表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物芯片領域，具體涉及一種表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應用。所述生物芯片是通過在固相載體固定蠅毒磷-卵清蛋白耦聯(lián)物作為生物探針，利用金膜產(chǎn)生表面等離子體共振響應，利用自組裝單分子層技術在金膜表面修飾巰基，芯片活化后在生物芯片上固定探針得到的；該生物芯片的應用包括利用表面等離子體共振生物芯片直接法檢測蠅毒磷單克隆抗體的應用和利用表面等離子體共振生物芯片通過抑制法檢測蠅毒磷的應用。直接檢測法可進行抗體的篩選，研究免疫反應動力學；競爭抑制法可檢測蠅毒磷小分子的濃度，檢測限低于25μg/L。該生物芯片具有快速、實時、能現(xiàn)場檢測的特點，靈敏度高而成本低，不污染環(huán)境。
【專利說明】表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物芯片領域，具體涉及一種表面等離子體共振生物芯片及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]二十世紀九十年代,人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)和分子生物學相關學科的發(fā)展為生物芯片、基因芯片技術的出現(xiàn)和發(fā)展提供了有利條件。生物芯片(biochip)是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過程固著于芯片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質以及其他生物成分的高通量快速檢測。蛋白質芯片(proteinchip)是將蛋白質或抗原等一些非核酸生命物質固定在微型載體上獲得，芯片上的探針構成為蛋白質或芯片作用對象為蛋白質者統(tǒng)稱為蛋白質芯片。
[0003]盡管生物芯片技術已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多問題，例如技術成本昂貴、操作復雜、重復性差、分析范圍較狹窄、通常需要放射性元素標記或者熒光標記等。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等方面。熒光法是目前使用最多的標記方法，靈敏度不高，需要避光，用于檢測結果的激光掃描儀價格昂貴。同位素標記法需要同位素和放射自顯影，使用不便，操作復雜，耗時，有嚴重的污染。
[0004]有機磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticide, OPPs)是一類含有不同取代基團的磷酸酯，通過對乙酰膽堿酯酶的抑制作用起到殺蟲效果，在創(chuàng)造巨大經(jīng)濟效益的同時，對環(huán)境造成了不可忽視的污染。中國是世界上施用農(nóng)藥量最大的國家之一，其中有機磷類農(nóng)藥用量接近農(nóng)藥用量的70%。有機磷農(nóng)藥會在果蔬等農(nóng)產(chǎn)品中殘留，嚴重威脅人類健康，對人類及動物具有神經(jīng)毒性作用，會引起神經(jīng)功能紊亂、震顫、精神錯亂、語言失常甚至死亡等中毒癥狀，有機磷農(nóng)藥引起的中毒事件時有發(fā)生，并且人類通過飲食攝入還會將殘留農(nóng)藥蓄積于體內，從而給人體造成慢性傷害。因此食品中有機磷農(nóng)藥殘留問題一直受到人們關注，很多有機磷農(nóng)藥已被禁止或限制使用，一些國家及國際組織對食品中有機含磷農(nóng)藥的殘留嚴格規(guī)定了限量，中國規(guī)定蠅毒磷在蔬菜和水果中的殘留量低于0.05mg/kg,歐盟制定有機磷農(nóng)藥的最大殘留限量(MRL)是0.lmg/kg。歐洲、日本等國家和地區(qū)不斷修改進口水果、蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留量的限制規(guī)定，因此有關農(nóng)產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留檢測方法的研究十分迫切且必要。
[0005]蠅毒磷是常用的有機磷農(nóng)藥，傳統(tǒng)的蠅毒磷檢測方法以色譜技術為主，如低壓氣相色譜-質譜聯(lián)用技術、高效液相色譜法、薄層色譜法，另外還有波譜法和酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)等,這些方法靈敏度高,但是樣品前處理過程繁瑣，儀器貴重，操作復雜，成本高，不利于大批量樣品的快速檢測和現(xiàn)場檢測，因此，開發(fā)簡單、快速、靈敏和廉價的農(nóng)藥檢測方法是一個亟待解決的問題。
[0006]表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)是一種基于麥克斯韋電磁波理論的物理光學現(xiàn)象，它產(chǎn)生于具有復介電常數(shù)這一特性的金屬表面。表面等離子體共振技術(SPR)利用P偏振光在玻璃與金屬薄膜界面處發(fā)生全內反射時進入金屬薄膜內的隱失波(倏逝波)，引發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體，當隱失波的波矢與表面等離子體的波矢相匹配時，二者將發(fā)生共振，入射光的能量被表面等離子體吸收，反射光強急劇下降，發(fā)生SPR現(xiàn)象，這時對應的入射角度稱為諧振角或者共振角。如果將探針或配體固定于傳感器芯片表面，含待分析物的樣品流經(jīng)傳感器表面，若流過生物芯片表面的樣品中含有與之結合的物質，它們之間發(fā)生的相互作用將導致芯片表面的介質折射率發(fā)生改變，弓丨起SPR共振角發(fā)生改變。通過檢測SPR信號改變檢測分子間的相互作用的特異性、濃度、動力學、親合性、協(xié)同作用、相互作用模式等。在生物分子相互作用分析過程中，靶物質可以天然存在于分析物中，在自然條件下進行分析，保證了所得結果的真實性。因此，SPR生物傳感器具有實時、免標記、操作簡單、可定量檢測生物分子、檢測兩種或多種分子間結合的優(yōu)點。目前，SPR技術已廣泛應用于食品檢測、藥物篩選、疾病診斷等領域。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種表面等離子體共振生物芯片，該生物芯片以蠅毒磷-卵清蛋白耦聯(lián)物(H11-OVA)作為探針。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供上述表面等離子體共振生物芯片的制備方法。
