分泌抗大麥黃矮病毒gav株系單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用差速離心的方法提純的大麥黃矮病毒（BYDV）GAV株系病毒粒子為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗BYDVGAV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株27E1，其保藏號(hào)為CGMCCNo.8781。該雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗腹水ELISA效價(jià)達(dá)10-6以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。雜交瘤細(xì)胞株27E1分泌的單抗與大麥黃矮病毒GAV株系有特異性反應(yīng)，而不與水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、中國(guó)小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和PAV株系反應(yīng)。該雜交瘤細(xì)胞株27E1及其分泌的單抗為該小麥病毒病的診斷、檢測(cè)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
【專利說(shuō)明】分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥黃矮病是由大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)引起的,該病害在全世界均有分布，它的寄主廣泛，可寄生150多種單子葉植物，特別是侵染大麥、小麥、燕麥、水稻等多種禾谷類作物。1950年在美國(guó)加利福尼亞州的大麥上首先發(fā)現(xiàn)，是世界上危害最嚴(yán)重、流行最廣泛的植物病毒之一。我國(guó)于I960年在陜西、甘肅的小麥上發(fā)現(xiàn)，是小麥最重要的病毒病害，被稱為小麥的“黃色瘟疫”，“小麥癌癥”。目前主要分布在西北、華北、東北、華中、西南及華東等冬麥區(qū)、春麥區(qū)及冬春麥混種區(qū)，除危害小麥外，還能侵染大麥、莜麥、粟、糜子、玉米、水稻和禾本科雜草。受:害小麥一般減產(chǎn)40%左右,嚴(yán)重的可達(dá)70%以上。我國(guó)20世紀(jì)60年代以來(lái)，曾于1966、1968、1970、1973、1978、1980和1987年大流行。在陜西、甘肅、寧夏、山西和內(nèi)蒙古等省、自治區(qū)造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)。這類病毒除了在經(jīng)濟(jì)上的重要性外，它們的基因表達(dá)機(jī)制、進(jìn)化與傳播介體和寄主的作用機(jī)制，幾十年來(lái)一直被研究者所關(guān)注。
[0003]小麥黃矮病的癥狀因寄主種類、品系、生長(zhǎng)期及生理?xiàng)l件、病毒株系、接種劑量和環(huán)境條件等因素的不同而有差異。寄主植物受黃矮病毒侵染后，苗期感病植株生長(zhǎng)緩慢、分蘗減少、扎根淺、易拔起。病葉自葉尖褪綠變黃，葉片厚硬。病株越冬期間易被凍死，未凍死的返青拔節(jié)后新生葉片繼續(xù)發(fā)病。病株矮化、不抽穗或抽的穗很小。拔節(jié)孕穗期感病的植株較矮，根系發(fā)育不良。典型癥狀是新葉從葉尖開(kāi)始發(fā)黃，隨后出現(xiàn)與葉脈平行，但不受葉脈限制的黃綠相間的條紋，沿葉緣向葉莖部擴(kuò)展蔓延，黃化部分約占全葉的1/3-1/2。病葉質(zhì)地光滑，后期逐漸黃枯，而下部葉片仍為綠色。病株能抽穗，但籽粒秕瘦。穂期感病的植株一般只旗葉發(fā)黃，呈鮮黃色，植株矮化不明顯，能抽穗，粒重降低。大麥幼苗期感病后嚴(yán)重矮縮，分蘗增多，葉片變硬發(fā)脆，葉尖開(kāi)始變黃，呈鮮艷的金黃色或橙色，有光澤，不抽穗或抽的穂很小，籽粒很少，且不飽滿。拔節(jié)期感病，節(jié)間縮短，植株顯著矮化，分蘗增多，葉片呈金黃色。抽穗后感病，一般只旗葉呈金黃色，矮化較輕，能抽穂，籽粒秕瘦。
[0004]大麥黃矮病毒是一類+ssRNA病毒。BYDV為對(duì)稱球型病毒，外殼為二十面體(T=3),無(wú)包膜。由蚜蟲(chóng)以循個(gè)型持久傳播，病毒粒體在蚜蟲(chóng)體內(nèi)不增殖，不能通過(guò)摩擦接觸接種。不同種的病毒蚜傳特性不同，即總是每一種病毒對(duì)應(yīng)一種或幾種蚜蟲(chóng)傳播介體。病毒在植物體內(nèi)僅限于韌皮部組織，并且在寄主體內(nèi)濃度很低。
[0005]世界上引起麥類作物黃矮病的病毒隸屬于黃癥病毒科的黃癥病毒屬，目前已知的有病毒PAV、MAV、SGV、RPV、RMV以及我國(guó)特有的GAV和GPV。其中PAV、MAV是黃癥病毒屬的正式成員，禾谷黃矮病毒RPV被分在馬鈴薯卷葉病毒屬，SGV、GAV、GPVjP RMV還未正式命名。[0006]大麥黃矮病毒的侵染循環(huán)在冬麥區(qū)、冬春麥混種區(qū)是有差異的。冬麥區(qū)如陜、甘、豫、魯、冀、皖、蘇等省在5月中下旬，傳毒介體麥蚜從小麥寄主上遷出，在越夏寄主上取食、繁殖和傳播病毒。越夏寄主包括玉米、高粱、糜子、粟(谷子)、水稻等作物以及自生麥苗、鵝觀草、野燕麥、雀麥、畫眉草、白羊草、馬唐、蟋蟀草、虎尾草等禾本科雜草。秋季小麥出苗后，麥蚜又遷回麥地，特別是田邊的小麥上取食、繁殖和傳播病毒，并以有翅成蚜、無(wú)翅成蚜和若蚜在麥田基部越冬，有些地區(qū)也產(chǎn)卵越冬。冬前感病的小麥?zhǔn)堑诙暝绱旱陌l(fā)病中心。返青后，在拔節(jié)期出現(xiàn)一次發(fā)病高峰。發(fā)病中心的病毒隨著麥蚜的遷移擴(kuò)散逐漸蔓延，到抽穗期出現(xiàn)第二次發(fā)病高峰。
[0007]冬、春麥混種區(qū)如甘肅河西走廊一帶，5月中旬，冬小麥上的麥蚜逐漸產(chǎn)生有翅蚜，向春小麥、大麥、高粱、糜子及禾本科雜草上遷移。晚熟春麥、糜子和自生麥苗是蚜蟲(chóng)和大麥黃矮病毒的主要越夏場(chǎng)所。9月下旬，冬小麥出苗后，麥蚜又遷回麥田，在冬小麥上產(chǎn)卵越冬，小麥黃矮病毒也隨之傳到冬小麥麥苗上，在冬小麥根部和分蘗節(jié)里越冬。第二年3月中旬，越冬蚜卵開(kāi)始孵化，4月中旬產(chǎn)生有翅蚜，遷移擴(kuò)散，不斷地傳播病毒。
