一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，包括如下步驟：一、待測樣品處理：將魚肉與Tris-HCl混合勻漿，過濾，水浴加熱，離心，收集上清液為作為測試樣品；二、樣品檢測：將膠體金標(biāo)記的一抗與測試樣品混合均勻得混合液，取5-15μl混合液注入毛細(xì)免疫層析管的檢測區(qū)端，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)流經(jīng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的液體排出毛細(xì)管外，然后免疫層析毛細(xì)管浸入在PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗，最后通過裸眼定性獲得檢測結(jié)果。本發(fā)明的反方法，檢測靈敏度好，重復(fù)性高，檢測時(shí)間快，穩(wěn)定性好適合用于即時(shí)的快速檢測。
【專利說明】一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小清蛋白的檢測方法，特別涉及一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速穩(wěn)定增長，人民生活質(zhì)量不斷提高，對食物消費(fèi)的要求也越來越高。但是環(huán)境污染、農(nóng)獸藥殘留、食物中過敏原等引起的危害食品安全的事件不斷見諸報(bào)道，已引起人們的廣泛關(guān)注。
[0003]20世紀(jì)80年代初期，免疫膠體金層析技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡捷、不需要儀器等特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品檢測及農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。膠體金免疫層析方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為基底通過毛細(xì)管作用使金標(biāo)材料混合物泳動(dòng)，移動(dòng)至固定抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)的結(jié)合物被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果?；谙跛崂w維素膜的高蛋白結(jié)合能力和易處理的性質(zhì)被廣泛用作免疫層析的基底材料。然而，硝酸纖維素膜較薄、韌性小且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因而在處理過程中易破碎，且易受環(huán)境溫度和濕度的影響進(jìn)而影響檢測的靈敏度、重復(fù)性和貯存壽命(Fu，E.; Liang, T.;Houghtal ing，J.; Ramachandranj S.; Ramsey, S.A.; Lutz, B.; Yager, P.Enhancedsensitivity of lateral flow tests using a two-dimensional paper network format.Anal.Chem.2011，83，7941-7946)。
[0004]魚肉中含有豐富的蛋白質(zhì)和硫胺素、核黃素、尼克酸、維生素D和一定量的鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)，且魚肉中脂肪含量低深受消費(fèi)者的喜愛。但據(jù)調(diào)查顯示，魚類也是最易引起過敏的八種食物之一。研究發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白中的小清蛋白，是魚類的主要過敏原，分子量約為12kDa左右，能引起IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)對人體的器官和免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，對進(jìn)出口貿(mào)易產(chǎn)生較大影響。小清蛋白是一種鈣離子結(jié)合的酸性蛋白，對熱、蛋白酶的水解作用及化學(xué)變性都比較穩(wěn)定，因此滅活和脫除方法的效果不好，建立一種靈敏、可靠、快速的小清蛋白檢測方法成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析檢測方法，靈敏度好，重復(fù)性高，檢測時(shí)間快，穩(wěn)定性好適合用于即時(shí)的快速檢測。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析檢測方法，包括如下步驟:
一、待測樣品處理:將魚肉與Tris-HCl按照1:2-3 (w/v)的比例混合勻漿，將勻漿后的樣品過濾后，95-100°C下水浴加熱5-25min，離心，收集上清液為作為測試樣品。
[0007]本步驟主要目的是從魚肉中提取純化小清蛋白，常規(guī)的小清蛋白的提取方法一般要經(jīng)過組織勻漿，抽提步驟，而小清蛋白的純化過程則非常復(fù)雜，經(jīng)過對粗提蛋白液進(jìn)行離心，硫酸銨沉淀，透析，離子交換柱洗脫，離心等一系列步驟才能得到較純的小清蛋白。這樣的提取純化方法較為復(fù)雜不適合現(xiàn)場快速檢測，因此本發(fā)明為適應(yīng)快速檢測的需求，改進(jìn)了小清蛋白的提取純化方法。
