基因的表達(dá)。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性試劑包括對S100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的至少一種擴(kuò)增引物或至少一種雜交探針，或?qū)100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的至少一種抗體。
因此使用對S100A9基因和/或S100A8基因的表達(dá)產(chǎn)物特異的試劑來確立患者的敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后(包括存活或死亡的預(yù)后)。所述試劑可以包括至少一種對S100A9靶基因特異的雜交探針，至少一種對S100A8靶基因特異的雜交探針，至少一種對S100A9靶基因特異的擴(kuò)增引物，至少一種對S100A8靶基因特異的擴(kuò)增引物，至少一種對分子S100A9特異的抗體或至少一種對分子S100A8特異的抗體。
附圖
圖1顯示S100A8和S100A9基因表達(dá)的相關(guān)性(n=86)。其顯示分子S100A9和S100A8的基因表達(dá)之間存在強(qiáng)相關(guān)性，Spearman系數(shù)>0.90 (r=0.9134)。在鑒別有可能發(fā)生醫(yī)院內(nèi)感染的患者和確立敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后方面，分子S100A9和S100A8的基因表達(dá)具有類似的能力。
圖2顯示在敗血性 休克發(fā)病后D7和DlO之間獲得樣品中，存活和未存活患者之間S100A8基因表達(dá)的顯著差異(p=0.0461)。圖例:HV=健康志愿者；S=存活患者；NS=未存活患者。
實(shí)施例
實(shí)施例1-S100A9基因表達(dá)的研究 檢測樣品
使用一組44例健康志愿者(S)和一組148例敗血性綜合征患者(SEP)(在敗血性休克后Dl，D2或D3取樣(HO是血管升壓治療注射))用于比較外周血中S100A9基因的表達(dá)。鑒定一組44例健康患者(S)和一組148例患敗血性休克的患者(SEP)。
RNA的提取和cDNA的合成
對于每位患者，生物樣品是血液樣品，在患者SEP患有的敗血性綜合征發(fā)病后前10天期間定期獲得。還通過相同的方案在健康患者(S)中進(jìn)行取樣。這些樣品直接收集到PAXgeneTM Blood RNA 管(PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA)。
在采血階段后為了獲得細(xì)胞的完全裂解，將管在室溫下靜置4小時，然后在-20°C保存直至提取生物材料。更確切地說，在這個方案中，按照制造商的推薦，通過PAXgene BloodRNA?試劑盒(PreAnalytiX)提取總RNA。簡單來說，將管離心(10分鐘，3000g)以獲得核酸的沉淀。清洗這種沉淀，然后放入含蛋白酶K的緩沖液中以消化蛋白(55°C 10分鐘)。進(jìn)行重復(fù)離心(5分鐘，19000g)以去除細(xì)胞碎片，添加乙醇以優(yōu)化核酸固定的條件。將總RNA特異性固定到PAXgene RNA離心柱，在后者洗脫前，利用不含RNAse的DNAse set?(QiagenLtd, Crawley, UK)進(jìn)行污染DNA的消化。
對于每次提取，使用RNA6000Nano Chip?試劑盒(Agilent technologies)通過毛細(xì)管電泳驗(yàn)證總RNA的質(zhì)量。使用的裝置是bioanalyzer2100。在20μ I終體積中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)。將總RNA (0.5 μ g)與I μ 150 μ M的polyT和I μ L退火緩沖液混合，然后在65°C溫育5分鐘。在冰上冷卻后，將溶液與10μ 12XFirst Strand Reaction Mix和2檔 L SuperScript III/RNase? outenzyme Mix RT (15U/μ I)混合,所有這些產(chǎn)品都獲自SuperScript First Strand Synthesis Super Mix TM RT-PCR 系統(tǒng)(Invitrogen)。逆轉(zhuǎn)錄在50°C進(jìn)行50分鐘，然后通過在85°C溫育5分鐘終止。最后，將每份cDNA溶液用DEPC水稀釋到1/10。
用于定量的標(biāo)準(zhǔn)范圍的料備
從獲自健康受試者的cDNA混合物開始，S100A9靶基因(GenBank N0.NM002965.3)的153-179區(qū)域的擴(kuò)增通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行，旨在飽和，使用下列引物對:
有義引物:5’ -TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’ (SEQ ID NO:1)
反義引物:5’ -AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’ (SEQ ID NO:2)
通過實(shí)時PCR分析mRNA的表達(dá)
使用LightCycler?(Roche)通過實(shí)時定量PCR來定量如上所述重轉(zhuǎn)錄為cDNA的S100A9 靶基因的 mRNA。使用 Fast-Start? DNA Master SYBR Green I 實(shí)時 PCR 試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。在含 3.6 μ I 水，2.4 μ I MgCl2, 2 μ ISYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green+Taq DNA 聚合酶)和 I μ I 每種引物(10 μ Μ)和10 μ I cDNA溶液的20 μ I終體積中進(jìn)行每個PCR。使用的引物是先前描述的那些。