[0008]小麥黃矮病在春麥區(qū)的侵染循環(huán)比較復(fù)雜。據(jù)1965年以來(lái)的歷年調(diào)查表明，豫西、關(guān)中、晉南、隴東等冬麥區(qū)的麥姆和小麥黃矮病與寧夏、內(nèi)蒙古等春麥區(qū)的麥姆和小麥黃矮病發(fā)生流行趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明春麥區(qū)的蟲(chóng)源、毒源有可能來(lái)自部分冬麥區(qū)。實(shí)際調(diào)查表明，麥姆能夠憑借氣候條件，從冬麥區(qū)遷飛至春麥區(qū)，并傳播病毒，成為春麥區(qū)小麥黃矮病的初侵染源和毒源。有翅蚜遷入的主要?dú)夂蛐蝿?shì)為“槽前鋒后”型，遷入?yún)^(qū)域主要為西起寧夏黃灌區(qū)，包括內(nèi)蒙古巴彥卓爾盟、伊克昭盟、烏蘭察布盟及河北張家口，承德和西北部春麥區(qū)。遷出區(qū)域主要是豫西、關(guān)中、晉南、隴東、隴南和延安等冬麥區(qū)。在小麥病毒病的防治上，傳統(tǒng)的是采取推廣抗病品種、輪作和治蟲(chóng)防病等措施。
[0009]本發(fā)明主要針對(duì)大麥黃矮病毒單克隆抗體的制備展開(kāi)工作。當(dāng)前小麥黃矮病的發(fā)生規(guī)律和防控技術(shù)上有很多工作急需開(kāi)展，預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和監(jiān)測(cè)體系尚不完善，甚至主要流行區(qū)也未開(kāi)展相關(guān)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的工作。目前用來(lái)檢測(cè)這種病毒的方法主要是田間觀測(cè)、RT-PCR檢測(cè)、電鏡觀察等方法。這幾種方法都具有其局限性，而且不適合大批量的田間樣品檢測(cè)。而血清學(xué)的方法適于田間樣品批量檢測(cè)，但必須依賴于特異性的病毒單抗。目前國(guó)內(nèi)外未研制出針對(duì)這種病毒的特異性的單克隆抗體。因此，本專利利用雜交瘤技術(shù)制備了 I株能分泌抗BYDV GAV株系單抗的雜交瘤細(xì)胞，并用其分泌的單抗建立了檢測(cè)該病毒的血清學(xué)方法和檢測(cè)試劑盒。
[0010]以大麥黃矮病毒病為對(duì)象，制備針對(duì)大麥黃矮病毒的單克隆抗體，建立高效、快捷的病毒檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，建立相關(guān)病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)體系和早期預(yù)警平臺(tái)，保證我國(guó)小麥的穩(wěn)產(chǎn)增收。
[0011]本發(fā)明以BYDV GAV株系的提純病毒粒子為抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了 I株分泌抗BYDV GAV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，以其分泌的單抗為核心建立了檢測(cè)BYDVGAV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間小麥黃矮病的檢測(cè)，從而為我國(guó)小麥黃矮病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[0013]分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株27E1，它能分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株27E1保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8781，。
[0014]抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體腹水dot-ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGUkappa鏈。
[0015]抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體能與大麥黃矮病毒GAV株系有特異性反應(yīng)，而不與蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、中國(guó)小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和PAV株系發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0016]抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株27E1分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISAdP TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)大麥黃矮病毒-GAV株系；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)大麥黃矮病毒GAV株系，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物中的大麥黃矮病毒GAV株系的檢測(cè)、診斷。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)大麥黃矮病毒GAV株系的靈敏度分析；
圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)田間小麥樣品中大麥黃矮病毒GAV的結(jié)果；
生物保藏
雜交瘤細(xì)胞株27E1保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101，保藏日期為:2014年I月22日，保藏號(hào)為CGMCC N0.8781。
【具體實(shí)施方式】
[0019]分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株27E1，保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.8781，它能分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體。
[0020]抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體腹水dot-ELISA效價(jià)達(dá)10-6以上，抗體類型及亞類為IgGUkappa鏈。