[0009]本發(fā)明的再一目的在于提供上述表面等離子體共振生物芯片的應用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0011]一種表面等離子體共振生物芯片的制備方法，包含如下步驟:
[0012](1)在玻璃基底上沉積厚度為45~55nm的金膜作為表面等離子體共振生物芯片的固相載體；
[0013](2)在培養(yǎng)皿中注入含有HS (CH2)ltlCOOH酸)和HS (CH2)60H (巰基己酸)的乙醇溶液，對金膜表面進行化學修飾；然后通入PBS緩沖液清洗，洗掉未結合物質；氮氣吹干；
[0014](3)將上述固相載體固定在SPR檢測儀上；
[0015](4)流通池中通入PBS緩沖液清洗，待基線穩(wěn)定后加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的混合液活化芯片；然后通入PBS緩沖液清洗；
[0016](5)在生物芯片表面固定蠅毒磷-卵清蛋白耦聯(lián)物(H11-OVA);記錄表面等離子體共振共振角的變化，監(jiān)測生物探針固定的過程，SPR響應值有大幅升高，則探針固定效果較好，當共振角不再升高時，探針固定過程結束；然后注入PBS緩沖液清洗；
[0017](6)加入乙醇胺(Eth)溶液封閉滅活剩余的酯鍵；然后通入PBS緩沖液清洗；得到表面等離子體共振生物芯片。
[0018]步驟(1)中所述的玻璃基底優(yōu)選直徑為20mm、厚度為1mm的圓形玻璃片；所述的金膜的厚度優(yōu)選為50nm ；
[0019]步驟(2)中所述的HS(CH2)iciCOOH的終濃度為0.1~10mM，優(yōu)選為0.1mM ;所述的HS (CH2)6OH的終濃度為0.1~IOOmM,優(yōu)選為0.9mM ；
[0020]步驟(2)中所述的化學修飾的條件為37°C溫浴，避光反應0.5~6h，優(yōu)選為2h ；
[0021]步驟(2)所述的氮氣吹干的溫度為40~60°C，優(yōu)選為50°C ；[0022]步驟(4)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的終濃度為0.05mol/L，所述的N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺的終濃度為0.05mol/L ；
[0023]步驟(4)中所述的活化芯片的時間為10~60min，優(yōu)選為15min ；
[0024]步驟(5)中所述的蠅毒磷-卵清蛋白耦聯(lián)物(H11-OVA)的濃度優(yōu)選為83mg/L ;所述的固定的時間為10~90min,優(yōu)選為30min ;其中，H11為根據(jù)蠅毒磷結構設計的半抗原，H11的結構式如式I所示:
【權利要求】
1.一種表面等離子體共振生物芯片的制備方法，其特征在于包含如下步驟: (1)在玻璃基底上沉積厚度為45~55nm的金膜作為表面等離子體共振生物芯片的固相載體； (2)在培養(yǎng)皿中注入含有HS(CH2)ltlCOOH和HS(CH2)6OH的乙醇溶液，對金膜表面進行化學修飾；然后通入PBS緩沖液清洗，洗掉未結合物質；氮氣吹干； (3)將上述固相載體固定在SPR檢測儀上； (4)流通池中通入PBS緩沖液清洗，待基線穩(wěn)定后加入N-羥基琥珀酰亞胺和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亞胺的混合液活化芯片；然后通入PBS緩沖液清洗； (5)在生物芯片表面固定蠅毒磷-卵清蛋白耦聯(lián)物，記錄表面等離子體共振共振角的變化，監(jiān)測生物探針固定的過程，當共振角不再升高時，探針固定過程結束；然后注入PBS緩沖液清洗； (6)加入乙醇胺溶液封閉滅活剩余的酯鍵；然后通入PBS緩沖液清洗；得到表面等離子體共振生物芯片。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種表面等離子體共振生物芯片的制備方法，其特征在于: 步驟(1)中所述的玻璃基底為直徑為20mm、厚度為1mm的圓形玻璃片；所述的金膜的厚度為50nm ； 步驟(2)中所述的HS(CH2)ltlCOOH的終濃度為0.1mM ;所述的HS(CH2)6OH的終濃度為0.9mM ；` 步驟(2)中所述的化學修飾的條件為37°C溫浴，避光反應2h ； 步驟(2)所述的氮氣吹干的溫度為50°C ； 步驟(4)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的終濃度為0.05mol/L，所述的N-乙基-N’- (二甲氨基丙基)碳二亞胺的終濃度為0.05mol/L ； 步驟(4)中所述的活化芯片的時間為15min ； 步驟(5)中所述的蠅毒磷-卵清蛋白耦聯(lián)物的濃度為83mg/L;所述的固定的時間為30min ； 步驟(6)中所述的乙醇胺溶液的濃度為lmol/L，pH值為8.5 ;所述的封閉滅活的時間為 6min ； 步驟(2 )、( 4 )、( 5 )和(6 )中所述的PBS緩沖液清洗的次數(shù)為2次，清洗的時間為2min ;所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4、終濃度為2mmol/L的Na2HP04、終濃度為 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