在95°C 10分鐘的變性階段后，利用40個循環(huán)的"touch-down" PCR方案(95°C 10秒，68-58°C雜交10秒，然后72°C延伸16秒)進(jìn)行擴(kuò)增。每個循環(huán)結(jié)束后，測量SYBR Green發(fā)射的熒光。
為了證明擴(kuò)增的特異性，將PCR產(chǎn)物系統(tǒng)接受解鏈曲線分析(LightCycIerTM-R0Che)。為此，以0.TC /秒的升高速率，在從58°C升高到98°C的溫度下處理PCR產(chǎn)物。對于每個PCR產(chǎn)物，曲線分析期間獲得單峰，表征為特定解鏈溫度。
定量持家基因CPB需要的引物組合由Search-LC (Heidelberg, Germany ；reference488116)提供。
利用 LightCycler Relative Quantification Software ?(Roche MolecularBiochemicals)通過相對定量技術(shù)分析靶mRNA的量相對于持家基因親環(huán)蛋白B的mRNA量。使用 LightCycler? 軟件(Roche)的"二階導(dǎo)數(shù)最大法(Second Derivative MaximumMethod)"自動確定每個樣品的"交點(diǎn)(Crossing Point)" (Cp)。Cp值被定義為突光顯著不同于背景噪聲的循環(huán)數(shù)目。
利用每個標(biāo)準(zhǔn)品一式四份進(jìn)行1/10的5個系列稀釋，以便產(chǎn)生表示Cp作為拷貝數(shù)對數(shù)函數(shù)的校準(zhǔn)曲線。優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品稀釋以便校準(zhǔn)曲線覆蓋預(yù)期靶基因和持家基因的表達(dá)水平。利用 LightCycler Relative Quantification Software (Roche MolecularBiochemicals)產(chǎn)生描述靶基因和持家基因的PCR效果的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用于定量。
獲得的結(jié)果
獲得的結(jié)果顯示于下表1。
表1
【權(quán)利要求】
1.S100A9基因的表達(dá)產(chǎn)物的至少一種特異性試劑在制備建立患者的敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的方法所用的試劑盒中的用途，其中所述方法包括: a)從患者獲得生物樣品，并從所述生物樣品提取生物材料 d)制備S100A9基因的表達(dá)產(chǎn)物的至少一種特異性試劑 e)測定基因S100A9的表達(dá)，相對于指定閾值的低表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的良好預(yù)后的指征，相對于指定閾值的過表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的較差預(yù)后的指征。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于在階段c)測定S100A9基因的表達(dá)，S100A9基因相對于指定閾值的低表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的良好預(yù)后的指征； S100A9基因相對于指定閾值的過表達(dá)是敗血性綜合征進(jìn)展的較差預(yù)后的指征。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述生物樣品是血液樣品。
4.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述生物材料是核酸或蛋白。
5.如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于S100A9基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性試劑包括至少一種對S100A9基因特異的擴(kuò)增引物。
6.如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于S100A9基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性試劑包括至少一種對S100A9基因特異的雜交探針。
7.如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于S100A9基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性試劑包括至少一種對分子S100A9特異的抗體。
8.S100A9基因表達(dá)產(chǎn)物的至少一種特異性試劑在制備用于確立患者敗血性綜合征進(jìn)展的預(yù)后的試劑盒中的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于S100A9基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性試劑包括至少一種對S100A9基因特異的雜交探針。
10.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于S100A9基因的特異性試劑包括至少一種對S100A9基因特異的擴(kuò)增引物。
11.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于S100A9基因表達(dá)產(chǎn)物的特異性試劑包括至少一種對分子S100A9特異的抗體。
【文檔編號】G01N33/68GK103923980SQ201410101355
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2010年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2009年1月19日
【發(fā)明者】M-A·卡扎利斯, A·勒帕普, G·莫內(nèi)雷, B·穆然, A·帕紹 申請人:生物梅里埃公司, 里昂公立收容所