[0008]二、樣品檢測:將膠體金標(biāo)記的一抗與測試樣品按1:1-1.5的體積比混合均勻得混合液，取5-15 μ L混合液注入免疫層析毛細(xì)管的檢測區(qū)端，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)流經(jīng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的混合液排出免疫層析毛細(xì)管，然后免疫層析毛細(xì)管浸入在PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3-5min，最后通過裸眼定性獲得檢測結(jié)果。
[0009]作為優(yōu)選，所述一抗為兔抗小清蛋白。
[0010]作為優(yōu)選，所述免疫層析毛細(xì)管的組裝方法包括如下步驟:
(I)毛細(xì)管的處理:將毛細(xì)管浸入piranha溶液中超聲清洗15_20min，超純水清洗至中性，干燥，冷卻，然后將毛細(xì)管依次浸入KOH溶液、超純水、HCl溶液、超純水及有機(jī)溶劑中分別超聲清洗10-15min，然后烘干。
[0011]利用piranha溶液的強(qiáng)氧化性去除毛細(xì)管上的有機(jī)殘留物，同時(shí)對毛細(xì)管的玻璃表面進(jìn)行羥基化，使得毛細(xì)管的玻璃表面上具有親水性。
[0012]將毛細(xì)管依次浸入KOH溶液、超純水、HCl溶液、超純水及有機(jī)溶劑中分別超聲清洗，以進(jìn)一步清洗玻璃表面去除酸、堿和表面的活性基團(tuán)，同時(shí)穩(wěn)定玻璃表面上的羥基。 [0013](2)毛細(xì)管的修飾:將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液，使得GPTMS的終濃度為8V01%-15V01%，三乙胺的終濃度為1V01%-2V01%，將步驟(1)處理所得毛細(xì)管浸沒于修飾液中室溫下干燥環(huán)境中反應(yīng)18h-25h，排出毛細(xì)管內(nèi)的修飾液，室溫下干燥環(huán)境中保持2_3h，然后將毛細(xì)管浸入無水甲苯中上下抽動(dòng)清洗5-7min，接著將毛細(xì)管浸入丙酮中上下抽動(dòng)清洗5-7min，氮?dú)鈿夥障赂稍铩?br> [0014]GPTMS (3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷)含有豐富的環(huán)氧基團(tuán)，通過修飾液處理，將GPTMS的環(huán)氧基團(tuán)固定在毛細(xì)管的內(nèi)壁。排出毛細(xì)管內(nèi)的修飾液，室溫下干燥環(huán)境中保持2-3h，是為了毛細(xì)管內(nèi)壁上固定的基團(tuán)更穩(wěn)定，以保證檢測時(shí)的穩(wěn)定性。
[0015](3)免疫層析毛細(xì)管的組裝:將作為檢測區(qū)的抗原和作為質(zhì)控區(qū)的二抗分別注入步驟(2)處理得到的毛細(xì)管的兩端，25-30°C下固定1.5-2.5 h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3-5min，重復(fù)清洗三次，l-2wt%的BSA溶液注滿毛細(xì)管，在30-37°C下反應(yīng)
1.5-2h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3-5min，重復(fù)清洗三次，干燥后獲得免疫層析毛細(xì)管。
[0016]作為檢測區(qū)的抗原是能與膠體金標(biāo)記的一抗特異性結(jié)合的抗原，作為質(zhì)控區(qū)的二抗是能與膠體金標(biāo)記的一抗特異性結(jié)合的抗體。
[0017]l_2wt9^^BSA溶液注滿毛細(xì)管，在30_37°C下反應(yīng)1.5_2h，以封閉毛細(xì)管內(nèi)壁上沒有連接蛋白的非特異性位點(diǎn)。
[0018]玻璃材質(zhì)具有很多適合作為基底的優(yōu)點(diǎn)，如廉價(jià)、表面均一光滑、無滲透、耐高溫、能承受高離子強(qiáng)度漂洗、熒光背景低和樣品使用量少等優(yōu)點(diǎn)。
[0019]本發(fā)明針對傳統(tǒng)免疫層析材料的不足和玻璃材質(zhì)自身的優(yōu)點(diǎn),利用玻璃毛細(xì)管為層析反應(yīng)器，將膠體金免疫層析檢測方法成功轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管中，建立了一種新型毛細(xì)管免疫層析方法。將二抗和抗原固定在特定區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，應(yīng)用直接競爭的方法組裝了免疫層析毛細(xì)管。[0020]作為優(yōu)選，步驟(I)中的有機(jī)溶劑為丙酮或乙醇；Κ0Η溶液濃度為0.8-1.2mol/L,HCl 溶液濃度為 0.8-1.2mol/L。
[0021]作為優(yōu)選,步驟(I)中所述piranha溶液的制備方法為:95 wt %_98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3-4:1的體積比混合，混合時(shí)將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中，不斷攪拌以保持混合液的溫度在80°C以下。
[0022]作為優(yōu)選，步驟(2)無水甲苯的制備方法為:甲苯中加入無水硫酸鈉靜置10_24h，抽濾除去無水硫酸鈉，然后加入金屬鈉絲，同時(shí)加入二苯甲酮作為指示劑，加熱回流2-3h，然后常壓蒸餾，收集111 ± I °C的餾分得無水甲苯。
[0023]作為優(yōu)選，無水硫酸鈉用量為5-10g/100mL甲苯，金屬鈉絲用量為0.5-lg/100mL甲苯，二苯甲酮用量為0.1-0.5g/100mL甲苯。