3.一種表面等離子體共振生物芯片，其特征在于采用權利要求1或2所述方法制備得到。
4.權利要求3所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用，其特征在于:包括利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測蠅毒磷單克隆抗體的應用、利用表面等離子體共振生物芯片通過抑制法檢測蠅毒磷小分子的應用和利用表面等離子體共振生物芯片通過連續(xù)抑制法檢測蠅毒磷小分子的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用，其特征在于:所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過直接法檢測蠅毒磷單克隆抗體，包含如下步驟: (一)建立標準曲線: 已知濃度的蠅毒磷單克隆抗體用PBS緩沖液配置成不同濃度的標準溶液，以PBS緩沖液為基準，各個標準溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應，對生物芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標準溶液的表面等離子共振動力學曲線，以標準溶液濃度作為橫坐標，共振角作為縱坐標，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標準曲線； (二)未知樣品的檢測: 將未知樣品注入微流通池與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應，對表面等離子體共振生物芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得未知樣品的表面等離子體共振動力學曲線，結合步驟(一)得到的回歸標準曲線，計算出未知樣品中蠅毒磷單克隆抗體的濃度； (三)下一樣品檢測: 步驟(二)中的免疫反應結束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I~5次，每次清洗的時間是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗時間是I~3min，使抗原-抗體結合物解離；然后通入PBS緩沖液I~5次，每次清洗的時間是I~3min ；SPR響應值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用，其特征在于: 步驟(一)中所述的蠅毒磷單克隆抗體標準溶液的濃度范圍為0.01mg/L~100mg/L ； 步驟(一)所述的標準溶液的檢測量為100 μ L ;所述的免疫反應的反應時間為5~6min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ； 步驟(二)中所述的未知樣品的檢測量為IOOyL ;所述的免疫反應的反應時間為5~6min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ； 步驟(三)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的質量分數(shù)為1%，HCl的濃度為0.01mol/L ； 步驟(三)中所述的PBS緩沖液清洗次數(shù)為2次，每次清洗的時間為2min;所述的SDS-HCl溶液清洗次數(shù)為I次，清洗的時間為I~3min ； 所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4、終濃度為2mmol/L的Na2HP04、終濃度為 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
8.根據(jù)權利要求5所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用，其特征在于:所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過抑制法檢測蠅毒磷小分子，包含如下步驟: (I )建立標準曲線: 蠅毒磷標準品用PBS緩沖液配置成不同濃度的標準溶液，不同濃度的蠅毒磷標準溶液分別與定量蠅毒磷單克隆抗體溶液混合，靜置，得到各個標準溶液與定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液；以PBS緩沖液為基準，各個標準溶液與定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應，對表面等離子體共振生物芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標準溶液的表面等離子體共振動力學曲線，以標準溶液濃度作為橫坐標，共振角作為縱坐標，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標準曲線； (II)未知樣品的檢測: 將未知樣品提取液和定量蠅毒磷單克隆抗體混合，靜置，得到未知樣品提取液和定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液，將上述混合溶液注入微流通池進行免疫反應，對表面等離子體共振生物芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學曲線，結合步驟(1)得到的回歸標準曲線，計算出未知樣品中蠅毒磷小分子的濃度； (III)下一樣品的檢測: 步驟(II)中的免疫反應結束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I~3次，每次清洗的時間是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗時間是I~3min，使抗原-抗體結合物解離；然后通入PBS緩沖液I~5次，每次清洗的時間是I~3min ；SPR響應值降回基線，繼續(xù)檢測下一個樣品。