[0021]抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體能與大麥黃矮病毒GAV株系有特異性反應(yīng)，而不與蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、中國(guó)小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和PAV株系發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0022]抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。[0023]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株27E1能大量分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單抗，且其特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)BYDV GAV株系的高通量的血清學(xué)方法和檢測(cè)試劑盒，并可應(yīng)用于田間BYDV GAV株系的檢測(cè)，從而為我國(guó)大麥黃矮病毒早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0025]一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備
用下面的操作步驟提純病毒粒子:
O將大研缽和組織攪拌器預(yù)冷；
2)燕麥毒源于液氮中研磨成粉末重量Ikg；
3)以1:2 (w/v, g/ml)的比例加入0.1M磷酸鹽緩沖液(即PB緩沖液)2000ml (含1%(v/v)巰基乙醇和5g崩潰酶),攪拌60秒混勻。以后每隔15分,攪拌30秒,勻衆(zhòng)3小時(shí)；
4)加入TritonX-100至終濃度為0.5% (v/v)，室溫?cái)嚢?0分鐘；
5)4到6層紗布過(guò)濾，濾液體積2100ml,加入1/5體積的氯仿:正戍醇(2:1，v/v)420ml ；
6)加蓋攪拌30分鐘；
7)8000rpm離心15分鐘,取上清；
8)量取上清體積，先加入NaCl至0.25M,然后，慢慢加入PEG 6000至終溶度為10%(w/v, g/ml)的，即上清體積 2200ml 加 NaCl 35g, PEG 6000 220g ；
9)溶解后冰浴放置90-120分鐘。
[0026]10) 1000Orpm離心20分鐘，棄上清，去凈殘液后倒扣于吸水紙上10分鐘，加入30ml 0.1M PB懸浮沉淀，4°C攪拌過(guò)夜；
11)5000rpm離心10分鐘,棄沉淀,上清加到50ml厚壁離心管中30%的鹿糖(溶于0.1MPB中)墊上，蔗糖墊體積15ml ；
12)Beckman Ti55 型轉(zhuǎn)頭 44, OOOrpm 離心 2 小時(shí)；
13)棄上清，沉淀溶于3ml0.1M PB中，4°C用攪拌懸浮過(guò)夜，懸浮液即為病毒提純粒
子;
14)電子顯微鏡觀察提純樣品，發(fā)現(xiàn)大量高純度的大麥黃矮病毒粒子。
[0027]2.免疫動(dòng)物
用提純的大麥黃矮病毒GAV株系的病毒粒子免疫四周齡體重18-20g BALB/c雌性小鼠。即大麥黃矮病毒GAV株系的病毒粒子100μL只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，過(guò)3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0028]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按7:1的比例，在無(wú)血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma,分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無(wú)血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0029]4.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，以感染BYDV GAV病毒的小麥葉片和提純病毒為檢測(cè)抗原包被，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲72個(gè)陽(yáng)性孔。選擇10個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得I株能分泌抗BYDV GAV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株27E1。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0030]5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、水稻矮縮病毒(RDV)、水稻條紋病毒(RSV)、水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)、中國(guó)小麥花葉病毒(CWMV)、小麥黃花葉病毒(WYMV)、大麥黃花葉病毒(BaYMV)、小麥黃矮病毒(BYDV) GPV株系和PAV株系的病葉汁包被ELISA板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以大麥黃矮病毒GAV株系為陽(yáng)性對(duì)照，用ACP-ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。ACP-ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按I: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后IOOul/孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜或37°C 2小時(shí)使其吸附于ELISA板孔；PBST洗滌三次后用3%的脫脂奶粉或1% BSA或3%牛血清封閉30-60min ;加入適當(dāng)稀釋的單抗IOOul/孔，37°C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37°C 1_2小時(shí)；PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取0D405的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，27E1單抗對(duì)BYDV GAV有特異性反應(yīng)，而與 TuMV、TMV、ToMV、CMV、PVY、PVX、RDV、RSV、RRSV、CWMV、WYMV、BaYMV、BYDV GPV 和 PAV病毒及健康植物均無(wú)免疫反應(yīng)。