[0024]作為優(yōu)選，所述抗原為小清蛋白，二抗為羊抗兔二抗?？乖瓰樾∏宓鞍?，二抗為羊抗兔二抗是針對小清蛋白的檢測而設(shè)計(jì)的，用于與被檢測物(小清蛋白)混合的一抗:為保證檢測結(jié)果的精確和穩(wěn)定性選用單克隆抗體，可以選擇兔抗小清蛋白，鼠抗小清蛋白等，對應(yīng)的二抗可以選擇羊抗兔或者羊抗鼠、兔抗鼠等二抗。
[0025]作為優(yōu)選，小清蛋白與PBS緩沖液配制成濃度0.1-0.25 mg/mL的小清蛋白溶液后注入毛細(xì)管，羊抗兔二抗與PBS緩沖液配制成濃度0.2-0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液后注入毛細(xì)管。
[0026]作為優(yōu)選，小清蛋白溶液注入毛細(xì)管的用量為3-6 μ L，羊抗兔二抗溶液注入毛細(xì)管的用量為3-6 μ L0
[0027]本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明的前處理方法相對簡單，根據(jù)小清蛋白為熱穩(wěn)定性蛋白通過水浴加熱的途徑除去雜蛋白，獲得了純度較高的小清蛋白，降低了其他雜蛋白與抗體的交叉結(jié)合影響，提高了對實(shí)際樣品的檢測準(zhǔn)確性。
[0028]2、檢測快速可在30min內(nèi)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可通過裸眼方便觀察。
[0029]3、首次采用毛細(xì)管為免疫層析的反應(yīng)器，將質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)固定在剛性的玻璃基底上，避免了傳統(tǒng)基地材料如硝酸纖維素膜因材質(zhì)復(fù)雜而引起的拖帶、穩(wěn)定性和重復(fù)性差的缺點(diǎn)。
[0030]4、由于玻璃基底表面均一光滑、無滲透、耐高溫、能承受高離子強(qiáng)度漂洗等克服了硝酸纖維素膜、棉線、紙質(zhì)等基質(zhì)材料不穩(wěn)定性和復(fù)雜性，可以顯著地減少批間和批內(nèi)差異，使檢測靈敏度有了較大的提高。
[0031]5、以毛細(xì)管為免疫層析反應(yīng)的容器，由于其微小的管徑和可控的長度可以減少樣品的使用量，十幾微升甚至幾微升的樣品即可完成檢測。
[0032]6、使用GPTMS作為將二抗和抗原固定在毛細(xì)管內(nèi)壁上的交聯(lián)劑，由于其末端的環(huán)氧基團(tuán)提高了蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，并同時(shí)盡可能地保持了抗原抗體的活性。
[0033]7、使用毛細(xì)管作為免疫層析的反應(yīng)容器成本較低，且材質(zhì)較均一，利于較長時(shí)間儲(chǔ)藏。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明免疫層析毛細(xì)管的組裝流程圖，圖中a、毛細(xì)管的清洗；b、環(huán)氧基團(tuán)的修飾；c、抗原和二抗的固定；d、非特異位點(diǎn)的封閉。
[0035]圖2是本發(fā)明免疫層析毛細(xì)管的組裝效果。
[0036]圖3是免疫層析毛細(xì)管對小清蛋白檢測結(jié)果的掃描圖片，兩端分別為控制區(qū)和檢測區(qū)，小清蛋白的濃度為從O到IO6 ng/mL。
[0037]圖4是小清蛋白提取液的純化在不同加熱時(shí)間的凝膠電泳圖，
圖中泳道:1道:無加熱；2道:98°C，5 min水浴處理；Lane 3道:98°C，10min水浴處理；4道:98°C，15 min水浴處理；5道:98°C，25min水浴處理。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0039]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0040]1、儀器和試劑
TDL-5M臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)湘儀離心機(jī)有限公司
超聲清洗儀KQ 5200B昆山市超聲儀器有限公司
分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司
MSI Minshaker潤旋振蕩器 IKA公司
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司
自動(dòng)超純水儀(Ro DI digital)北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司
pHs-3C型pH計(jì)上海偉業(yè)儀器廠
蛋白 A 柱GE Healthare
毛細(xì)管(d=0.9mm)華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠
氯金酸(HAuC14)中國國藥集團(tuán)
兔抗小清蛋白華大蛋白提供
羊抗兔二抗北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司
3-glycidy loxypropy ltrimethoxy si lane (GPTMS) Sigma 試劑公司
BSA (牛血清白蛋白)索萊寶生物科技有限公司
三乙胺中國國藥集團(tuán)
Tris-HCLSolarbio 公司。
[0041]2、免疫層析毛細(xì)管的組裝 方法1:
(I)毛細(xì)管的處理:
piranha溶液的配制:95 wt %濃硫酸與30wt%雙氧水按照4:1的體積比混合,混合時(shí)將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中，不斷攪拌以保持混合液的溫度在80°C以下。