9.根據(jù)權利要求8所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用，其特征在于: 步驟(I )中所述定量蠅毒磷單克隆抗體在混合溶液中終濃度為10mg/L ； 步驟(I )中所述的蠅毒磷標準品分子量為362.78 ； 步驟(I )中所述的標準溶液的濃度范圍為0.1~10000 μ g/L ； 步驟(I )中所述 的靜置時間為8min ； 步驟(I )中所述的蠅毒磷標準品與蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液的檢測量為100μ L ;所述的免疫反應的反應時間為6min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 步驟(II)中所述的定量蠅毒磷單克隆抗體在混合溶液中終濃度為10mg/L ;所述的靜置時間為8min ； 步驟(II)中所述的未知樣品提取液與定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液檢測量為100 μ L ;所述的免疫反應的反應時間為6min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 步驟(III)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的質量分數(shù)為1%，HCl的濃度為0.01mol/L ； 步驟(III)中所述的PBS緩沖液清洗次數(shù)為2次，每次清洗的時間為2min;所述的SDS-HCl溶液清洗次數(shù)為I次，清洗的時間為I~3min ； 所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4,終濃度為2mmol/L的Na2HP04、終濃度為 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
10.根據(jù)權利要求5所述的一種表面等離子體共振生物芯片在生物芯片領域中的應用，其特征在于:所述的利用表面等離子體共振生物芯片通過連續(xù)抑制法檢測蠅毒磷小分子，包含如下步驟: ①建立標準曲線: 蠅毒磷標準品用PBS緩沖液配置成不同濃度的標準溶液，不同濃度的蠅毒磷標準溶液分別與定量蠅毒磷單克隆抗體溶液混合，靜置，得到各個標準溶液與定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液；以PBS緩沖液為基準，各個標準溶液與定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流通池，與表面等離子體共振生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應，對表面等離子體共振生物芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得各個標準溶液的表面等離子體共振動力學曲線；以標準溶液濃度作為橫坐標，共振角作為縱坐標，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標準曲線； ②未知樣品的檢測: 將未知樣品提取液和定量蠅毒磷單克隆抗體混合，靜置，得到未知樣品提取液和定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液，將上述混合溶液注入微流通池進行免疫反應，對表面等離子體共振生物芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學曲線，結合步驟①得到的回歸標準曲線，計算出未知樣品中蠅毒磷小分子的濃度； ③下一樣品的檢測: 步驟②中的免疫反應結束后，微流通池先通入PBS緩沖液清洗I~3次，每次清洗的時間是I~5min ;繼續(xù)檢測下一個樣品； 步驟①中所述的定量蠅毒磷單克隆抗體在混合溶液中終濃度為10mg/L ；` 步驟①中所述的蠅毒磷小分子分子量為362.78 ； 步驟①中所述的標準溶液的濃度范圍為0.1~10000 μ g/L ； 步驟①中所述的靜置時間為8min ； 步驟①中所述的蠅毒磷標準品與蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液的檢測量為100μ L ;所述的免疫反應的反應時間為6min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 步驟②中所述的定量蠅毒磷單克隆抗體在混合溶液中終濃度為10mg/L ;所述的靜置時間為8min ；` 步驟②中所述的未知樣品提取液與定量蠅毒磷單克隆抗體的混合溶液檢測量為`100 μ L ;所述的免疫反應的反應時間為6min ;所述的表面等離子體共振掃描范圍為I~2° ; 所述的PBS緩沖液的組成如下:終濃度為2mmol/L的NaH2PO4、終濃度為2mmol/L的Na2HP04、終濃度為 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值為 7.4。
【文檔編號】G01N21/41GK103884682SQ201410105426
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權日:2014年3月20日
【發(fā)明者】李瑩, 鐘金鋼, 馬驍, 齊攀 申請人:暨南大學