[0031]6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10X105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06 M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。
[0032]7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為27E1單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果表明上述單抗腹水效價(jià)在10 - 6以上。
[0033]二、病毒免疫學(xué)檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒
1.dot-ELISA方法的建立及其檢測(cè)應(yīng)用
將小麥葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30 (w/v，g /mL)加入0.01 mo I/L PBS(pH7.4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上，同時(shí)設(shè)置健康和感病小麥葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mo I/L PBS)封閉液中室溫封閉30min ；NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3-4次，每次3 min ；NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60 min; PBST洗膜4_5次，每次3 min; 66 μ L NBT和 33 μ L BCIP底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCU0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果O
[0034]用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)小麥病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明27E1單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:3000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)BYDV GAV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)小麥葉片稀釋到1:640倍(w/v, g/mL)時(shí)，以27E1單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:640倍稀釋(圖1)。
[0035]用建立的dot-ELISA方法對(duì)2013年采自田間小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，23個(gè)樣品中有14個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)(圖2)。陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到BYDV GAV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染BYDV GAV。說(shuō)明該dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于小麥樣品中BYDV GAV的檢測(cè)。
[0036]2.以單抗為核心建立的抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測(cè)病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟:
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)按1:30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液IOOul/孔加入ELISA板，以BYDV GAV小麥病葉為陽(yáng)性對(duì)照，以健康小麥為陰性對(duì)照，37°C 2h，或4°C過(guò)夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后IOOul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗(Sigma), IOOul/ 孔，37。。，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物IOOul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，或用2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)0D405值，以P/N> 2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0037]ACP-ELISA方法檢測(cè)靈敏度檢測(cè)
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對(duì)病葉從1:10至5120作倍比稀釋，以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對(duì)照，進(jìn)行上述ACP-ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對(duì)1:10~2560倍稀釋的病葉汁液呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到1:2560，表明ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
[0038]3.檢測(cè) BYDV GAV 的 TAS-ELISA 檢測(cè)方法 TAS-ELISA方法的操作流程:
I) 1:5000倍稀釋的抗BYDV GAV的兔抗血清(由純化的原核表達(dá)BYDV GAV-CP免疫兔子制備)IOOul/孔包被聚苯乙烯板，37°C，2-4h或4°C，過(guò)夜；2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min