[0042]將毛細(xì)管迅速浸入上述熱的piranha溶液中超聲清洗15min,超純水清洗至中性，105 0C的烘箱中干燥2h，冷卻，然后將毛細(xì)管依次浸入濃度為0.8mol/L的KOH溶液(200mL)、超純水(200mL，中間更換兩次)、濃度為0.8mol/L的HCl溶液(200mL)、超純水(200mL，中間更換兩次)及丙酮(200mL)中分別超聲清洗15min，然后在105°C的烘箱中干燥Ih以上，以完全除去水分。[0043](2)毛細(xì)管的修飾:
無水甲苯的制備:300mL甲苯(分析純)中加入15 g無水硫酸鈉靜置IOh,抽濾除去無水硫酸鈉，然后加入2g金屬鈉絲，同時(shí)加入0.5g 二苯甲酮作為指示劑，將回流裝置中的空氣用氮?dú)庵脫Q，加熱回流2h，使溶液變藍(lán)；停止加熱，改為蒸餾裝置，然后常壓蒸餾，收集111±1°C的餾分得無水甲苯。
[0044]將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液，使得GPTMS的終濃度為8vol%，三乙胺的終濃度為lvol%，將步驟(I)處理所得毛細(xì)管浸沒于修飾液中室溫下干燥環(huán)境中反應(yīng)25h，排出毛細(xì)管內(nèi)的修飾液，室溫下干燥環(huán)境中保持2h，然后將毛細(xì)管浸入無水甲苯中上下抽動(dòng)清洗5min，接著將毛細(xì)管浸入丙酮中上下抽動(dòng)清洗5min，氮?dú)鈿夥障赂稍铩?br> [0045](3)免疫層析毛細(xì)管的組裝:
將作為檢測區(qū)的抗原(濃度0.lmg/mL的小清蛋白溶液，小清蛋白與PBS緩沖液(PH7.4，
0.0lmol/L)配制而成)和作為質(zhì)控區(qū)的二抗(濃度0.2mg/mL的羊抗兔二抗溶液，羊抗兔二抗與PBS緩沖液(PH7.4,0.0lmol/L)配制而成)分別注入步驟(2)處理得到的毛細(xì)管的兩端，小清蛋白溶液注入毛細(xì)管的用量為6 μ L，羊抗兔二抗溶液注入毛細(xì)管的用量為6 μ L，25°C下固定2.5h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液(PH7.4)中抽動(dòng)清洗3min，重復(fù)清洗三次，lwt%的BSA溶液(BSA與PBS緩沖液(PH7.4,0.0lmol/L)配制而成)注滿毛細(xì)管，在30°C下反應(yīng)2h,將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3min，重復(fù)清洗三次，干燥后獲得免疫層析毛細(xì)管。
[0046]方法2:
(I)毛細(xì)管的處理:
piranha溶液的配制:98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3:1的體積比混合,混合時(shí)將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中，不斷攪拌以保持混合液的溫度在80°C以下。
[0047]將毛細(xì)管迅速浸入上述熱的piranha溶液中超聲清洗20min,超純水清洗至中性，105°C的烘箱中干燥lh，冷卻，然后將毛細(xì)管依次浸入濃度為1.2mol/L的KOH溶液(200mL)、超純水(200mL，中間更換兩次)、濃度為1.2mol/L的HCl溶液(200mL)、超純水(200mL，中間更換兩次)及乙醇(200mL)中分別超聲清洗15min，然后在105°C的烘箱中干燥Ih以上，以完全除去水分。
[0048](2)毛細(xì)管的修飾:
無水甲苯的制備:300mL甲苯(分析純)中加入30 g無水硫酸鈉靜置24h，抽濾除去無水硫酸鈉，然后加入1.5g金屬鈉絲，同時(shí)加入1.5g 二苯甲酮作為指示劑，將回流裝置中的空氣用氮?dú)庵脫Q，加熱回流3h，使溶液變藍(lán)；停止加熱，改為蒸餾裝置，然后常壓蒸餾，收集111±1°C的餾分得無水甲苯。
[0049]將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液，使得GPTMS的終濃度為15vol%，三乙胺的終濃度為2vol%，將步驟(I)處理所得毛細(xì)管浸沒于修飾液中室溫下干燥環(huán)境中反應(yīng)18h，排出毛細(xì)管內(nèi)的修飾液，室溫下干燥環(huán)境中保持3h，然后將毛細(xì)管浸入無水甲苯中上下抽動(dòng)清洗7min，接著將毛細(xì)管浸入丙酮中上下抽動(dòng)清洗7min，氮?dú)鈿夥障赂稍铩?br> [0050](3)免疫層析毛細(xì)管的組裝:
將作為檢測區(qū)的抗原(濃度0.25 mg/mL的小清蛋白溶液，小清蛋白與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)和作為質(zhì)控區(qū)的二抗(濃度0.3mg/mL的羊抗兔二抗溶液,羊抗兔二抗與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)分別注入步驟(2)處理得到的毛細(xì)管的兩端，小清蛋白溶液注入毛細(xì)管的用量為3 μ L，羊抗兔二抗溶液注入毛細(xì)管的用量為3μ L，30°C下固定1.5h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液(PH7.4)中抽動(dòng)清洗5min，重復(fù)清洗三次，2wt°/c^^BSA溶液注滿毛細(xì)管，在37°C下反應(yīng)1.5h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗5min,重復(fù)清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細(xì)管。
[0051]方法3:
(I)毛細(xì)管的處理:
piranha溶液的配制:98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3:1的體積比混合,混合時(shí)將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中，不斷攪拌以保持混合液的溫度在80°C以下。
[0052]將毛細(xì)管迅速浸入上述熱的piranha溶液中超聲清洗18min,超純水清洗至中性，105°C的烘箱中干燥3h，冷卻，然后將毛細(xì)管依次浸入濃度為lmol/L的KOH溶液(200mL)、超純水(200mL，中間更換兩次)、濃度為lmol/L的HCl溶液(200mL)、超純水(200mL，中間更換兩次)及丙酮(200mL)中分別超聲清洗12min，然后在105°C的烘箱中干燥Ih以上，以完全除去水分。
[0053](2)毛細(xì)管的修飾:
無水甲苯的制備:300mL甲苯(分析純)中加入20 g無水硫酸鈉靜置18h，抽濾除去無水硫酸鈉，然后加入1.5g金屬鈉絲，同時(shí)加入Ig 二苯甲酮作為指示劑，將回流裝置中的空氣用氮?dú)庵脫Q，加熱回流2.5h，使溶液變藍(lán)；停止加熱，改為蒸餾裝置，然后常壓蒸餾，收集111±1°C的餾分得無水甲苯。
[0054]將GPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液，使得GPTMS的終濃度為10vol%，三乙胺的終濃度為1.5vol%，將步驟(1)處理所得毛細(xì)管浸沒于修飾液中室溫下干燥環(huán)境中反應(yīng)20h，排出毛細(xì)管內(nèi)的修飾液，室溫下干燥環(huán)境中保持2.5h，然后將毛細(xì)管浸入無水甲苯中上下抽動(dòng)清洗6min，接著將毛細(xì)管浸入丙酮中上下抽動(dòng)清洗6min，氮?dú)鈿夥障赂稍铩?br> [0055](3)免疫層析毛細(xì)管的組裝:
將作為檢測區(qū)的抗原(濃度0.2mg/mL的小清蛋白溶液，小清蛋白與PBS緩沖液(PH7.4，
0.01mol/L)配制而成)和作為質(zhì)控區(qū)的二抗(濃度0.3mg/mL的羊抗兔二抗溶液,羊抗兔二抗與PBS緩沖液(PH7.4,0.01mol/L)配制而成)分別注入步驟(2)處理得到的毛細(xì)管的兩端，小清蛋白溶液注入毛細(xì)管的用量為4 μ L，羊抗兔二抗溶液注入毛細(xì)管的用量為4 μ L，28°C下固定2h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液(PH7.4)中抽動(dòng)清洗4min，重復(fù)清洗三次，
1.5wt%的BSA溶液注滿毛細(xì)管，在32°C下反應(yīng)1.8h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗4min,重復(fù)清洗三次,干燥后獲得免疫層析毛細(xì)管。
[0056]毛細(xì)管的清洗、管內(nèi)壁的修飾及質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的組裝過程如圖1所示。通過piranha溶液、KOH及HCl溶液的清洗使毛細(xì)管內(nèi)壁上固定上穩(wěn)定的羥基基團(tuán)。GPTMS為毛細(xì)管內(nèi)壁連結(jié)上豐富的環(huán)氧基基團(tuán)，環(huán)氧基相比較于氨基和羧基提供更優(yōu)異的蛋白質(zhì)固定基團(tuán)，并能盡可能的保證蛋白質(zhì)的活性。GPTMS將二抗和抗原固定在特定區(qū)域作為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，BSA將沒有連結(jié)二抗、抗原的非特異性位點(diǎn)環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行封閉。至此，免疫層析毛細(xì)管的組裝過程結(jié)束，4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?[0057]免疫層析毛細(xì)管的具體組裝效果如圖2，當(dāng)金標(biāo)一抗和待檢測物同時(shí)進(jìn)入免疫層析毛細(xì)管進(jìn)行免疫反應(yīng)后，通過顏色現(xiàn)象分析其測試結(jié)果。a為固定好質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的免疫層析毛細(xì)管；b為對陰性樣品的檢測，當(dāng)進(jìn)入免疫層析毛細(xì)管的混合液中沒有待測物時(shí)，金標(biāo)一抗和檢測區(qū)上固定的抗原結(jié)合，當(dāng)?shù)竭_(dá)質(zhì)控區(qū)時(shí)同樣和管壁上的二抗結(jié)合，因此可以同時(shí)在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)看到由于金標(biāo)一抗聚集呈現(xiàn)兩條紅色；c為對陽性樣品的檢測，由于待測樣品中的抗原與免疫層析毛細(xì)管檢測區(qū)上固定的抗原與金標(biāo)一抗發(fā)生競爭性結(jié)合，因此金標(biāo)一抗就無法或者只有少量能結(jié)合到檢測區(qū)上固定的抗原，因此，檢測區(qū)的顏色相對質(zhì)控區(qū)明顯減弱或者完全沒有顏色，只出現(xiàn)金標(biāo)一抗聚集在質(zhì)控區(qū)的一條紅色區(qū)域。
[0058]3、毛細(xì)管檢測條件的優(yōu)化