3)加入檢測(cè)樣品IOOul/孔。以BYDVGAV病葉為陽(yáng)性對(duì)照，以健康小麥為陰性對(duì)照，370C 1-2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水IOOul/孔，37°Cl_2h 5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma) IOOul/孔，37°C
1-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)405nm的OD值，以P/N> 2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0039]TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定:
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向分別加用包被緩沖液從1: 100至1: 102400倍比稀釋的兔抗BYDV GAV血清；加入BYDV GAV病葉汁；縱向分別加用封閉液從1: 5至I: 2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)按1: 10000倍稀釋；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果表明BYDV GAV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為 1: 10000、I: 5000。
[0040]TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將BYDV GAV病葉汁用PBS液進(jìn)行倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為:TAS-ELISA檢測(cè)病葉的靈敏度分別達(dá)到1:12000倍稀釋(w/v, g /mL),說(shuō)明本方法具有很好的靈敏度。
[0041]4.大麥黃矮病毒dot-ELISA檢測(cè)試劑盒
1)試劑盒主要成分:
BYDV GAV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
陽(yáng)性對(duì)照(含BYDV GAV小麥葉汁)I管2 ml
陰性對(duì)照(健康小麥葉汁)I管2 ml
抗體稀釋液(IOX) I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下 硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測(cè)小麥樣品的操作步驟:
a.將小麥葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10~30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ I上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病小麥葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1:3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30~60 min ；f.用PBST洗膜3~4次，每次3min ； NC膜放入1:8000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30~60 min;
g.PBST洗膜4~5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色)，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0042]3)保存及有效期
于2~8 °C避光保存，有效期12個(gè)月。
[0043]4)緩沖液配方: 磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L, ρΗ7.4):
NaCl8 g
KCl0.2 g
KH2P040.2 g
Na2HP0412H203g
疊氮化鈉0.2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000 ml ELISA 洗滌液(0.01 mol/L PBST):
1000 ml 0.01mol/L PBS 中加 0.5 ml Tween-20
ELISA封閉液:
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株27E1,其特征在于能分泌抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體，保藏號(hào)為CGMCC N0.8781。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株27E1分泌的抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa 鏈。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株27E1分泌的抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體能與大麥黃矮病毒GAV株系有特異性反應(yīng)，而不與蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、中國(guó)小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和PAV株系發(fā)生免疫反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗大麥黃矮病毒GAV株系的單克隆抗體在大麥黃矮病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，其 特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103911349SQ201410107741
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】吳建祥, 周雪平, 李娜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)