設(shè)置了一系列的環(huán)氧基硅烷(GPTMS)修飾時(shí)間實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明隨著固定時(shí)間的延長，免疫反應(yīng)后顯色逐漸加深，當(dāng)固定時(shí)間超過18h后顯色深度逐漸不發(fā)生變化，且隨著時(shí)間的增長管內(nèi)壁上開始出現(xiàn)固定不均勻的情況，因此修飾時(shí)間確定為18h-25h。
[0059]對修飾液的比例進(jìn)行選擇，將GPTMS配置成一系列濃度的混合液(5 vol %_25 vol%)，把前處理過的毛細(xì)管浸入此混合液中固定18h。免疫反應(yīng)后可以觀察到當(dāng)GPTMS的濃度達(dá)到8V01%-15V01%后，隨著GPTMS濃度的增大，顏色深度將不再增加。因此，在本發(fā)明中GPTMS 的濃度選為 8vol%-15vol%。
[0060]封閉液和封閉時(shí)間的選擇，配置成一系列濃度的BSA溶液(0.5%, 1%, 1.5%, 2%,
2.5%，3%，4%，5%)，對固定有質(zhì)控區(qū)、檢測區(qū)的毛細(xì)管進(jìn)行不同時(shí)間的封閉:lh，1.5h, 2h,
2.5h, 3h。以質(zhì)控區(qū)和陰性樣品的檢測區(qū)邊界清晰，對陽性檢測完全沒有顏色為標(biāo)準(zhǔn)，最終選擇的封閉液的濃度為1%_2%，封閉時(shí)間為1.5-2h。
[0061]質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)固定二抗和抗原濃度的選擇:將二抗和抗原的濃度分別稀釋為
0.1-0.5 mg/mL，檢測陰性樣品時(shí)質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的顏色基本相同，陽性樣品時(shí)檢測區(qū)完全沒有顏色，同時(shí)保證兩者的用量最小及盡量低的檢測限。經(jīng)過優(yōu)化后固定二抗的濃度約為
0.2-0.3 mg/mL,抗原的濃度約為 0.1-0.25 mg/mL。
[0062]將制備好的免疫層析毛細(xì)管用于陰性樣品的檢測，在反應(yīng)之初質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的顏色隨著顯色時(shí)間的增加而加深，4min后顏色的深淺基本上不發(fā)生變化，說明金標(biāo)一抗已穩(wěn)定結(jié)合在管壁上，因此顯色時(shí)間為4min。
[0063]4、對小清蛋白的檢測
4.1膠體金標(biāo)記的一抗(金標(biāo)一抗)的制備
膠體金的制備:將實(shí)驗(yàn)中用到的玻璃儀器和轉(zhuǎn)子等在新配置的王水(HCl =HNO3 = 3:1)中至少浸泡15min，然后依次用大量的去離子水沖洗干凈，100°C以上干燥。向雙頸瓶中加Λ IOOmL ImM HAuCl4，在冷凝條件下使用磁力攪拌器攪拌下均勻加熱。充分沸騰后，快速加Λ 10mL38.8mM檸檬酸鈉溶液，溶液的顏色會(huì)發(fā)生快速的變化，其順序應(yīng)為:淡黃色一無色—黑色一紫色一深紅色。繼續(xù)加熱回流15-20min后停止加熱，持續(xù)攪拌使反應(yīng)系統(tǒng)自然冷卻至室溫。將冷卻好的溶液過孔徑為0.45 μ m的醋酸濾膜。制備好的納米金溶液4°C條件下避光保存。
[0064]膠體金標(biāo)記的一抗的制備:使用蛋白A柱對兔抗小清蛋白(一抗)進(jìn)行純化，3000g離心15min除去沉淀。0.1M的KfO3將上述納米金溶液調(diào)至pH 8.2，緩慢加入兔抗小清蛋白至終濃度為20 μ g/mL,緩慢均勻攪拌2h，接下來加入10wt% BSA至終濃度為I wt %，以及I wt %的聚乙二醇(PEG20000)至最終體積的1/10，繼續(xù)攪拌30min封閉納米金粒子上的非特異性位點(diǎn)。然后2500 g離心15 min除去聚集的沉淀，10000 g離心Ih收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于PH8.2的含有l(wèi)wt% BSA和0.02 wt % NaN3的Tris-HCl緩沖液，復(fù)溶至原體積(納米金溶液的體積)的1/10得金標(biāo)兔抗小清蛋白(膠體金標(biāo)記的一抗)，4°C保存。
[0065]4.2 檢測 實(shí)施例1
一、待測樣品處理:將魚肉(從佳世客超市(青島)中購買的大菱鲆)與Tris-HCl (pH7.5)按照1:2 (w/v)的比例混合勻漿，將勻漿后的樣品過濾后，95°C下水浴加熱25min，3800g離心5min，收集上清液(提取的小清蛋白)為作為測試樣品。
[0066]二、樣品檢測:將4.1節(jié)制備的膠體金標(biāo)記的一抗(金標(biāo)兔抗小清蛋白)與測試樣品按1:1的體積比混合均勻得混合液，取5yL混合液注入免疫層析毛細(xì)管的檢測區(qū)端，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)流經(jīng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的混合液排出免疫層析毛細(xì)管，然后免疫層析毛細(xì)管浸入在PBST緩沖液(PH7.4)中抽動(dòng)清洗3min，最后通過裸眼定性獲得檢測結(jié)果。
[0067]實(shí)施例2
一、待測樣品處理:將魚肉(從佳世客超市(青島)中購買的大菱鲆)與Tris-HCl (pH
7.5)按照1: 3 (w/v)的比例混合勻衆(zhòng),將勻衆(zhòng)后的樣品過濾后，100°C下水浴加熱5min,3800g離心5min，收集上清液(提取的小清蛋白)為作為測試樣品。
[0068]二、樣品檢測:將4.1節(jié)制備的膠體金標(biāo)記的一抗(金標(biāo)兔抗小清蛋白)與測試樣品按1:1.5的體積比混合均勻得混合液，取15 μ L混合液注入免疫層析毛細(xì)管的檢測區(qū)端，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)流經(jīng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的混合液排出免疫層析毛細(xì)管，然后免疫層析毛細(xì)管浸入在PBST緩沖液(PH7.4)中抽動(dòng)清洗5min，最后通過裸眼定性獲得檢測結(jié)果。
[0069]實(shí)施例3
一、待測樣品處理:將魚肉(從佳世客超市(青島)中購買的大菱鲆)與Tris-HCl (pH
7.5)按照1:2 (w/v)的比例混合勻漿，將勻漿后的樣品過濾后，98°C下水浴加熱lOmin，3800g離心5min，收集上清液(提取的小清蛋白)為作為測試樣品。
[0070]二、樣品檢測:將4.1節(jié)制備的膠體金標(biāo)記的一抗(金標(biāo)兔抗小清蛋白)與測試樣品按1:1的體積比混合均勻得混合液，取10 μ L混合液注入免疫層析毛細(xì)管的檢測區(qū)端，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)流經(jīng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的混合液排出免疫層析毛細(xì)管，然后免疫層析毛細(xì)管浸入在PBST緩沖液(PH7.4)中抽動(dòng)清洗4min，最后通過裸眼定性獲得檢測結(jié)果。
[0071]免疫反應(yīng)后通過觀察質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)的顏色判定結(jié)果。當(dāng)兩部分均呈現(xiàn)紅色且顏色幾乎相同時(shí)為陰性結(jié)果；只有質(zhì)控區(qū)呈現(xiàn)紅色，檢測區(qū)為無色或者是檢測區(qū)的顏色比質(zhì)控區(qū)淺時(shí)為陽性結(jié)果；質(zhì)控區(qū)未呈現(xiàn)紅色的免疫層析毛細(xì)管為失效。
[0072]4.3不同濃度小清蛋白的檢測分析
將魚肉(從佳世客超市(青島)中購買的大菱鲆)與Tris-HCl (pH 7.5)按照1:2 (w/V)的比例混合勻漿，將勻漿后的樣品過濾后，98°C下水浴加熱5min，3800g離心5min，收集上清液即為提取的小清蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法(現(xiàn)有常規(guī)方法)測定小清蛋白的濃度，然后用PBS ( PH7.4,0.0lmol/L)將小清蛋白配置成一系列濃度梯度的溶液，金標(biāo)兔抗小清蛋白(膠體金標(biāo)記的一抗)與不同濃度的小清蛋白溶液按1:1的體積比混合混勻，取5μ L的前述混合液從檢測區(qū)端注入免疫層析毛細(xì)管，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)流經(jīng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的混合液排出毛細(xì)管，然后用PBST (pH7.4)注滿全管后甩出清洗，重復(fù)此清洗步驟三次，觀察顯色情況。其結(jié)果如圖3所示，當(dāng)小清蛋白的濃度升高至70ng/mL時(shí)檢測區(qū)的顏色開始明顯淺于質(zhì)控區(qū)的顏色，當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí)顏色越來越淺，因此本發(fā)明的免疫層析毛細(xì)管的視覺檢測限為70ng/mL，即當(dāng)小清蛋白的濃度高于70ng/mL檢測區(qū)的顏色明顯淺于質(zhì)控區(qū)或檢測區(qū)無顏色為陽性，反之為陰性。此檢測限顯著低于對魚過敏的消費(fèi)者的最低預(yù)期值5 mg/kg。
[0073]4.4毛細(xì)層析管的穩(wěn)定性和重復(fù)性
將同一批次制備的毛細(xì)層析管4 1:條件下分別儲(chǔ)存2，4，8天，和2，4周，進(jìn)行陰性樣本檢測，其檢測區(qū)和控制區(qū)的顏色均沒有明顯變化，說明儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。原因可能是由于玻璃毛細(xì)管可以有效的保護(hù)檢測區(qū)不被環(huán)境的溫度、濕度、氧氣和光線所破壞。小清蛋白通過環(huán)氧基團(tuán)共價(jià)固定在檢測區(qū)，此共價(jià)結(jié)合力明顯牢固于傳統(tǒng)的電子吸引力和疏水作用力，因此增強(qiáng)了檢測的穩(wěn)定性。
[0074]5、實(shí)際樣品的檢測驗(yàn)證
大菱鲆被選作研究對象以檢測本發(fā)明的方法對小清蛋白的實(shí)際檢測性能。將魚肉(從佳世客超市(青島)中購買的大菱鲆)與Tris-HCl (pH 7.5)按照1:2 (w/v)的比例混合勻漿，將勻漿后的樣品過濾后，98°C下水浴加熱5min，3800g離心5min，收集上清液即為提取純化的小清蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法(現(xiàn)有常規(guī)方法)測定小清蛋白的濃度，小清蛋白濃度為2.19 mg/mL。
[0075]小清蛋白是一種熱穩(wěn)定蛋白，且抗體結(jié)合能力不會(huì)隨著熱處理而降低。通過對勻漿、過濾后的樣品進(jìn)行98°C水浴加熱5-25min以純化小清蛋白，將小清蛋白濃度調(diào)至Img/mL, SDS-PAGE用來表征其小清蛋白的純化結(jié)果(見圖4)，其結(jié)果證明經(jīng)過5min的加熱雜蛋白幾乎全部出去。
[0076]本發(fā)明的方法用于檢測由大菱鲆中提取純化的不同濃度的小清蛋白，用PBS對提取純化后的小清蛋白進(jìn)行6個(gè)10倍梯度稀釋，然后用本發(fā)明的方法定性檢測，結(jié)果見表1，結(jié)果所示前4個(gè)稀釋梯度均呈現(xiàn)陽性，至第5個(gè)稀釋梯度時(shí)檢測結(jié)果呈現(xiàn)陰性，此時(shí)小清蛋白的濃度為219 ng/mL，與接近于在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的視覺檢測限70 ng/mL。
[0077]表1本發(fā)明的方法檢測大菱鲆中不同稀釋濃度的小清蛋白
【權(quán)利要求】
1.一種水產(chǎn)品中小清蛋白的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: 一、待測樣品處理:將魚肉與TriS-HCl按照1:2-3(w/v)的比例混合勻漿，將勻漿后的樣品過濾后，95-100°C下水浴加熱5-25min，離心，收集上清液為作為測試樣品； 二、樣品檢測:將膠體金標(biāo)記的一抗與測試樣品按1:1-1.5的體積比混合均勻得混合液，取5-15 μ L混合液注入免疫層析毛細(xì)管的檢測區(qū)端，靜置4min后用移液器推動(dòng)混合液向下移動(dòng)至免疫層析毛細(xì)管的質(zhì)控區(qū)，同樣在此區(qū)停留4min，將多余的混合液排出免疫層析毛細(xì)管，然后免疫層析毛細(xì)管浸入在PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3-5min，最后通過裸眼定性獲得檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:所述一抗為兔抗小清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:所述免疫層析毛細(xì)管的組裝方法包括如下步驟: (1)毛細(xì)管的處理:將毛細(xì)管浸入Piranha溶液中超聲清洗15_20min，超純水清洗至中性，干燥，冷卻，然后將毛細(xì)管依次浸入KOH溶液、超純水、HCl溶液、超純水及有機(jī)溶劑中分別超聲清洗10-15min，然后 烘干； (2)毛細(xì)管的修飾JfGPTMS和三乙胺溶于無水甲苯中得修飾液，使得GPTMS的終濃度為8V01%-15V01%，三乙胺的終濃度為1V01%-2V01%，將步驟(1)處理所得毛細(xì)管浸沒于修飾液中室溫下干燥環(huán)境中反應(yīng)18h-25h，排出毛細(xì)管內(nèi)的修飾液，室溫下干燥環(huán)境中保持2_3h，然后將毛細(xì)管浸入無水甲苯中上下抽動(dòng)清洗5-7min，接著將毛細(xì)管浸入丙酮中上下抽動(dòng)清洗5-7min，氮?dú)鈿夥障赂稍铮? (3)免疫層析毛細(xì)管的組裝:將作為檢測區(qū)的抗原和作為質(zhì)控區(qū)的二抗分別注入步驟(2)處理得到的毛細(xì)管的兩端，25-30°C下固定1.5-2.5 h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3-5min，重復(fù)清洗三次，l-2wt%的BSA溶液注滿毛細(xì)管，在30_37°C下反應(yīng)1.5-2h，將毛細(xì)管浸入于PBST緩沖液中抽動(dòng)清洗3-5min，重復(fù)清洗三次，干燥后獲得免疫層析毛細(xì)管。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:步驟(1)中的有機(jī)溶劑為丙酮或乙醇；Κ0Η溶液濃度為0.8-1.2mol/L, HCl溶液濃度為0.8-1.2mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:步驟(1)中所述piranha溶液的制備方法為:95 wt %_98wt%濃硫酸與30wt%雙氧水按照3-4:1的體積比混合，混合時(shí)將雙氧水溶液緩慢加入濃硫酸中，不斷攪拌以保持混合液的溫度在80°C以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:步驟(2)無水甲苯的制備方法為:甲苯中加入無水硫酸鈉靜置10_24h，抽濾除去無水硫酸鈉，然后加入金屬鈉絲，同時(shí)加入二苯甲酮作為指示劑，加熱回流2-3h，然后常壓蒸餾，收集111 土 1°C的餾分得無水甲苯。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:無水硫酸鈉用量為5-10g/100mL甲苯，金屬鈉絲用量為0.5-lg/100mL甲苯，二苯甲酮用量為0.1-0.5g/100mL 甲苯。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:所述抗原為小清蛋白，二抗為羊抗兔二抗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:小清蛋白與PBS緩沖液配制成濃度0.1-0.25 mg/mL的小清蛋白溶液后注入毛細(xì)管，羊抗兔二抗與PBS緩沖液配制成濃度0.2-0.3 mg/mL的羊抗兔二抗溶液后注入毛細(xì)管。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的毛細(xì)管免疫層析快速檢測方法，其特征在于:小清蛋白溶液注入毛細(xì)管的用量為3 -6 μ L，羊抗兔二抗溶液注入毛細(xì)管的用量為3-6 μ L。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103983749SQ201410112702
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】林洪, 杜淑媛, 曹立民, 隋建新, 王靜雪 申請人:中國海洋大學(xué)